同一患者不同部位分離耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制研究及同源性分析

胡詠梅，鄒明祥，李軍，豆清婭，王海晨，晏群，劉文恩

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院a.檢驗(yàn)科，b.醫(yī)院感染控制中心，長沙 410008)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

同一患者不同部位分離耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制研究及同源性分析

胡詠梅a，鄒明祥a，李軍a，豆清婭b，王海晨a，晏群a，劉文恩a

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院a.檢驗(yàn)科，b.醫(yī)院感染控制中心，長沙 410008)

目的 對(duì)臨床分離自同一患者不同部位的3株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌進(jìn)行耐藥機(jī)制研究及同源性分析。方法 對(duì)某嚴(yán)重?zé)齻颊叩墓伸o脈導(dǎo)管尖端、創(chuàng)面分泌物及痰液標(biāo)本中分離到的3株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，采用改良Hodge試驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯酶，雙紙片協(xié)同及增效試驗(yàn)檢測(cè)金屬β-內(nèi)酰胺酶；PCR篩查耐藥基因；腸桿菌科基因間重復(fù)序列-聚合酶鏈反應(yīng)(ERIC-PCR)進(jìn)行同源性分析，多位點(diǎn)序列分型技術(shù)(MLST)對(duì)肺炎克雷伯菌進(jìn)行分子生物學(xué)分型。結(jié)果 3株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的改良Hodge試驗(yàn)均為陰性，雙紙片協(xié)同及增效試驗(yàn)均為陽性；3株菌均檢出blaNDM-1基因，而未檢出blaKPC、blaGES、blaIMP、blaSPM、blaVIM、blaGIM及blaOXA-48等耐藥基因；ERIC-PCR顯示3株菌為同一型別，MLST分型結(jié)果顯示3株菌均屬于ST17型。結(jié)論 3株肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機(jī)制為攜帶blaNDM-1基因，且這3株菌為同一克隆。

多部位感染；肺炎克雷伯菌；新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶Ⅰ型；多位點(diǎn)序列分型

近年來，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌不斷出現(xiàn)，尤其是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌在全球出現(xiàn)并廣泛流行，使臨床抗感染治療面臨極大的挑戰(zhàn)。本研究收集2014年從1例嚴(yán)重?zé)齻颊叩墓伸o脈導(dǎo)管尖端、創(chuàng)面分泌物及痰液3種標(biāo)本中分離到的3株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，對(duì)其耐藥機(jī)制和同源性進(jìn)行分析，以期為臨床抗感染治療以及預(yù)防其傳播提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2014年從我院燒傷科1例嚴(yán)重?zé)齻颊叩墓伸o脈導(dǎo)管尖端、創(chuàng)面分泌物及痰液3種標(biāo)本中分離到3株對(duì)亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌，檢出時(shí)間分別為3月8日、3月17日及4月1日，按照時(shí)間序列分別標(biāo)記為KP1、KP2和 KP3。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922及肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705/1706。

1.2 主要試劑與儀器 藥敏紙片(英國Oxoid公司)，亞胺培南、美羅培南及氨曲南的E-test試劑條

(鄭州安圖生物公司)，引物及5×TBE電泳緩沖液(上海生工公司)，DNA marker D2000(大連寶生物公司)，2×Taq PCR Master Mix試劑(北京百泰克公司)；Vitek 2 Compact(法國生物梅里埃公司)，ABI 2720 PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)，高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，Hoefer PS2A200水平電泳儀(美國Hoefer公司)，InGenius凝膠成像分析系統(tǒng)(英國Syngene公司)。

1.3 藥敏試驗(yàn) 用K-B法測(cè)定10種抗菌藥物的抑菌圈直徑；E-test法測(cè)定亞胺培南、美羅培南和氨曲南的最小抑菌濃度(MIC)，結(jié)果根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2016版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

1.4 改良Hodge試驗(yàn)篩查碳青霉烯酶 按照CLSI 2016版操作規(guī)程進(jìn)行試驗(yàn)。若待測(cè)菌劃線與抑菌圈邊緣交叉處有矢狀生長則為陽性。分別以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705/1706作為陽性和陰性質(zhì)控菌株。

1.5 雙紙片協(xié)同試驗(yàn)及雙紙片增效試驗(yàn)檢測(cè)金屬β-內(nèi)酰胺酶 將0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏拇郎y(cè)菌菌液涂布于M-H平板，分別粘貼EDTA紙片(0.5 mol/L EDTA 5 μL)、亞胺培南紙片(10 μg)和亞胺培南紙片(10 μg)+EDTA(0.5 mol/L EDTA 5 μL)組合紙片，35 ℃過夜培養(yǎng)[1]。若亞胺培南抑菌圈在靠近EDTA側(cè)出現(xiàn)匙孔或抑菌圈明顯擴(kuò)大(雙紙片協(xié)同試驗(yàn))或組合紙片與亞胺培南紙片的抑菌圈直徑相差≥6 mm(雙紙片增效試驗(yàn))則為陽性。

1.6 耐藥基因篩查 根據(jù)文獻(xiàn)[1-3]設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，無菌雙蒸水8.5 μL。 PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度(見表1)30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后再72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海鉑尚公司測(cè)序，序列經(jīng)BLAST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析。

表1 碳青霉烯酶基因檢測(cè)所用引物

1.7 ERIC-PCR DNA指紋圖譜分析 根據(jù)文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)引物，ERIC-2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGT

GAGCG-3′。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、10 μmol/L引物1 μL、DNA模板2 μL、無菌雙蒸水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸3 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察及拍照分析。凡條帶數(shù)目和位置完全相同者，則判為同一克隆型。

1.8 多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing, MLST) 選取7個(gè)管家基因(gapA、mdh、pgi、phoE、infB、rpoB、tonB)構(gòu)建肺炎克雷伯菌的MLST研究方案，管家基因的引物序列及PCR反應(yīng)條件參照http://bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html，PCR反應(yīng)體系見1.6。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海鉑尚公司測(cè)序，將測(cè)序后結(jié)果與MLST數(shù)據(jù)庫(http://bigsdb.web.pasteur.fr/)進(jìn)行比對(duì)得出序列型別。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，3株細(xì)菌對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和復(fù)方磺胺甲噁唑均耐藥，但是其中KP1菌株對(duì)慶大霉素、妥布霉素及阿米卡星敏感，而KP2和KP3對(duì)慶大霉素和妥布霉素耐藥，僅對(duì)阿米卡星敏感；3株菌對(duì)亞胺培南、美羅培南及氨曲南均耐藥。

2.2 碳青霉烯酶篩查及金屬酶表型結(jié)果 3株肺炎克雷伯菌經(jīng)改良Hodge試驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯酶，結(jié)果均為陰性；雙紙片協(xié)同及增效試驗(yàn)檢測(cè)金屬β-內(nèi)酰胺酶，結(jié)果均為陽性。

2.3 耐藥基因檢測(cè) 3株細(xì)菌均攜帶blaNDM-1基因，未檢出blaKPC、blaGES、blaIMP、blaSPM、blaVIM、blaGIM及blaOXA-487種耐藥基因。見圖1。

注：M，DNA marker；KP1～KP3，待測(cè)菌株。

圖1 3株肺炎克雷伯菌blaNDM-1基因的PCR電泳

2.4 ERIC-PCR指紋圖譜 ERIC-PCR結(jié)果顯示，KP1、KP2和KP3具有完全相同的DNA指紋圖譜，屬于同一克隆型。見圖2。

2.5 多位點(diǎn)序列分析結(jié)果 通過對(duì)7個(gè)管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與MLST數(shù)據(jù)庫內(nèi)已有的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示：3株肺炎克雷伯菌均為ST17型。

注：M，DNA marker；KP1～KP3，待測(cè)菌株。

圖2 3株肺炎克雷伯菌的ERIC-PCR指紋圖譜

3 討論

細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥是多種機(jī)制共同參與的結(jié)果，其中最主要的原因是產(chǎn)碳青霉烯酶。本研究對(duì)某患者不同部位分離的3株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌進(jìn)行8種碳青霉烯酶基因檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3株待測(cè)菌均攜帶blaNDM-1基因，而其他7種耐藥基因包括肺炎克雷伯菌中最常見的blaKPC基因均未檢出，說明產(chǎn)NDM-1型碳青霉烯酶是這3株細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥最主要的機(jī)制。從病史資料來看，患者全身總燒傷面積達(dá)97%，機(jī)體免疫力低下，且全身存在多處插管，可引起患者全身多處感染。有學(xué)者認(rèn)為，抗生素的使用尤其是不合理使用是NDM-1酶出現(xiàn)的首要原因。該患者自入院以來，長期使用多種抗生素，包括左氧氟沙星、頭孢他啶、美羅培南、亞胺培南、阿米卡星、萬古霉素、替加環(huán)素及各種抗真菌藥等，在抗生素選擇壓力下可能篩選出該耐藥菌株?，F(xiàn)有研究表明，NDM-1一般不水解氨曲南等單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素，然而超過80%的產(chǎn)NDM-1的細(xì)菌同時(shí)攜帶其他可以水解氨曲南的耐藥基因，如CTX-M或CMY類ESBLs，從而導(dǎo)致其對(duì)氨曲南耐藥[5]。本研究中的3株菌對(duì)氨曲南均耐藥，可能與這一機(jī)制相關(guān)。另外，比較這3株菌的藥敏結(jié)果，發(fā)現(xiàn)慶大霉素和妥布霉素從開始的敏感變?yōu)槟退?，查閱病史資料，發(fā)現(xiàn)患者從入院開始到檢出KP1之間間斷使用氨基糖苷類抗生素抗感染，推測(cè)其耐藥原因可能是抗生素使用導(dǎo)致，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。有資料顯示，相比于阿米卡星，慶大霉素及妥布霉素更易出現(xiàn)耐藥[6]。

這3株攜帶blaNDM-1基因細(xì)菌的金屬酶表型篩查均為陽性，但是改良Hodge試驗(yàn)均為陰性。文獻(xiàn)報(bào)道，改良Hodge試驗(yàn)對(duì)KPC和OXA-48型碳青霉烯酶檢測(cè)敏感性高，但對(duì)NDM型酶的檢測(cè)敏感性低，從而易出現(xiàn)假陰性[7]。這可能是本研究中改良Hodge試驗(yàn)均為陰性的原因。

通過ERIC-PCR分型技術(shù)對(duì)3株細(xì)菌的同源性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3株菌屬于同一型別，表明該患者是全身多部位的產(chǎn)NDM-1酶肺炎克雷伯菌感染。同時(shí)，將本研究的測(cè)序結(jié)果與MLST數(shù)據(jù)庫內(nèi)已建立的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析，3株肺炎克雷伯菌均為ST17，進(jìn)一步證實(shí)3株菌屬于同一克隆型，說明該患者3個(gè)不同部位分離的肺炎克雷伯菌具有相同的同源性。由于該類菌株具有嚴(yán)重的耐藥性和傳播能力，應(yīng)引起臨床高度重視。做好細(xì)菌耐藥及院內(nèi)感染防控工作，提高抗生素合理使用水平，加強(qiáng)攜帶blaNDM-1基因細(xì)菌的監(jiān)測(cè)，一旦發(fā)現(xiàn)疑似或確診產(chǎn)NDM-1酶細(xì)菌感染或定植患者應(yīng)予以隔離，以預(yù)防耐藥菌廣泛傳播。

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(本文編輯：周萬青，劉群)

Drug resistant mechanism and homology analysis of carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaeisolated from different sites of one patient

HUYong-meia,ZOUMing-xianga,LIJuna,DOUQing-yab,WANGHai-chena,YANQuna,LIUWen-ena

(a.DepartmentofClinicalLaboratory,b.InfectionControlCenter,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,Hunan,China)

Objective To investigate the drug resistant mechanism and homology of three strains of carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae(K.pneumoniae) isolated from different sites of one patient. Methods Three strains of carbapenem-resistantK.pneumoniaewere isolated from femoral vein catheter tip, wound secretions and sputum of a patient with severe burns, respectively. Their carbapenemase, metallo-β-lactamase (MBL) and drug resistance genes were detected by modified Hodge test, double-disk synergy test and combination disk diffusion and PCR, respectively, and homology and biological typing were analyzed by enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR (ERIC-PCR) assay and multilocus sequence typing (MLST) technology, respectively. Results The carbapenemase and MBL of three strains of carbapenem-resistantK.pneumoniaewere negative and positive, respectively. TheblaNDM-1gene was identified from the three strains, but other drug resistance genes such asblaKPC,blaGES,blaIMP,blaSPM,blaVIM,blaGIMandblaOXA-48were not detected. ERIC-PCR showed that three isolates belonged to the same genotype, and MLST showed that they were type ST17. Conclusion CarringblaNDM-1gene is the main cause leading to the drug resistance of three strains of carbapenem-resistantK.pneumoniae, and they belong to the same genotype.

multiple-site infection;Klebsiellapneumoniae; New Delhi metallo-β-lactamase-1; multilocus sequence typing

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.08

湖南省發(fā)改委(湘發(fā)改高技[2012]1493號(hào)；湘發(fā)改投資[2014]658號(hào))；湖南省自然科學(xué)基金(14JJ7003)。

胡詠梅，1989年生，女，技師，碩士，主要從事細(xì)菌耐藥檢測(cè)及耐藥機(jī)制研究。

鄒明祥，主任技師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：zoumingxiang@126.com。

R446.5

A

2017-05-20)