瘦素對局灶性腦缺血后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的作用☆

胡詩俊彭定天譚靜梁志堅(jiān)陽禮程道賓

·論 著·

瘦素對局灶性腦缺血后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的作用☆

胡詩俊*彭定天*譚靜*梁志堅(jiān)*陽禮*程道賓*

目的探討瘦素對大鼠局灶性腦缺血后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響。方法SD大鼠40只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血組、腦缺血瘦素預(yù)處理組，線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型，在閉塞血管前3 h皮下注射瘦素，于閉塞血管6 h后采用Longa 5分制量表進(jìn)行神經(jīng)功能評分、稱量體重及腦水腫變化，并灌注取腦，采用免疫熒光化學(xué)法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucoseregulated protein 78,GRP78）及C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein,CHOP）表達(dá)。結(jié)果腦缺血瘦素預(yù)處理組和腦缺血組體重變化未見差異（P＞0.05）；腦缺血瘦素預(yù)處理組神經(jīng)功能評分（1.90±0.31 vs.2.50±0.52,P＜0.05）和腦水腫程度（3.60±0.52 vs.7.70±0.94,P＜0.001）明顯輕于腦缺血組，同時腦缺血瘦素預(yù)處理組GRP78表達(dá)明顯高于腦缺血組（48.69±5.06 vs.35.78±4.35,P＜0.01），CHOP表達(dá)明顯低于腦缺血組（38.81±5.34 vs.60.24±4.11,P＜0.01）。結(jié)論瘦素可減少神經(jīng)功能缺損并可能與其上調(diào)GRP78蛋白，下調(diào)CHOP蛋白來減弱腦缺血導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

瘦素 局灶性腦缺血 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 C/EBP同源蛋白

近年來，有多篇文獻(xiàn)報道瘦素可作為缺血性腦血管病的一個潛在的治療藥物，為腦卒中的治療提供了另一種可能的選擇[1-3]。GRP78和CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的兩個經(jīng)典標(biāo)志蛋白,目前認(rèn)為GRP78表達(dá)上調(diào)對細(xì)胞起保護(hù)作用，而CHOP表達(dá)上調(diào)則啟動細(xì)胞凋亡途徑[4]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建MCAO模型探討瘦素對腦缺血內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78和CHOP表達(dá)的影響，以進(jìn)一步研究瘦素的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備成年雄性SD大鼠由我校實(shí)驗(yàn)動物中心提供，所有實(shí)驗(yàn)步驟經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)并在實(shí)驗(yàn)過程中并嚴(yán)格遵守相關(guān)規(guī)程。實(shí)驗(yàn)大鼠在實(shí)驗(yàn)開始之前12 h開始禁食,可以隨意飲水。

本實(shí)驗(yàn)MCAO模型采用線栓法[5]制作。假手術(shù)組采用同樣的手術(shù)操作但不插入線栓。手術(shù)過程在有保溫墊的動物手術(shù)操作臺上進(jìn)行，維持SD大鼠肛溫在（37.0±0.5）℃。

1.2 動物分組40只雄性SD大鼠（250 g～280 g）按隨機(jī)分配原則隨機(jī)分配至3個實(shí)驗(yàn)組，分別為腦缺血瘦素預(yù)處理組（n=15）：皮下注射瘦素（1 mg/kg）（美國PeproTech公司）的MCAO模型SD大鼠（n= 15）；腦缺血組：皮下注射生理鹽水（1 mg/kg）的MCAO模型SD大鼠；假手術(shù)組（n=10）：皮下注射生理鹽水（1 mg/kg）的假手術(shù)組SD大鼠。所有分組藥物注射時間為實(shí)驗(yàn)前3 h。

1.3 神經(jīng)功能評分參考LONGA[5]的5分制法在術(shù)后6 h進(jìn)行神經(jīng)功能評定：0分為無神經(jīng)損傷癥狀。1分為輕度局灶性神經(jīng)功能缺失（癱瘓側(cè)前/后肢不能完全伸展）；2分為中度局灶性神經(jīng)功能缺失（向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈）；3分為重度神經(jīng)功能缺失（爬行時向癱瘓側(cè)傾倒）；4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后死亡大鼠；蛛網(wǎng)膜下腔出血、大腦中動脈起始部或其附近的willis環(huán)動脈有凝血塊的大鼠；栓線插入深度不足18 mm，且無明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)或癥狀很輕的大鼠。

1.4 腦水腫和體重評估在MCAO手術(shù)開始前和大腦中動脈閉塞6 h后分別測定大鼠體質(zhì)量，體質(zhì)量變化的數(shù)據(jù)表現(xiàn)為：術(shù)前體重-閉塞6 h體質(zhì)量。在閉塞大腦中動脈6 h的后，將大鼠深麻醉并快速取出大腦，并立即將大腦分為左、右半球，剔除小腦和腦干。將分離出的兩側(cè)大腦半球在精密電子天平上稱量。腦水腫程度的數(shù)據(jù)表現(xiàn)為：腦水腫=受損的同側(cè)半球體質(zhì)量-對側(cè)半球質(zhì)量[6]。

1.5 組織切片標(biāo)本制備各組大鼠在腦缺血6 h后腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）深麻醉,沿劍突下打開胸腔，從心尖處向主動脈弓插管，并剪開右心耳，先用無菌生理鹽水約500 mL灌注沖洗至流出生理鹽水顏色澄清，換用4%的多聚甲醛500 mL灌注至全身僵硬，取腦置于4%的多聚甲醛液中，4℃固定24 h，常規(guī)脫水蠟塊包埋后經(jīng)組織切片機(jī)（德國Leica公司）在前囟位置（既腦梗死部位）做冠狀連續(xù)切片，片厚2～5 μm，腦片置于-20℃冰箱保存。

1.6 免疫熒光染色石蠟切片標(biāo)本經(jīng)0.5%Triton孵育、山羊血清封閉后，滴加適當(dāng)稀釋的一抗：GRP78抗體（稀釋濃度約為1：150）（英國Abcam公司），CHOP抗體 （稀釋濃度為1：100） （英國Abcam公司），4℃過夜，PBS浸洗 3次后滴加FITC標(biāo)記熒光二抗 （稀釋濃度為1：250） （美國santa cruz公司），避光孵育1 h后PBS浸洗3次，DAPI復(fù)染胞核（中國Solarbio公司），室溫保濕避光孵育15 min。PBS浸洗3次，取適量緩沖甘油封片。對照試驗(yàn)用PBS代替一抗。熒光顯微鏡下觀察免疫反應(yīng)熒光強(qiáng)度。后期圖像分析采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司）。每只大鼠標(biāo)本取5張切片，每個切片隨機(jī)抽取4個視野后計(jì)算并且進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.7 圖片采集圖像采集采用OLYMPUS BX53熒光顯微鏡,對免疫熒光組織切片進(jìn)行采集，400×倍光鏡觀察各組免疫熒光反應(yīng)強(qiáng)度，并采集圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果描述為（±s）。神經(jīng)功能缺陷評分采用Mann-Whitney U分析。兩組間計(jì)量資料比較采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺陷由于假手術(shù)組并沒有出現(xiàn)神經(jīng)功能缺陷，所以沒有對假手術(shù)組進(jìn)行比較。在遭受大腦局灶缺血6 h后，腦缺血瘦素預(yù)處理組和腦缺血組都出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺陷。結(jié)果表明腦缺血瘦素預(yù)處理組的神經(jīng)功能缺陷評分顯著低于腦缺血組 （P＜0.05），說明瘦素可改善急性腦卒中引起的神經(jīng)功能缺陷（表1）。

2.2 腦水腫程度由于假手術(shù)組并沒有閉塞血管造成腦組織損傷，未觀察到腦組織水腫，所以沒有對假手術(shù)組進(jìn)行比較。在遭受大腦局灶缺血6 h后，腦缺血瘦素預(yù)處理組和腦缺血組都出現(xiàn)不同程度的腦水腫。結(jié)果表明腦缺血瘦素預(yù)處理組的腦水腫程度低于腦缺血組的水腫程度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.001），說明瘦素可改善腦水腫程度（表1）。

2.3 體質(zhì)量變化結(jié)果表明各實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量都出現(xiàn)不同程度變化。其中，腦缺血瘦素預(yù)處理組的體質(zhì)量與腦缺血組體質(zhì)量相比，并差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明瘦素并不會影響缺血6 h內(nèi)的體質(zhì)量變化；而假手術(shù)組體重，相對于其他實(shí)驗(yàn)組，體重變化呈現(xiàn)出差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.001）（表1）。實(shí)驗(yàn)過程未觀察到實(shí)驗(yàn)大鼠死亡。

2.4 大鼠腦缺血區(qū)GRP78和CHOP免疫熒光組化表達(dá)結(jié)果表明各實(shí)驗(yàn)組中都存在GRP78蛋白的表達(dá)。假手術(shù)組中可見少量GRP78表達(dá)。在遭受大腦局灶缺血6 h后，腦缺血組的GRP78蛋白表達(dá)較假手術(shù)組出現(xiàn)一定程度的升高 （P＜0.01）。而腦缺血瘦素預(yù)處理組的GRP78蛋白表達(dá)明顯高于腦缺血組（P＜0.01）(見圖1、表2）。CHOP在假手術(shù)組中幾乎未見表達(dá)，而在腦缺血組中出現(xiàn)明顯的表達(dá)（P＜0.001）。但同樣是遭受6 h大腦局灶缺血，腦缺血瘦素預(yù)處理組的CHOP表達(dá)量遠(yuǎn)低于腦缺血組（P＜0.001）（見圖2、表2）。

3 討論

我們的研究發(fā)現(xiàn)，瘦素并不會加重腦卒中后的體質(zhì)量變化，但可減少神經(jīng)功能缺陷，并減少腦水腫程度，這與相關(guān)文獻(xiàn)報道的結(jié)果相一致[6-7]。瘦素的一個重要生理作用是調(diào)節(jié)體質(zhì)量[8]，在大鼠皮下注射劑量為1 mg/kg的瘦素并不會加重腦卒中后引起的體重消耗性降低，說明瘦素可能在此劑量下即可起到神經(jīng)保護(hù)的作用同時又具有相對的生物安全性。

表1 各組體質(zhì)量變化、腦水腫程度、神經(jīng)功能缺陷評分結(jié)果（±s）

表1 各組體質(zhì)量變化、腦水腫程度、神經(jīng)功能缺陷評分結(jié)果（±s）

1）與假手術(shù)組比較，P＜0.001；2)與腦缺血組比較，P＜0.001；3）與腦缺血組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組腦缺血組腦缺血瘦素預(yù)處理組n 10 15 15體質(zhì)量變化(g) 4.52±0.56 8.65±0.891)8.58±0.521)腦水腫程度(mg) / 7.70±0.94 3.60±0.522)神經(jīng)功能缺陷評分/ 2.50±0.52 1.90±0.313)

表2 大鼠缺血皮層GRP78及CHOP蛋白熒光密度

缺血性腦卒中導(dǎo)致的腦組織缺氧會引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會進(jìn)一步損傷神經(jīng)細(xì)胞。GRP78是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶，在正常組織中可見少量表達(dá)，可作為一種保護(hù)性因子以避免內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡壞死[9]。而CHOP是一種重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)促凋亡蛋白，在正常細(xì)胞中幾乎未見表達(dá)，但在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時可大量表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。而在腦缺血后6 h后即可觀察到GRR78和CHOP表達(dá)顯著增多[11]，這與本研究結(jié)果基本一致。此外，本研究通過目的蛋白和DAPI雙重?zé)晒鈽?biāo)記發(fā)現(xiàn)GRR78表達(dá)多集中于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞核未見有明顯的表達(dá)；而CHOP蛋白的表達(dá)似乎并沒有明顯的分布差異，在細(xì)胞核內(nèi)也可見有CHOP蛋白表達(dá)，其原因可能是CHOP也參與了細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄的作用[12]。本研究結(jié)果提示瘦素可促進(jìn)GRP78蛋白的表達(dá)，抑制CHOP蛋白的產(chǎn)生。一方面，GRP78作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護(hù)性蛋白，其表達(dá)的增多說明瘦素可在一定程度上保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損害。另一方面，CHOP表達(dá)減少也間接說明瘦素減弱了在缺血區(qū)域的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。這表明瘦素的腦保護(hù)作用可能與瘦素對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響有關(guān)。

圖1 大鼠缺血皮層GRP78+DAPI熒光標(biāo)記圖。A為假手術(shù)組，B為腦缺血組，C為腦缺血瘦素預(yù)處理組，比例尺為20μm

已有研究表明在大鼠持續(xù)性大腦中動脈閉塞（permanent middle cerebral artery occlusion）模型條件下，在閉塞血管3 h皮下注射瘦素可起到最大程度的神經(jīng)保護(hù)作用，而在此動物模型條件下在閉塞血管后立即注射瘦素并不會起到明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[7]。其原因可能是在閉塞血管后注射瘦素可能無法使瘦素有效通過血腦屏障并達(dá)到有效的藥物濃度。

本研究表明瘦素可改善局灶性腦缺血引起神經(jīng)功能缺陷并減少腦水腫程度。同時，瘦素可通過促進(jìn)GRP78蛋白表達(dá)，下調(diào)CHOP蛋白表達(dá)緩解大鼠局灶性腦缺血導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，說明減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用可能是瘦素神經(jīng)保護(hù)作用的一個重要組成部分，為闡明瘦素治療腦缺血提供了新的理論依據(jù)和治療思路，但與之相關(guān)的具體信號傳導(dǎo)通路仍有待進(jìn)一步研究。

圖2 大鼠缺血皮層CHOP+DAPI熒光標(biāo)記圖。A為假手術(shù)組，B為腦缺血組，C為腦缺血瘦素預(yù)處理組，比例尺為20μm

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Effects of leptin on endoplasmic reticulum stress related proteins after focal cerebral ischemia.

HU Shijun,PENG Dingtian,TAN Jing,LIANG Zhijian,YANG Li,CHENG Daobin.Department of Neurology,The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,22 Shuangyong Road,Nanning 530021,Guangxi,China.Tel:0771-5356735.

ObjectiveTo investigate the effect of leptin on endoplasmic reticulum stress related protein after focal cerebral ischemia in rats.MethodsIschemia was induced by occluding the middle cerebral artery in rats brain using the filament occlusion method.Forty SD rats were randomly divided into sham operation group,cerebral ischemia group and leptin-preconditioning group.Leptin was injected subcutaneously before occlusion of blood vessel.Longa 5 score neurological function scale,body weight and brain edema changes were measured 6 hours after MCAO, and the brain was removed to detect the endoplasmic reticulum marker protein:glucose-regulated protein 78(GRP78) and C/EBP-homologous protein (CHOP)by immunohistochemical method.ResultsThere was no difference in the body weight changes between leptin-preconditioning group and ischemic group.In the leptin-preconditioning group, the neurological function score (1.90±0.31 vs.2.50±0.52,P＜0.05)and the degree of brain edema (3.60±0.52 vs.7.70±0.94,P＜0.001)were significantly lower than those in the cerebral ischemia group.Moreover,the expression of GRP78 in leptin-preconditioning group was significantly higher than that in ischemia group (48.69±5.06 vs.35.78± 4.35,P＜0.01),and the expression of CHOP was significantly lower than that of ischemia group (60.24±4.11 vs.38.81±5.34,P＜0.01).ConclusionLeptin can reduce the neurological deficit and may be associated with the up-reg-ulation of GRP78 protein,and down regulation of CHOP protein to weaken the endoplasmic reticulum stress caused by cerebral ischemia

Leptin Focal cerebral ischemia Endoplasmic reticulum stress GRP78 CHOP

R743.3

A

2016-11-12）

（責(zé)任編輯：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.06.006