大熊貓糞便中纖維素降解菌的篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

張 智 尹文哲 雅 男 馬建章

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱150086；3.東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱150040)

大熊貓糞便中纖維素降解菌的篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

張 智1尹文哲2*雅 男1馬建章3**

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱150086；3.東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱150040)

本試驗旨在從大熊貓糞便中篩選出能夠降解纖維素的菌株，并對該菌株進(jìn)行鑒定和產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。利用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為唯一碳源的培養(yǎng)基，結(jié)合碘液染色法、濾紙分解試驗和纖維素酶活力測定，從大熊貓糞便中篩選得到1株纖維素降解菌DL。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和16S rDNA基因序列同源性分析，初步鑒定該菌株為PaenibacilluscookiiLZ033，它是一種產(chǎn)芽孢且好氧的革蘭氏陽性菌。為確定菌株DL的最佳產(chǎn)酶條件，選取培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速以及裝液量4個因素，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用正交試驗，確定菌株DL的最佳產(chǎn)酶條件為培養(yǎng)基初始pH為6、培養(yǎng)溫度為35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為125 r/min、250 mL三角瓶裝液量為100 mL，在此條件下纖維素酶活力(以濾紙酶活力表示)為102.3 U/mL。

大熊貓糞便；纖維素降解菌；產(chǎn)酶條件

大熊貓是我國特有的珍稀動物，1984年被列入世界10種瀕危物種之一[1-2]。10月齡的亞成年大熊貓食性轉(zhuǎn)變?yōu)橐灾褡訛橹鞯母呃w維食物[3]，每只成年大熊貓每日進(jìn)食竹子量可達(dá)12～38 kg[4]，大熊貓可利用竹子中8%的纖維素和27%的半纖維素[5]。大熊貓的消化系統(tǒng)屬于典型的肉食性哺乳動物消化系統(tǒng)[6]，2010年大熊貓的基因組序列公布，從中可以找到編碼與肉食性動物消化系統(tǒng)相關(guān)的酶的基因，但不存在任何纖維素酶的基因[7]，因此大熊貓對纖維素的消化主要是由腸道微生物來完成的[8-10]。大熊貓的腸道只有小腸和大腸，腸道長度較短，且氧氣含量較高，由此猜測大熊貓腸道更適宜需氧或兼性厭氧的微生物生長[11]。大熊貓腸道中任何一個微生物的改變都可能引起其消化系統(tǒng)紊亂，甚至導(dǎo)致死亡的發(fā)生。因此，研究大熊貓腸道微生物區(qū)系尤為重要，對腸道疾病可起到一定的預(yù)防作用，從而改善大熊貓的健康水平，并且也是研制大熊貓微生態(tài)制劑的基礎(chǔ)。雖然自然界中存在著許多能夠降解纖維素的微生物，但是大熊貓屬于珍稀動物，更應(yīng)該考慮喂養(yǎng)的安全性，從大熊貓糞便中篩選出的纖維素降解菌比從其他環(huán)境中分離得到的微生物更適合作為大熊貓的微生態(tài)制劑或飼料添加劑。

近年來，大熊貓腸道微生物得到了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。例如，張志和等[12]、Hirayama等[13]對大熊貓腸道菌群進(jìn)行了分離、鑒定；蔣芳[14]從大熊貓糞便中分離、篩選出能產(chǎn)生纖維素酶的沙雷氏菌；谷武陽[15]從大熊貓糞便中分離、篩選出能產(chǎn)生纖維素酶的芽孢桿菌；Zhou等[16]從大熊貓腸道中分離出的芽孢桿菌不僅能夠分解纖維素，還可以抑制腸道中病原菌的增殖。

本試驗擬從雅安碧峰峽基地飼養(yǎng)的健康、無腹瀉大熊貓林冰的糞便中分離得到一株需氧的纖維素降解菌，并對該纖維素降解菌的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，以豐富纖維素酶的微生物來源，并為大熊貓微生態(tài)制劑的制備提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

試驗樣品為雅安碧峰峽基地飼養(yǎng)的健康、無腹瀉大熊貓林冰(雌性，生于2009年)的新鮮糞便。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL[17]。

篩選培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 4 g，氯化鈉5 g，瓊脂16 g，蒸餾水1000 mL。

菌種保藏培養(yǎng)基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL[18]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1 g，葡萄糖6 g，蛋白胨8 g，硫酸鎂0.5 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 纖維素降解菌的篩選

1.3.1 富集培養(yǎng)

在超凈工作臺中，稱取新鮮糞便中間部分10 g，放入裝有玻璃珠的90 mL無菌水中，連續(xù)振蕩20 min，制成菌懸液。吸取1 mL菌懸液，加入到100 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)24 h[6]。

1.3.2 初篩

將培養(yǎng)后的大熊貓糞便混合菌液做標(biāo)準(zhǔn)10倍稀釋[19]，各吸取稀釋度為10-5、10-6、10-7、10-8倍的菌液100 μL涂于篩選培養(yǎng)基上，每個稀釋度做3個平行，倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后滴加碘液染色[20]，靜置3 min，觀察培養(yǎng)基上是否產(chǎn)生透明圈。

1.3.3 復(fù)篩

測量培養(yǎng)基中菌落的透明圈直徑(D，cm)與菌落直徑(d，cm)，計算二者的比值，選取比值較大的菌株測定纖維素酶活力[21]。

1.3.3.1 纖維素酶活力的測定

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑法測定纖維素酶活力[22]，通常纖維素酶總活力用濾紙酶活力(filter paper activity,FPA)來表示，F(xiàn)PA定義：每小時底物產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需酶量為1個酶活力單位(U)。FPA(U/mL)計算公式如下：

式中：5.56為1 mg葡萄糖的μmol數(shù)。

1.3.3.2 濾紙分解試驗

將篩選得到的菌株放入以濾紙為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中[19]，空白對照組不接種菌株。在37 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中連續(xù)培養(yǎng)7 d，每日同一時間拍照記錄濾紙分解情況。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特征

觀察菌落的隆起形狀、形態(tài)、透明度、質(zhì)地、顏色、邊緣等。細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察主要是通過革蘭氏染色，借助顯微鏡對細(xì)胞的大小、結(jié)構(gòu)、排練方式以及芽孢、鞭毛等進(jìn)行觀察[7]。菌株的生理生化特征描述參照TaxonomicOutlineoftheProcaryotes,Bergey’sManualofSystematicBacteriology[23]及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[24]進(jìn)行。

1.4.2 菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增及序列分析

采用試劑盒對菌株基因組DNA進(jìn)行提取，使用引物7F(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和1540R(5′AGGAGGTGTCCAGCCGCA)對菌株的16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸10 min；4 ℃保存[25]。獲得的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。16S rDNA序列在核糖體數(shù)據(jù)庫(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)上比對。

1.5 纖維素降解菌產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.5.1 培養(yǎng)基初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響

用1 mol/L鹽酸和1 mol/L氫氧化鈉將培養(yǎng)基pH分別調(diào)為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。將菌液以4%接種量接入培養(yǎng)基裝液量為100 mL的250 mL三角瓶中，然后搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定FPA。

1.5.2 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)酶的影響

將培養(yǎng)基初始pH調(diào)為6.5，并將菌液以4%接種量接入裝液量為100 mL的250 mL三角瓶中，然后將接種的培養(yǎng)基分別放入33、35、37、39、41 ℃的培養(yǎng)箱中，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測定FPA。

1.5.3 搖床轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶的影響

將培養(yǎng)基初始pH調(diào)為6.5，并將菌液以4%接種量接入裝液量為100 mL的250 mL三角瓶中，然后將搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為100、125、150、175、200 r/min，35 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定FPA。

1.5.4 裝液量對菌株產(chǎn)酶的影響

在250 mL三角瓶中分別裝入60、80、100、120、140 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基初始pH為6.5，將菌液以4%接種量接入培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速125 r/min，35 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定FPA。

1.5.5 正交優(yōu)化試驗

本試驗選取培養(yǎng)基初始pH(A)、培養(yǎng)溫度(B)、搖床轉(zhuǎn)速(C)和裝液量(D)4個因素，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗，正交試驗采取L9(34)正交試驗表，從而得到纖維素降解菌最適產(chǎn)酶條件。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用Origin 9.2軟件繪制曲線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

2.1.1 初篩

如圖1所示，培養(yǎng)24 h后用碘液染色，可清晰地看出菌落周圍的透明圈，在培養(yǎng)基上共有2處菌落產(chǎn)生了透明圈(圖1中箭頭所示)，其中左側(cè)產(chǎn)透明圈的菌株命名為LD，右側(cè)產(chǎn)透明圈的菌株命名為DL。

2.1.2 復(fù)篩

2.1.2.1 纖維素酶活力測定結(jié)果

纖維素酶活力以FPA表示，F(xiàn)PA測定結(jié)果見表1。通過比較FPA，確定菌株DL為篩選出的纖維素降解菌。將分離純化的菌株移至菌種保藏培養(yǎng)基上，4 ℃保存。

2.1.2.2 濾紙分解試驗結(jié)果

將菌株DL接入培養(yǎng)基觀察7 d。從圖2中可以看出，第2天培養(yǎng)基中完整的濾紙邊緣出現(xiàn)絮狀物；第3天培養(yǎng)基中的絮狀物增加，濾紙有所缺失；第5天扇形的濾紙徹底變成紙屑，培養(yǎng)基變得渾濁；到第7天，三角瓶中出現(xiàn)掛壁現(xiàn)象，產(chǎn)生了大量的細(xì)菌，濾紙基本被分解，培養(yǎng)基變得更加渾濁。這說明從大熊貓糞便中篩選獲得的菌株DL可以產(chǎn)生纖維素酶并具有纖維素降解能力。

圖1 菌株LD和DL在CMC-Na平板上的透明圈

菌株Strains透明圈直徑Transparentcirclediameter(D)/cm菌落直徑Colonydiameter(d)/cmD/d值D/dvalue濾紙酶活力FPA/(U/mL)LD0.450.15369.8DL0.750.15584.5

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特征

如圖3所示，菌落形態(tài)呈現(xiàn)圓形且菌落邊緣呈不規(guī)則鋸齒狀，表面凸起，菌落不透明呈乳白色，直徑為1.0～1.5 cm。

從表2中可知，菌株DL為革蘭氏陽性菌，好氧，芽孢染色、接觸酶、氧化酶、V-P試驗均為陽性，甲基紅、吲哚、硫化氫試驗為陰性。菌株DL可利用葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖、淀粉及羧甲基纖維素鈉，初步判定為芽孢桿菌或其變種。

2.2.2 16S rDNA測序結(jié)果分析

菌株DL經(jīng)過PCR擴(kuò)增16S rDNA獲得大小為1 400 bp的條帶，具有16S rDNA的特征。測序結(jié)果(圖4)經(jīng)BLAST同源性分析，結(jié)果表明菌株DL與類芽孢桿菌(Paenibacilluscookii)LZ033親緣關(guān)系最近，同源性為99%，在NCBI上的登陸號為JQ073763。采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖5所示。

圖2 濾紙分解試驗結(jié)果

圖3 菌株DL的菌落形態(tài)

2.3 菌株DL產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基的pH對微生物生長有很大的影響，可影響代謝過程中酶的活性及微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[26]。菌體生長需要適合的pH，微生物才能進(jìn)行正常代謝。如圖6中所示，pH在5.5～6.5范圍內(nèi)，F(xiàn)PA呈上升趨勢，F(xiàn)PA在pH為6.5時達(dá)到了最大值88.7 U/mL。pH為7.0～7.5時，F(xiàn)PA呈下降趨勢，在pH為7.5時，達(dá)到了最小值58.8 U/mL。由以上結(jié)果確定正交試驗中培養(yǎng)基初始pH的水平為6.0、6.5和7.0。

表2 菌株DL的生理生化特征鑒定結(jié)果

“+”：陽性；“-”：陰性。‘+’: positive; ‘-’: negative.

2.3.2 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響

當(dāng)培養(yǎng)溫度在一定的范圍內(nèi)，微生物的生長及其代謝產(chǎn)物的合成在一定程度上是依賴于溫度的升高的，如果溫度過高，代謝產(chǎn)物的合成會受到抑制，特別對酶類物質(zhì)會產(chǎn)生很大的影響。如圖7中所示，培養(yǎng)溫度在33～35 ℃范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，F(xiàn)PA是逐漸增大的，在35 ℃達(dá)到最大值91.1 U/mL。培養(yǎng)溫度在在37～41 ℃之間，隨著培養(yǎng)溫度的升高，F(xiàn)PA逐漸下降，在41 ℃時FPA最低，這是由于培養(yǎng)溫度過高，不適合菌株DL生長，導(dǎo)致產(chǎn)酶受影響。由以上結(jié)果確定正交試驗中培養(yǎng)溫度的水平為33、35和37 ℃。

圖4 序列測定結(jié)果

Paenibacilluscookii：類芽孢桿菌；Enterobacteriaceae bacterium：腸桿菌科細(xì)菌。

圖5 菌株DL 16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of strain DL

圖6 培養(yǎng)基初始pH對菌株DL產(chǎn)酶的影響

圖7 培養(yǎng)溫度對菌株DL產(chǎn)酶的影響

2.3.3 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響

在菌株培養(yǎng)過程中，振蕩可使菌株與氧氣接觸更加充分，通過振蕩可使溶氧量增大。還可使菌株與培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)更好地接觸，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的利用。如圖8中所示，搖床轉(zhuǎn)速在100～125 r/min之間，隨著振蕩頻率的提高，F(xiàn)PA呈上升趨勢，125 r/min時FPA為89.0 U/mL。當(dāng)轉(zhuǎn)速超過125 r/min時，F(xiàn)PA下降，這可能是由于菌株DL的需氧量有限。由以上結(jié)果確定正交試驗中搖床轉(zhuǎn)速的水平為100、125和150 r/min。

圖8 搖床轉(zhuǎn)速對菌株DL產(chǎn)酶的影響

2.3.4 裝液量對產(chǎn)酶的影響

在菌株培養(yǎng)過程中，裝液量也會影響溶氧量，裝液量過多會降低氧氣含量，使好氧的菌株生長受到抑制，但是過低的裝液量也不利于菌株的生長。如圖9中所示，隨著裝液量的增加，F(xiàn)PA逐漸增大。裝液量為120 mL時，F(xiàn)PA達(dá)到最大值84.2 U/mL。但裝液量增加到140 mL時，F(xiàn)PA則降低為58.7 U/mL，這可能是由于菌株DL本身為需氧型，氧氣過低可能會影響菌株DL的生長使得產(chǎn)酶受抑制。 由以上結(jié)果確定正交試驗中裝液量的水平為100、120和140 mL。

圖9 裝液量對菌株DL產(chǎn)酶的影響

2.3.5 正交優(yōu)化試驗結(jié)果

2.3.5.1 產(chǎn)酶條件的正交優(yōu)化試驗

正交試驗結(jié)果見表3，從極差可知，4個因素對FPA影響從大到小的順序依次為溫度、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、培養(yǎng)基初始pH。最優(yōu)的產(chǎn)酶條件應(yīng)為A1B2C2D1，即培養(yǎng)基初始pH為6、培養(yǎng)溫度為35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為125 r/min、250 mL三角瓶裝液量為100 mL。

表3 正交試驗結(jié)果

續(xù)表3試驗號Testnumber因素FactorsA(培養(yǎng)基初始pHMediuminitialpH)B(培養(yǎng)溫度Culturetemperature/℃)C[搖床轉(zhuǎn)速Shakerspeed/(r/min)]D(裝液量Liquidmediumvolume/mL)濾紙酶活力FPA均值1k186.479.982.986.7均值2k284.592.088.484.7均值3k382.481.481.981.9極差R4.012.16.54.7

2.3.5.2 優(yōu)化條件的驗證試驗

最優(yōu)的產(chǎn)酶條件A1B2C2D1未出現(xiàn)在正交表中，所以需要與正交表中FPA最高的組合(A1B2C2D2)進(jìn)行比較，結(jié)果見表4。

表4 驗證試驗結(jié)果

如表4所示，通過極差分析得到的組合A1B2C2D1所產(chǎn)生的FPA略高于通過正交試驗得到的最優(yōu)組合A1B2C2D1產(chǎn)生的FPA。因此可確定最佳的產(chǎn)酶條件：培養(yǎng)基初始pH為6、培養(yǎng)溫度為35℃、搖床轉(zhuǎn)速為125 r/min、250 mL三角瓶裝液量為100 mL，此組合FPA為102.3 U/mL，與優(yōu)化前相比提高了1.2倍。

3 討 論

大熊貓的膳食以粗硬又難消化的竹子為主，常年食用大量竹子很容易對其消化道造成損傷，它排出的糞便幾乎都是竹節(jié)，竹子利用力極低。Zhu等[27]對大熊貓腸道菌群的宏基因組進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)存在纖維素酶基因，證明了大熊貓腸道內(nèi)存在可降解纖維素的微生物。馬海玲[19]對大熊貓糞便中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，利用剛果紅及濾紙崩潰試驗篩選得到具有纖維素降解能力的真菌和放線菌。劉艷紅等[28]對大熊貓糞便中的真菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，篩選出纖維素降解真菌。本試驗采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，旨在篩選出能產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌，因為細(xì)菌生長速度快、發(fā)酵時間較短；產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌更容易獲得，表達(dá)水平高；產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌有很好的熱穩(wěn)定性，更適用于基因工程菌。

培養(yǎng)基以羧甲基纖維素鈉作為唯一碳源，利用碘液染色，染色形成的透明圈大小可以初步判斷細(xì)菌降解纖維素的能力。羧甲基纖維素鈉在纖維素酶的作用下分解為纖維素二糖和葡萄糖糖，碘液不能與纖維素二糖和葡萄糖形成棕色復(fù)合物，但碘液可以與羧甲基纖維鈉形成棕色復(fù)合物，最后只有在纖維素降解菌周圍產(chǎn)生透明圈。李爭明[26]用碘液染色法從腐木、腐殖土壤中篩選獲得產(chǎn)纖維素酶的菌株。碘液染色只能初步反映出纖維素降解菌產(chǎn)纖維素酶的特性，因此需要進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩時先測定纖維素酶活力并選取產(chǎn)酶活力較高的菌株做濾紙分解試驗，濾紙的主要成分是纖維素，濾紙分解試驗可進(jìn)一步驗證篩選出的菌株具有降解纖維素的能力，菌株如果可以在以濾紙為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中生長，則濾紙會被分解，而且分解程度越大說明產(chǎn)纖維素酶能力越好。

對細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定最常用的方法就是16S rDNA序列同源性分析，再結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析及生理生化特征就可以很好地對細(xì)菌進(jìn)行分類，它是菌種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法。樊程等[21]、榮華等[25]、楊偉平等[29]都從動物腸道中分離出了纖維素降解菌，種屬鑒定時均使用了生理生化特征及16S rDNA序列分析。

在微生物生長繁殖過程中，菌體的培養(yǎng)條件對其生長和代謝產(chǎn)物的積累都有重要的影響。在選育菌種過程中，通常會選擇生長速度快、產(chǎn)酶量高的菌株作為目標(biāo)菌株，因此就需要通過改變培養(yǎng)條件來提高代謝產(chǎn)物的合成量。本試驗通過改變培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速及裝液量從而提高纖維素酶活力。曹涵文等[5]從大熊貓糞便中篩選出1株纖維降解菌為好氧的假單胞菌并對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果最適pH為6、培養(yǎng)溫度26 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、裝液量30%，在此條件下產(chǎn)酶活力最高。本試驗篩選出的菌株為PaenibacilluscookiiLZ033，該菌株最適產(chǎn)酶條件是培養(yǎng)基初始pH為6、培養(yǎng)溫度為35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為125 r/min、250 mL三角瓶裝液量為100 mL，在此條件下纖維素酶活力最高。這與曹涵文等[5]的試驗結(jié)果不同，雖然都是從大熊貓糞便中分離出來的纖維素降解菌，但由于菌株不同，使得產(chǎn)酶條件存在差異。

此次篩選出的菌株P(guān)aenibacilluscookiiLZ033，隸屬于芽孢桿菌目，芽孢桿菌是目前研制微生態(tài)制劑中使用最廣泛的益生菌之一。用生長速度快且產(chǎn)酶活力高的菌株研制微生態(tài)制劑喂養(yǎng)動物時，菌株在短時間內(nèi)就可在腸道中繁殖，有助于維系腸道內(nèi)微生態(tài)平衡[29]。本次試驗獲得的菌株P(guān)aenibacilluscookiiLZ033可以分泌纖維素酶，它在飼料添加劑或大熊貓微生態(tài)制劑的制備上具有應(yīng)用潛力。

4 結(jié) 論

① 從大熊貓林冰糞便中篩選出的纖維素降解菌DL經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和16S rDNA序列同源性分析，鑒定為PaenibacilluscookiiLZ033。

② 所篩選菌株DL的最佳產(chǎn)酶條件是培養(yǎng)基初始pH為6，培養(yǎng)溫度為35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為125 r/min，250 mL三角瓶裝液量為100 mL，在此條件下培養(yǎng)24 h，F(xiàn)PA為102.3 U/mL。

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*Contributed equally

**Corresponding author, academician, E-mail: Jianzhangma@163.com

(責(zé)任編輯 菅景穎)

FPA(U/mL)=(葡萄糖×酶液定容體積×5.56)/(反應(yīng)體系中加入的酶量×濾紙質(zhì)量×?xí)r間)。

Screening of Celluloytic Bacterium from Giant Panda’s Feces and Optimization of Condition for Cellulase Production

ZHANG Zhi1YIN Wenzhe2*YA Nan1MA Jianzhang3**

(1.SchoolofForestry,NortheastForestryUniversity,Haerbin150040,China; 2.TheSecondAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Haerbin150086,China; 3.CollegeofWildlifeResources,NortheastForestryUniversity,Haerbin150040,China)

This experiment aimed to screen and identify the cellulose-decomposing bacterium isolated from the feces of giant pandas, and condition for producing cellulase was optimized. The cellulase-producing bacterium named DL was isolated from the feces of giant pandas, used the methods of sodium carboxymethylcellulose (CMC-Na) as unique carbon source and iodine staining, disintegration of filter paper test and measurement of cellulase activity. Based on the morphological observation, physiological and biochemical characteristics and the result of sequences alignment of 16S rDNA, strain DL was identified asPaenibacilluscookiiLZ033.The strain ofPaenibacilluscookiiLZ033 was found to be a spore-forming, gram-positive aerobic bacterium. Medium initial pH, culture temperature, shaker speed and liquid medium volume were chosen to determine the optimum condition for cellulase production. On the basis of the single factor experiment, the orthogonal experiment was used to analysis the optimum condition for cellulase production of strain DL, which was shown as follows: medium initial pH 6, culture temperature 35 ℃, rotation speed 125 r/min, broth liquid medium volume 100 mL in 250 mL flask. Under the optimum condition, the activity of cellulose (expressed in filter paper activity) was up to 102.3 U/mL.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(8)：2817-2825]

feces of giant pandas; celluloytic bacterium; conditions for cellulase production

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.08.026

2017-02-13

國家林業(yè)局大熊貓國際資金項目“大熊貓益生菌制劑的研究”(SG1409)

張 智(1964—)，女，黑龍江哈爾濱人，教授，博士，研究方向為生物轉(zhuǎn)化、功能食品。E-mail: ldzhangzhi@163.com

Q93

A

1006-267X(2017)08-2817-09

*同等貢獻(xiàn)作者

**通信作者:馬建章，院士，博士生導(dǎo)師，E-mail: Jianzhangma@163.com