永州地區(qū)一典型副豬嗜血桿菌病的綜合診治

劉俊琦

（永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南永州425000）

永州地區(qū)一典型副豬嗜血桿菌病的綜合診治

劉俊琦

（永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南永州425000）

2016年5月，永州市零陵區(qū)某規(guī)?；i場(chǎng)的保育豬出現(xiàn)跛行，呼吸困難，部分豬只出現(xiàn)死亡，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀、病例剖檢以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，診斷為副豬嗜血桿菌病。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，針對(duì)性用藥，并結(jié)合綜合防治措施，使病情得到有效控制。筆者將本次病例進(jìn)行系統(tǒng)分析、總結(jié)，以期更好地指導(dǎo)養(yǎng)殖戶開展診治工作。

副豬嗜血桿菌；纖維素性；診斷；免疫

副豬嗜血桿菌為豬上呼吸道的一種常在菌，屬于條件性致病菌，當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生改變或有引起免疫抑制的因素存在時(shí)，可引起嚴(yán)重的全身性疾病，以纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征。本病一年四季均可發(fā)生，常為散發(fā)性或地方流行性，有時(shí)呈大面積暴發(fā)[1]。隨著現(xiàn)代養(yǎng)豬模式的變化，副豬嗜血桿菌病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的一種主要的細(xì)菌性疾病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

2016年5月，湖南省永州市零陵區(qū)某規(guī)模化豬場(chǎng)共有保育豬894頭，其中234頭保育豬陸續(xù)出現(xiàn)體溫升高、呼吸困難、跛行、震顫等癥狀。經(jīng)抗生素治療后，大部分豬只癥狀減輕，出現(xiàn)康復(fù)現(xiàn)象，但個(gè)別豬只經(jīng)治療后仍無明顯好轉(zhuǎn)，相繼死亡56頭。公司；TSA培養(yǎng)基購于青島海博公司；接觸酶、氧化酶、半乳糖、H2S、鳥氨酸、核糖、山梨醇、海藻糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、吲哚、脲酶、木糖、L-阿拉伯糖、蜜三糖、麥芽糖購自杭州天和微生物試劑有限公司；Taq-p lus酶、DNA Marker購自天根生化科技有限公司；副豬嗜血桿菌PCR檢測(cè)引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1 材料與方法

1.1 材料

病料采集于湖南省永州市零陵區(qū)某規(guī)?；i場(chǎng)疑似副豬嗜血桿菌發(fā)病仔豬；NAD購于成都貝斯特試劑有限

（1）臨床診斷。詢問養(yǎng)殖戶本場(chǎng)豬只既往病史、疫苗免疫情況；觀察不同病例癥狀。

（2）病理診斷。選擇20頭癥狀比較典型的患病豬進(jìn)行剖檢，觀察病變。

（3）細(xì)菌的分離培養(yǎng)。無菌采集病死豬的肺臟、關(guān)節(jié)液、心血、淋巴結(jié)等組織，接種于含NAD因子的TSA或者TM／SN平板上劃線接種，厭氧罐中37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，并對(duì)可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

（4）生化鑒定。將分離所得可疑菌株的純培養(yǎng)物分別接種于接觸酶、氧化酶、半乳糖、H2S等量生化鑒定管中，每支生化管中同時(shí)加入1μL牛血清和1μL NAD的（V因子）置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，觀察生化反應(yīng)和糖發(fā)酵活性結(jié)果，重復(fù)2次。

（5）PCR診斷。以可疑菌株為模版，按照副豬嗜血桿菌（GenBank：M 75065）的保守序列16s RNA設(shè)計(jì)引物（上游引物：5’GTGATGAGGAAGGGTGGTGT 3’；下游引物：5’GGCTTCGTCACCCTCTGT 3’）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5m in，然后94℃變性30 s，65℃退火30 s和72℃延伸2m in，25個(gè)循環(huán)后再72℃延伸7 m in，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取5μL的PCR產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

（6）藥敏試驗(yàn)。用滅菌接種環(huán)以劃線方式將細(xì)菌均勻涂布到平板皿培養(yǎng)基中，取藥敏片緊貼培養(yǎng)皿表面，37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，測(cè)量抑菌環(huán)直徑并判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

經(jīng)調(diào)查，該豬場(chǎng)過去未有副豬嗜血桿菌病大規(guī)模暴發(fā)歷史，也未注射副豬嗜血桿菌病疫苗。急性病例可見病豬精神沉郁，體溫升高，個(gè)別豬只體溫升高至41.5℃，食欲不振，不愿站立，咳嗽，腹式呼吸，關(guān)節(jié)腫脹，出現(xiàn)跛行，共濟(jì)失調(diào)，四肢劃動(dòng)，震顫，可視黏膜發(fā)紺，臥地不起，隨之部分豬死亡。慢性病例表現(xiàn)為體溫升高，皮膚蒼白，被毛粗糙，生長(zhǎng)緩慢，輕微腦膜炎，關(guān)節(jié)炎，肺炎。

2.2 病理變化

肉眼可見胸水、腹水增多，胸腔內(nèi)有大量的淡紅色液體和纖維素性滲出物凝塊；心包有纖維素性滲出物，心包膜與心臟粘連；纖維素性化膿性支氣管肺炎，部分肺臟發(fā)生粘連、腫脹、出血、淤血；全身淋巴結(jié)腫大、出血，切面呈大理石樣花紋。

2.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

顯微鏡下觀察到無芽孢的革蘭氏陰性短小桿菌，該菌在麥康凱培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。且將單菌落與金黃色葡萄球菌垂直劃線于無NAD的血平板上，在37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，可看到“衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象”，且無溶血現(xiàn)象，初步判斷該菌為副豬嗜血桿菌[3]。

2.4 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

將分離菌落分別接種于生化培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，其結(jié)果見表1，符合副豬嗜血桿菌的生化特性。

2.5 PCR確診

以可疑菌株為模版，經(jīng)PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到一段大小為821 bp的特異性條帶，見圖1，確診該菌株為副豬嗜血桿菌[4]。

圖1 PCR鑒定陽性副豬嗜血桿菌結(jié)果M：核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000）；1：陽性菌落

2.6 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，測(cè)量抑菌環(huán)直徑，其判斷標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑小于15 mm的為不敏感，15～20mm的為中度敏感，20mm以上的為高度敏感。結(jié)果表明該菌對(duì)頭孢噻呋、氯霉素、氟苯尼考、替米考星、青霉素、氨芐西林、頭孢克洛、環(huán)丙沙星敏感；對(duì)泰樂菌素、磺胺-6-甲氧嘧啶中敏；對(duì)紅霉素、四環(huán)素、林可霉素、氨基糖苷類有抵抗力，結(jié)果見表2。

表1 分離菌生化鑒定結(jié)果

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 治療

通過藥敏試驗(yàn)，對(duì)患病豬注射氟苯尼考進(jìn)行治療，每10 kg體重肌肉注射1m L，1次/天，可配合地塞米松注射液；或頭孢噻呋注射液，每kg體重肌肉注射5mg，1次/天。經(jīng)該方案治療3周后病情得到有效控制，共計(jì)死亡56頭，治愈178頭，治愈率為76%。

3.2 討論

本次豬場(chǎng)發(fā)生的副豬嗜血桿菌病是由多種因素綜合疊加引發(fā)的，主要有以下因素：⑴5月份該地區(qū)出現(xiàn)異常的低溫、潮濕、多雨氣候，而養(yǎng)殖戶未根據(jù)氣候變化及時(shí)做好保暖、通風(fēng)。建議養(yǎng)殖戶注意豬舍的通風(fēng)保暖，供給豬群足夠潔凈的飲水，可添加維生素C粉和電解質(zhì)飲水5～7天，以增強(qiáng)豬只抵抗力。⑵該養(yǎng)殖場(chǎng)衛(wèi)生條件非常差，由于該場(chǎng)豬圈采用傳統(tǒng)水泥地板，糞便與尿液隨處可見，臭氣熏天。建議徹底清掃豬舍，及時(shí)清除病死豬及糞便，做好無害化處理工作。糞便經(jīng)2%火堿溶液消毒處理后集中堆積發(fā)酵；受污染的欄舍、通道、食槽、墻面、飼養(yǎng)用具等應(yīng)該先用清水徹底沖洗后，用2%氫氧化鈉溶液噴灑地面和墻壁，2小時(shí)后用清水沖洗干凈，再選用刺激性小的消毒藥物消毒，1次/天，連用4～5天，以后圈舍每周進(jìn)行1次徹底的清掃和消毒；此外，建議豬場(chǎng)使用漏縫地板，以便于糞、尿的清除。⑶隨著近期市場(chǎng)行情較好，養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)熱情較高，從而大量引進(jìn)豬只，造成豬群飼養(yǎng)密度過高，豬只活動(dòng)范圍小，使得環(huán)境應(yīng)激因素增多。建議養(yǎng)殖戶加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，實(shí)行“全進(jìn)全出”飼喂體系；嚴(yán)格禁止不同批次的豬只混養(yǎng)，舍內(nèi)保持合理的飼養(yǎng)密度；消除誘因，減少各種應(yīng)激，在豬群轉(zhuǎn)群、混群前后可在飲水或飼料中添加一些抗應(yīng)激藥物；定期滅鼠、滅蚊蠅、殺蟲消毒，防止犬類、貓類等其他動(dòng)物進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)。⑷據(jù)調(diào)查，該豬場(chǎng)未使用副豬嗜血桿菌疫苗免疫，對(duì)副豬嗜血桿菌病的防治意識(shí)比較薄弱。建議豬群使用副豬嗜血桿菌多價(jià)油乳劑滅活苗，懷孕母豬產(chǎn)前50日首免，3周后二免，以后每胎產(chǎn)前4周免疫1次；種公豬每半年免疫1次；仔豬1周齡首免，3周齡后二免。⑸兩個(gè)月前該豬場(chǎng)曾感染過豬藍(lán)耳病，估計(jì)由于豬群感染藍(lán)耳病后免疫功能下降，副豬嗜血桿菌伺機(jī)暴發(fā)，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。已有研究證實(shí)，副豬嗜血桿菌常作為繼發(fā)的病原伴隨其他病原混合感染，通常副豬嗜血桿菌被認(rèn)為是隨機(jī)入侵的一種次要病原，屬于典型的“機(jī)會(huì)主義”病原。大量臨床病例表明，本病常與豬瘟、豬圓環(huán)病毒病、口蹄疫、豬藍(lán)耳病、豬偽狂犬病、豬肺疫、豬鏈球菌病、豬流感等混合感染或繼發(fā)感染。因此，控制上述病的感染是預(yù)防副豬嗜血桿菌病的關(guān)鍵因素。建議在做好本病疫苗防疫工作的同時(shí)，應(yīng)及時(shí)對(duì)豬瘟、豬圓環(huán)病毒病等傳染病進(jìn)行免疫。但需注意的是，在保育階段盡量減少注射疫苗，尤其是口蹄疫疫苗，如果母源抗體處于高免狀態(tài)，可推遲到60～70日齡免疫。

細(xì)菌的分離鑒定對(duì)副豬嗜血桿菌病的確診是必要的，但是通常很難成功。這是由于副豬嗜血桿菌是非?！皨赡邸钡募?xì)菌，對(duì)培養(yǎng)基又有較高的要求，當(dāng)標(biāo)本中出現(xiàn)其他細(xì)菌時(shí)，很難確認(rèn)采集的標(biāo)本中是否存在副豬嗜血桿菌。有學(xué)者認(rèn)為副豬嗜血桿菌病真實(shí)的發(fā)病率可能為報(bào)道的10倍之多。因此建議將細(xì)菌分離與血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷相結(jié)合，以提高診斷準(zhǔn)確性。

病豬要早發(fā)現(xiàn)、早治療，療效才好。雖然部分抗生素能有效地治療副豬嗜血桿菌病，但須注意的是副豬嗜血桿菌耐藥性很強(qiáng)，是當(dāng)前豬場(chǎng)所有致病菌中耐藥性產(chǎn)生速度最快的一種細(xì)菌。研究表明，通常一種敏感的抗生素，使用半年后細(xì)菌就開始耐藥（需要加大劑量），一年后便完全失效。因此，建議選平時(shí)未用過或很少使用的藥物，并輪換使用藥物，避免產(chǎn)生耐藥性。此外，配合使用抗病毒藥物，如干擾素、黃芪多糖等，能有效地控制病情，避免繼發(fā)感染。

[1]肖衛(wèi)華,郭田華.副豬嗜血桿菌病的診斷與治療[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)信息,2014(12):96.

[2]陸國(guó)林,何海健.副豬嗜血桿菌病的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2009,36(12):162-165.

[3]陳勇,高艷,張定全,等.副豬嗜血桿菌的分離鑒定與培養(yǎng)基篩選[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,34(10):67-71.

[4]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001:120-126.

S852.61

B

1673-4645(2017)06-0086-03

2017-02-05

劉俊琦（1984-），女，湖南永州人，碩士研究生，主要從事分子生物學(xué)與免疫學(xué)教學(xué)與研究工作，E-m ail：liujunqi215215@163.com