普朗尼克P85修飾的苯妥英鈉納米粒對(duì)顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠模型的腦靶向作用

方子妍郭彩鳳吳逢春秦家明寧玉萍周列民

·論 著·

普朗尼克P85修飾的苯妥英鈉納米粒對(duì)顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠模型的腦靶向作用

方子妍*郭彩鳳*吳逢春*秦家明△寧玉萍*周列民△

目的觀察普朗尼克P85修飾的聚氰基丙烯酸正丁酯構(gòu)建的苯妥英鈉納米粒能否避開顳葉內(nèi)側(cè)癲癇大鼠模型腦中P糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp）的外排作用將苯妥英鈉靶向輸送到腦組織中。方法鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠形成慢性顳葉內(nèi)側(cè)癲癇模型。免疫組化檢測(cè)腦組織中Pgp的表達(dá)水平。界面聚合法制備苯妥英鈉納米粒，與普通苯妥英鈉比較，觀察兩組不同給藥的模型鼠（苯妥英鈉納米粒組6只，普通苯妥英鈉組7只）在給藥后30、60、120、180、240、300 min時(shí)其腦組織中苯妥英鈉的藥物分布情況。采用立體定向活體微透析技術(shù)采集腦微透析液，高效液相色譜法檢測(cè)待測(cè)標(biāo)本中苯妥英鈉的藥物濃度。結(jié)果兩組不同給藥的模型鼠的腦/血漿的時(shí)間藥物濃度曲線的曲線下面積比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[即苯妥英鈉納米粒組（0.37±0.10，n=6）明顯高于普通苯妥英鈉組（0.19±0.06，n=7），P<0.05]。與正常大鼠相比，模型鼠海馬CA1、CA3及DG區(qū)Pgp表達(dá)上調(diào)。結(jié)論普朗尼克P85修飾的聚氰基丙烯酸正丁酯納米?？娠@著地提高抗癲癇藥物苯妥英鈉靶向進(jìn)入Pgp高表達(dá)的顳葉內(nèi)側(cè)癲癇模型鼠腦中的濃度。

納米粒 顳葉癲癇 P糖蛋白 苯妥英鈉 靶向

癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的第二大常見病。盡管近年來(lái)癲癇在治療方法上已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但合理、規(guī)則地服用抗癲癇藥物（antiepileptic drugs，AEDs）仍是治療癲癇的主要手段。雖經(jīng)正規(guī)的AEDs治療，仍有約30%的癲癇患者其發(fā)作無(wú)法控制，即耐藥性癲癇[1-3]。而臨床上耐藥性癲癇以顳葉內(nèi)側(cè)癲癇 （mesial temporal lobe epilepsy，MTLE）為多見。雖耐藥性癲癇的病理生理機(jī)制存在多種假說(shuō)，但一個(gè)非常重要的特性就是該類癲癇對(duì)多種AEDs產(chǎn)生耐藥，盡管這些AEDs具有不同的作用機(jī)制[4]。因此更多的指向于多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體過(guò)度表達(dá)學(xué)說(shuō)。研究發(fā)現(xiàn)耐藥性癲癇患者手術(shù)切除的腦組織中Pgp（多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體之一）過(guò)度表達(dá)，而幾乎所有的AEDs都是Pgp的底物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)腦中Pgp過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致了藥物耐受[5]。因此如何規(guī)避Pgp過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致的耐藥，保證AEDs靶向進(jìn)入癲癇灶是耐藥性癲癇治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，納米及相關(guān)材料技術(shù)飛速發(fā)展，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的研究與應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒是目前少數(shù)可通過(guò)血腦屏障的納米微粒之一[6]。而普朗尼克P85是一種具有藥理活性的多功能藥用輔料，在藥物穿越血腦屏障的過(guò)程中起著重要作用，此外，普朗尼克P85還具有Pgp抑制作用[7-9]。因此，本研究采用聚氰基丙烯酸正丁酯作為苯妥英鈉的載藥材料，添加普朗尼克P85作為納米粒的表面修飾，制作成苯妥英鈉納米粒，以考察其在MTLE大鼠模型中的腦靶向輸送苯妥英鈉的效用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物32只雌性6～8周SD大鼠，體重160～180 g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。

1.2 MTLE模型的構(gòu)建

1.2.1匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)MTLE 32只大鼠腹腔注射氯化鋰 （127.2 mg/kg）（Sigma L9650-100G）；18～24 h后腹腔注射東莨菪堿 （1 mg/kg）（Sigma S8502-1G）；之后30 min，腹腔注射匹羅卡品 （30 mg/kg）（Sigma P6503-10G）；當(dāng)大鼠出現(xiàn)RacineⅣ/Ⅴ發(fā)作后開始計(jì)時(shí)，等待發(fā)作持續(xù)90 min后再腹腔注射地西泮注射液 （10 mg/kg）終止發(fā)作；存活的大鼠飼養(yǎng)出現(xiàn)慢性反復(fù)自發(fā)性發(fā)作（即MTLE）。并記錄相關(guān)視頻腦電資料。

1.2.2大鼠癲癇發(fā)作評(píng)估按Racine標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行分級(jí) Ⅰ級(jí)：面部陣攣；Ⅱ級(jí)：面部陣攣+節(jié)律點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí)：面部陣攣+節(jié)律點(diǎn)頭+前肢陣攣；Ⅳ級(jí)：面部陣攣+節(jié)律點(diǎn)頭+前肢陣攣+后肢站立；Ⅴ級(jí)：面部陣攣+節(jié)律點(diǎn)頭+前肢陣攣+后肢站立+跌倒+豎尾。

1.2.3腦電圖描記 大鼠用10%水合氯醛麻醉后固定。電極插入大鼠頭頂部雙側(cè)外耳門連線內(nèi)外1/3位點(diǎn)處頭皮下固定于顱骨內(nèi)，對(duì)照電極插入后頸部皮下，描記腦電活動(dòng)。

1.3 Pgp表達(dá)水平檢測(cè)腦組織切片以非免疫性動(dòng)物血清封閉，采用單克隆小鼠抗大鼠Mdr C-19抗體（sc-1517，Santa Cruz Biotechnology，USA）混合稀釋孵育，最后免疫組化試劑盒 Dako K5007（DAB＋CHROMOGEN×50，5 mL）染色[11]。

1.4 苯妥英鈉納米粒的制備及檢測(cè)

1.4.1納米粒的制備 將α-BCA（1%，v/v）（氰基丙烯酸正丁酯單體，1 mL，廣州白云醫(yī)用膠公司）溶于 15 mL丙酮，Dextran-70（1%，w/v）（Sigma-Aldrich，Inc.St.Louis，Missouri，USA）及125 mg苯妥英鈉溶于15 mL超純水，將有機(jī)相緩慢滴加入水相，800 rpm攪拌3 h，減壓蒸餾去除丙酮，添加1%普朗尼克P85[12]，0.45 μm膜過(guò)濾后4℃保存。

1.4.2物理性征檢測(cè) 利用投射電鏡、粒度儀（英國(guó)馬爾文）、zeta電位儀檢測(cè)納米粒的粒徑、粒徑分布及zeta電位。

1.4.3載藥量和包封率的測(cè)定 采用SephadexG75凝膠柱純化苯妥英鈉納米粒，HPLC測(cè)定苯妥英鈉濃度。計(jì)算載藥量和包封率。

1.4.4納米粒的體外釋放 苯妥英鈉納米粒0.5 mL于透析袋中 （截留分子量7000），40 mL生理鹽水為釋放介質(zhì)，置于37℃恒溫?fù)u床中70 rpm旋轉(zhuǎn)，于15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、12 h、36 h、48 h取樣 1 mL，HPLC測(cè)定苯妥英鈉濃度，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)累積釋放度。

1.5 苯妥英鈉納米粒在MTLE模型鼠上的應(yīng)用

1.5.1微透析探針局部立體定位[12]13只MTLE模型鼠頸靜脈置管后固定在立體定位儀上。坐標(biāo)位置為：前囟后5.2 mm，左側(cè)5.0 mm，探針置入前囟下7.5 mm。

1.5.2微透析步驟 微透析探針 （CMA/12，3-mm polycarbonate membrane，cut off 20 kD，Carnegie Medicine，Sweden）置入后穩(wěn)定2 h，普通苯妥英鈉組（n＝7）及苯妥英鈉納米粒組（n＝6）分別一次性靜脈予苯妥英鈉及苯妥英鈉納米粒 （35 mg/kg）。于 30 min、60 min、120 min、180 min、240 min和300 min取全血300 μL，12000 rpm離心4 min取上清，-20℃保存。同時(shí)收集0～30 min、30～60 min、60～120 min、120～180 min、180～240 min和 240～300 min的微透析液，-20℃保存。微透析實(shí)驗(yàn)后取腦做切片驗(yàn)證探針針道位置。

1.5.3HPLC檢測(cè)苯妥英鈉濃度[12]取待測(cè)樣品90μL，加入內(nèi)標(biāo)卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μL，乙酸乙酯萃取。真空干燥箱揮干后流動(dòng)相復(fù)溶。HPLC色譜柱為Waters XTerra MS C18 column（5 μm，4.6×150 mm，Waters，Milford，USA），流動(dòng)相為10 mmol/L磷酸鹽緩沖液/乙腈 （65/35，V/V，pH 5.0），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)UV 205 nm，進(jìn)樣體積10 μL，分析時(shí)間7 min。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用 SPSS 20.0 （SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn) （或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的MTLE大鼠模型的構(gòu)建

2.1.1MTLE大鼠模型構(gòu)建 鋰-匹羅卡品化學(xué)誘導(dǎo)大鼠急性期出現(xiàn)持續(xù)狀態(tài)的成功率為93.75%（30/32），大鼠持續(xù)狀態(tài)死亡率為10.0%（3/30）。MTLE建模成功率為48.14%（13/27）。

2.1.2免疫組化檢測(cè)腦中Pgp表達(dá) 模型鼠在海馬CA1、CA3及DG區(qū)上Pgp的表達(dá)較正常大鼠增高（圖1）。

2.2 苯妥英鈉納米粒的物理特性

圖1 海馬CA1，CA3及DG區(qū)中Pgp的表達(dá)情況（高倍鏡400×）棕褐色著色顆粒為Pgp的表達(dá)水平。A、B、C分別為正常大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)，D、E、F分別為MTLE模型鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)

2.2.1苯妥英鈉納米粒的性征 電鏡下，納米藥物為200 nm左右的圓形粒子，大小均一，分散均勻。粒徑為（268.00±2.54）nm，分散系數(shù)為0.19±0.01。zeta電位為（-36.60±0.45）mv。包封率為96.63%± 5.53%。載藥量為22.00%±3.95%。

2.2.2苯妥英鈉納米粒的體外緩釋能力 本研究制備的苯妥英鈉納米粒在1 h內(nèi)具有突釋現(xiàn)象，之后開始緩慢釋放，經(jīng)60 h累積釋放度超過(guò)80%，具有緩釋效果。

2.3 苯妥英鈉納米粒應(yīng)用于MTLE模型鼠的藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果

2.3.1腦微透析液中藥物濃度 （如圖2）兩組模型鼠于一次給藥后60 min普通苯妥英鈉組腦微透析液中藥物濃度為最高，之后逐漸下降。而苯妥英鈉納米粒組腦微透析液中藥物濃度于120 min時(shí)為最高，之后逐漸下降，并且下降較前者稍迅速。兩組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，其腦微透析液中藥物濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即苯妥英鈉納米粒組顯著高于普通苯妥英鈉組 （30 min：4.97±0.94與2.14±0.16；60 min：5.14±0.95與2.93±0.58；120 min：5.32±1.42與 2.52±0.71；180 min：4.48±1.00與2.19±0.74；240 min：3.36±1.06與 1.90±0.71；300 min：3.20±0.49與1.83±0.65）。

圖2 兩組模型鼠腦微透析液藥物濃度比較

2.3.2血漿中藥物濃度 如圖3，兩組模型鼠于一次給藥后30 min均為最高，之后逐漸下降，而苯妥英鈉納米粒組藥物濃度下降速度較快。兩組在60 min、120 min、180 min、240 min及300 min其外周血中藥物濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）（60 min：19.15±5.07 與 14.67±2.54；120 min：12.71±3.51與 12.46±3.22；180 min：9.12±2.86與 9.50±3.26；240 min：6.46±2.53與 9.50±3.26；300 min：4.96±2.57與 8.60±3.04），而在 30 min，苯妥英鈉納米粒組藥物濃度高于普通苯妥英鈉組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.05）（30 min：21.51±1.55與18.82±2.00）。

圖3 兩組模型鼠血漿藥物濃度比較

2.3.3腦中藥物分布 如圖4，兩組模型鼠的腦/血漿的時(shí)間藥物濃度曲線的AUC比值之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即藥物在腦中的分布情況為苯妥英鈉納米粒組顯著高于普通苯妥英鈉組）（0.37±0.10與0.1±0.06）。

圖4 海馬組織ECF/血漿的時(shí)間藥物濃度曲線的曲線下面積比值的比較

3 討論

本研究證實(shí)在海馬錐體細(xì)胞層的神經(jīng)元上可見免疫組化陽(yáng)性染色表達(dá)，這種棕褐色陽(yáng)性染色在MTLE模型鼠海馬的CA1、CA3、DG區(qū)更多，即Pgp蛋白表達(dá)增高。近來(lái)研究證實(shí)，在杏仁核電刺激點(diǎn)燃模型鼠中，特別是在苯妥英鈉耐藥模型鼠的杏仁核點(diǎn)燃同側(cè)腦組織，相對(duì)于苯妥英鈉藥物反應(yīng)模型鼠，其腦組織中Pgp的表達(dá)存在著顯著性的差異，Pgp陽(yáng)性..表達(dá)的標(biāo)記區(qū)域也增高將近2倍[13]。除此之外，L?O SCHER等[5]提出杏仁核電點(diǎn)燃模型鼠中，苯巴比妥耐藥模型鼠的腦中Pgp表達(dá)水平也高于苯巴比妥反應(yīng)組。這些研究結(jié)果均表明耐藥模型鼠腦中Pgp表達(dá)增高，給多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體與癲癇耐藥的假說(shuō)提供了支持理論[13]。由此推測(cè)在MTLE模型中由于癇性發(fā)作誘導(dǎo)了Pgp過(guò)度表達(dá)，而Pgp的過(guò)度表達(dá)將使其作用即藥物主動(dòng)外向轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)，使到達(dá)藥物作用靶點(diǎn)即致癇灶的藥物濃度下降，導(dǎo)致癲癇發(fā)作不能控制，最終耐藥性癲癇形成。

研究發(fā)現(xiàn)，P85修飾的氰基丙烯酸正丁酯合成的納米藥物能顯著地增加苯妥英鈉在腦組織中的分布，使腦/血的時(shí)間藥物濃度曲線下AUC的比增高至正常藥物的近兩倍水平。一次性靜脈給藥后，普通苯妥英鈉給藥的模型鼠的海馬組織ECF的藥物濃度于60 min時(shí)為最高，之后隨著時(shí)間下降，而給予苯妥英鈉納米粒的模型組的藥物濃度則于120 min時(shí)為最高，之后再隨著時(shí)間下降。而藥物濃度在達(dá)到最高值后，苯妥英鈉納米粒組的海馬組織ECF及血漿中的苯妥英鈉濃度的下降速度均快于普通苯妥英鈉給藥的模型組。在血漿中，從給藥后120 min開始，苯妥英鈉濃度逐漸明顯的低于普通苯妥英鈉組，但在相同時(shí)間點(diǎn)，苯妥英鈉納米粒組的海馬組織ECF的藥物濃度卻仍顯著地高于普通苯妥英鈉組的水平。由此可見，本課題構(gòu)建的載藥納米粒具有較明顯的腦靶向作用。雖然結(jié)果中已經(jīng)證明苯妥英鈉納米粒具有較好的體外緩釋效果，但是相比于傳統(tǒng)苯妥英鈉，在血循環(huán)中其藥物濃度下降更為迅速，可能與循環(huán)中單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)清除納米粒有關(guān)[14]，鑒于此，可以進(jìn)一步優(yōu)化苯妥英鈉納米粒物理性征來(lái)減少其清除率。

納米載體介導(dǎo)藥物通過(guò)血腦屏障的機(jī)制目前尚未完全闡述清楚。近年來(lái)一些新的機(jī)制陸續(xù)被提出并證實(shí)[15]。據(jù)研究，經(jīng)過(guò)聚山梨醇酯80修飾的聚氰基丙烯酸正丁酯載藥納米粒在進(jìn)入外周血循環(huán)后吸附血液中的載脂蛋白ApoE和ApoB，而聚山梨醇酯80做為結(jié)合脂蛋白和納米粒的鏈接點(diǎn)[16]。其中，ApoE在低密度脂蛋白的腦轉(zhuǎn)運(yùn)中有重要作用[17-19]。而普朗尼克P85是否起到與聚山梨醇酯80類似作用，使苯妥英鈉納米粒模仿低密度脂蛋白與腦中毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，最終將藥物通過(guò)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞方式而進(jìn)入腦組織中。進(jìn)一步的研究提出，通過(guò)抗生物素蛋白的方式將載脂蛋白ApoE與包裹人類血清蛋白的納米粒相連接，再包裹左旋多巴，能證明載脂蛋白ApoE在腦給藥轉(zhuǎn)運(yùn)中具有呈劑量依賴性的作用。近來(lái)也有研究其它載脂蛋白ApoE3、B-100和A-I在腦靶向給藥系統(tǒng)中所起的作用[20-21]。但關(guān)于該研究中的聚氰基丙烯酸正丁酯包裹的苯妥英鈉納米粒的腦靶向的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)，并且在本研究的基礎(chǔ)上將苯妥英鈉納米粒進(jìn)一步優(yōu)化，為耐藥性癲癇尋找一個(gè)切實(shí)有效的治療方法。

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The study on the construction of Pluronic P85 coated poly(butylcyanoacrylate)nanoparticles and its braintarget effect on a rat model of mesial temporal lobe epilepsy.

FANG Ziyan，GUO Caifeng，WU Fengchun，QINJiaming，NING Yuping*，ZHOU Liemin.Department of Neurology，The Affiliated Brain Hospital of Guangzhou Medical University (Guangzhou Huiai Hospital)，36th Mingxin Road，Guangzhou，510370.Department of Neurology，The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，58thZhongshan 2ndRoad，Guangzhou 510080,China.Tel:020-81268212

ObjectiveIn order to evaluate that whether Pluronic P85 coated poly(butylcyanoacrylate)nanoparticles was able to deliver antiepileptic drug phenytoin into the brain va bypassing mesial temporal lobe epilepsy(MTLE) -induced Pgp in a rat model of MTLE.MethodsThe rat model of MTLE,induced by li-pilocarpine,was divided into two groups(6 for nanoparticle drug group and 7 for PHT drug group).Immunohistochemistry assay was performed to detect Pgp expression at the hippocampus.Nanoparticles were prepared by interfacial polymerization method.Dialysate samples of brain were collected at 30,60,120,180,240 and 300 min after drug administration by microdialysis technology.Samples were analyzed by high performance liquid chromatography(HPLC).ResultsThe area under the curve (AUC)ratio of brain/plasma in Nanoparticle drug group was 0.37 0.10 which was significantly higher compared with0.19 0.06 in conventional PHT drug group (P＜0.05).The Pgp immunopositive area,as assessed by analysis of labeled surface area,was higher in the DG,CA3 and CA1 sector in the hippocampus of MTLE rats when compared to the normal rats.ConclusionsPluronic P85 coated PBCA nanoparticles can significantly deliver PHT into brain via bypassing MTLE-induced Pgp in a rat model of MTLE.

Nanoparticles Temporal lobe epilepsy P-glycoprotein Phenytoin Targeting

R742.1

A

2016-12-22）

（責(zé)任編輯：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.06.008

☆國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：81071050，81571333）；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（編號(hào)：20171A011268，20161A011036）；廣州市科技計(jì)劃科技型中小企業(yè)創(chuàng)新-初創(chuàng)項(xiàng)目（編號(hào)：2017010160496）；廣州市腦科醫(yī)院廣州市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目子項(xiàng)目（編號(hào)：GBH2014-QN03）

* 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院（廣州市惠愛醫(yī)院）（廣州510370）

△中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院（廣州510080）