我國五?。ㄊ校┬←湻壑兄匾牭毒舅氐奈廴菊{(diào)查

韓小敏李鳳琴徐文靜張宏元張靖趙熙徐進(jìn)韓春卉*

（1國家食品安全風(fēng)險評估中心衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險評估重點實驗室，北京100021；2四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，四川成都610041）

我國五?。ㄊ校┬←湻壑兄匾牭毒舅氐奈廴菊{(diào)查

韓小敏1李鳳琴1徐文靜2張宏元1張靖1趙熙1徐進(jìn)1韓春卉1*

（1國家食品安全風(fēng)險評估中心衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險評估重點實驗室，北京100021；2四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，四川成都610041）

調(diào)查我國安徽省、北京市、河南省、吉林省、山東省五?。ㄊ校?58份小麥粉中單端孢霉烯族化合物和玉米赤霉烯酮（zeara l enone,ZEN）等10種重要鐮刀菌毒素的污染情況。樣品經(jīng)乙腈-水（84∶16，V∶V）提取、Mu l t i Sep 226多功能凈化柱凈化后，分別以含2 mmo l/L甲酸銨的0.1%甲酸-甲醇和含0.1%氨水-乙腈作為電噴霧正離子模式和負(fù)離子模式檢測小麥粉樣品的10種重要鐮刀菌毒素。結(jié)果顯示：我國五?。ㄊ校┬←湻垡资蹷類單端孢霉烯族化合物和ZEN的污染。其中B類單端孢霉烯族化合物以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxyniva l eno l,DON）的污染最為嚴(yán)重，超出限量標(biāo)準(zhǔn)1 000μg/kg的樣品百分比為68%（108/158），陽性樣品中DON的平均含量為4 084.8μg/kg；同時還檢出3-乙酰基-DON（3-acet y l-DON,3-A-DON）、15-乙?；?DON（15-acet y l-DON,15-A-DON）及其隱蔽型DON-3-葡萄糖苷（DON-3-g l ucoside,DON-3-G）。ZEN的超出國家限量標(biāo)準(zhǔn)的百分比為24%（38/158），平均含量為85.8μg/kg。本研究表明我國五?。ㄊ校┬←湻凼蹹ON和ZEN污染嚴(yán)重，需要加強對其的持續(xù)監(jiān)測。

鐮刀菌毒素；小麥粉；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

鐮刀菌毒素是鐮刀菌屬（Fusarium sp.）的某些種在特定條件下產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物的總稱，是造成植物萎蔫、根腐、穗腐，導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)的重要因子，同時也是人畜攝入后引起人畜中毒的重要病因[1]。據(jù)報道，鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的毒素種類多樣，目前國際上普遍關(guān)注的毒素主要包括單端孢霉烯族化合物（trichothecenes）和玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN）等。天然污染谷物和飼料的單端孢霉烯族化合物主要包括A類和B類，前者代表性的毒素有T-2毒素、HT-2毒素、二乙酰草鐮刀菌烯醇（d iacetoxyscirpenol, DAS），后者代表性的毒素有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）、雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol, NIV）及其衍生物3-乙?；?DON（3-acetyl-DON, 3-A-DON）、15-乙?；?DON（15-acetyl-DON, 15-A-DON）和其隱蔽型DON-3-葡萄糖苷（DON-3-g lucoside,DON-3-G）[2-4]。此外，某些產(chǎn)生DON的鐮刀菌在特定條件下還可產(chǎn)生具有雌激素樣作用的非固醇類有毒代謝產(chǎn)物ZEN[5]。

本課題組前期對我國2007—2008年產(chǎn)192份小麥粉的污染調(diào)查發(fā)現(xiàn)，DON及其衍生物和ZEN為污染的主要真菌毒素，88%（169/192）的小麥粉樣品中檢出DON（范圍：1.5～590.7μg/kg，中位數(shù)：30.08μg/kg），22.9%（44/192）的小麥粉樣品呈現(xiàn)ZEN陽性（范圍：1.7～3 425.0μg/kg，中位數(shù)：8.0μg/kg）[6]，其中6份樣品中ZEN含量超過我國規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)（60μg/kg）。熊凱華等[7]采用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA）和高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatog raphy,HPLC）對安徽、河南兩省小麥中DON和ZEN的測定發(fā)現(xiàn)，兩省小麥樣品中DON和ZEN的污染嚴(yán)重，兩種毒素的平均含量分別為425.5±545.6μg/kg和152.4±336.4μg/kg，分別有10.8%和38.6%的樣品中DON和ZEN含量超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)（DON：1 000μg/kg，ZEN：60μg/kg）。白艷艷等[8]發(fā)現(xiàn)廈門2013年市售散裝小麥粉中DON的檢出率為95%，高于預(yù)包裝小麥粉。

綜上可見，我國小麥粉受鐮刀菌毒素污染嚴(yán)重，但目前研究大多針對一種或兩種毒素的污染情況進(jìn)行檢測?？紤]到不同鐮刀菌毒素的毒性之間可能存在協(xié)同作用，有必要對多種鐮刀菌毒素的污染狀況進(jìn)行協(xié)同檢測。因此本試驗采用靈敏度高、特異性強、可同時對多種毒素進(jìn)行定性及定量檢測的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high-performance liquid chromatog raphy tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS）對我國五?。ㄊ校┬←湻壑?0種重要鐮刀菌毒素的污染情況進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Prom inence LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；Trip le QuadTM3500質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）；超聲波清洗器（無錫超聲電子設(shè)備廠）；自動渦旋混合器（美國Beckman公司）；純水儀（美國Millipore公司）；氮吹儀（美國Organomation公司）；多功能振蕩器（江蘇金壇醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試劑與材料

T-2毒素（濃度為100.5μg/m L）、HT-2毒素（濃度為100.4μg/m L）、3-A-DON（濃度為100.7μg/m L）、15-A-DON（濃度為101.1μg/m L）、NIV（濃度為104.4μg/m L）、鐮刀菌烯酮-X（Fusarenon X，F(xiàn)X，濃度為100.3μg/m L）、DAS（濃度為100.8 μg/m L），DON-3-G、DON和ZEN為固體標(biāo)準(zhǔn)品（奧地利Romer Labs）。

甲醇、乙腈（色譜純）均購自美國Fisher公司；甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨、氨水（色譜純）均購自美國Sigma公司；冰醋酸（分析純）購自北京化學(xué)試劑公司。MultiSep 226多功能凈化柱（奧地利Romer Labs）；0.22μm尼龍濾膜（天津津騰實驗設(shè)備有限公司）。

1.3 樣品信息

小麥粉樣品分別于2013年購自安徽省、北京市、河南省、吉林省、山東省五?。ㄊ校┑某屑稗r(nóng)貿(mào)市場，具體樣品信息見表1。

表1 小麥粉樣品信息列表

1.4 真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：取一定量真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液于棕色小瓶中，用乙腈稀釋后，制備成混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，使T-2、3-A-DON、15-A-DON、DON-3-G、NIV、FX、DAS各毒素的濃度均為10μg/m L，ZEN的濃度為5μg/m L，DON和HT-2的濃度為30μg/m L，并于-18℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

使用前將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈-水（50∶50，V/V）或空白小麥粉提取液逐級稀釋，配制成不同濃度的毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液和基質(zhì)匹配毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.5 樣品前處理

參考李鳳琴等[9]建立的方法并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，振蕩提取、過濾后取8 m L濾液，加入40μL冰醋酸（相當(dāng)于添加0.5%冰醋酸）再過MycoSep 226凈化柱進(jìn)行凈化，以提高ZEN、3-A-DON、15-A-DON等真菌毒素的回收率，其他步驟未作改動。

1.6 儀器條件

1.6.1 質(zhì)譜條件

采用電噴霧多反應(yīng)監(jiān)測（multip le reactionmonitoring,MRM）模式進(jìn)行信號采集，經(jīng)過優(yōu)化后10種重要鐮刀菌毒素的主要質(zhì)譜參數(shù)見表2。電噴霧正離子模式（electrosp ray positive ionizationmode,ESI+）和電噴霧負(fù)離子模式（elec trosp ray negative ionization mode, ESI-）的離子化電壓分別為+5 500 V和-4 500 V。ESI+與ESI-的氣簾氣、離子源溫度、噴霧氣、輔助加熱氣、碰撞氣、駐留時間等參數(shù)均相同，分別為35 psi、550℃、55 psi、50 psi、6 psi、20ms[9]。

表2 1 0種真菌毒素的主要質(zhì)譜參數(shù)

1.6.2 色譜條件

優(yōu)化后的色譜條件如下，色譜柱：Waters ACQUITY BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm）；柱溫：40℃；樣品室溫度：4℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.3m L/m in。ESI+條件下的流動相A為含2 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸溶液，流動相B為甲醇；ESI-條件下的流動相A為0.1%氨水溶液，流動相B為乙腈。ESI+洗脫程序：0～0.5m in 55%A，0.5～6m in 55%A～20%A，6～8m in 20%A～5%A，8～11m in 5% A，11～11.1m in 5%A～55%A，11.1～14m in 55%A。ESI-洗脫程序：0～0.5m in 95%A，0.5～5m in 95%A～35%A，5～6m in 35%A～5%A，6～7m in 5%A，7～7.5 m in 5%A～95%A，7.5～11.5m in 95%A[9]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0對158份小麥粉樣品中的真菌毒素含量進(jìn)行處理和統(tǒng)計分析，分別計算小麥粉樣品中10種重要鐮刀菌毒素含量的最大值、最小值、平均值、檢出率等關(guān)鍵參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 小麥粉中10種重要鐮刀菌毒素檢測的關(guān)鍵方法學(xué)參數(shù)

在保證小麥粉中各真菌毒素回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿足歐盟Comm ission Regulation（EC）No 401-2006規(guī)定的對食品中T-2、HT-2、DON、ZEN等真菌毒素的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差定量測定要求的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對測定方法進(jìn)行驗證[10]。從表3可知，小麥粉中A類單端孢霉烯族化合物（T-2、HT-2和DAS）、B類單端孢霉烯族化合物（DON、DON-3-G、3-A-DON、15-A-DON、NIV、FX）和ZEN的線性范圍分別為0.75～1 500μg/kg、0.5～1 000μg/kg和0.5～500μg/kg。小麥粉中A類單端孢霉烯族化合物、B類單端孢霉烯族化合物和ZEN的檢出限（Lim it of Determ ination,LOD,S/N≥3）和定量限（Lim it of Quantification,LOQ,S/N≥10）范圍分別為10～10.9 μg/kg和33～36μg/kg、0.4～33.1μg/kg和1.4～110.5μg/kg、12.8μg/kg和42.6μg/kg。且10種重要鐮刀菌毒素的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好，可滿足小麥粉中真菌毒素定量檢測的要求。

2.2 小麥粉中重要鐮刀菌毒素污染狀況

經(jīng)統(tǒng)計分析可知，小麥粉樣品中污染的毒素主要為B類單端孢霉烯族化合物和ZEN，所測小麥粉樣品中均未檢出A類單端孢霉烯族化合物的T-2和DAS以及B類單端孢霉烯族化合物的FX，僅來自河南省和吉林省的2個小麥粉樣品中檢出了HT-2毒素（含量均為36.6 μg/kg），且各省份樣品還被3種衍生物DON-3-G、3-A-DON、15-A-DON和NIV污染。

表3 小麥粉中真菌毒素檢測的方法學(xué)參數(shù)

表4 我國五省（市）小麥粉中DON、DON-3-G、3-A-DON、15-A-DON、NIV和ZEN的污染調(diào)查

從表4可知，在所測的158份小麥樣品中，DON的污染最為嚴(yán)重，84%（132/158）的樣品中檢出DON（陽性樣品的平均值：4 084.8μg/kg，范圍：23.5～25 375μg/kg）；其次為3-A-DON和15-A-DON，兩者的陽性率、平均污染水平分別為84%（132/158）和61%（97/158）、14.9μg/kg和14.7μg/kg；再次為DON-3-G和NIV，兩者的陽性率和平均污染水平分別為24%（38/158）和22%（35/158）、13.9μg/kg和26.9μg/kg。77%（121/158）的小麥粉樣品中檢出ZEN，其平均污染水平為85.8μg/kg，超過食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的60μg/kg的要求[11]。

從地區(qū)分布看，DON的污染嚴(yán)重程度從高到低依次為河南省（平均值：6 526.8μg/kg，范圍：23.5～25 375μg/kg）＞安徽?。ㄆ骄担? 845.3μg/kg，范圍：1 550～12 875μg/kg）＞北京市（平均值：4 457.7 μg/kg，范圍：356.3～14 875μg/kg）＞山東?。ㄆ骄担? 674.2μg/kg，范圍：157.5～10 225μg/kg）＞吉林?。ㄆ骄担? 304.4μg/kg，范圍：197.5～6 312.5μg/kg）。ZEN的污染嚴(yán)重程度從高到低依次為吉林省（平均值：115.5μg/kg，范圍：13.0～810.0μg/kg）＞山東省（平均值：100.5μg/kg，范圍：14.4～1 018.8μg/kg）＞北京市（平均值：94.4μg/kg，范圍：19.8～617.5μg/kg）＞安徽?。ㄆ骄担?5.3μg/kg，范圍：15.1～151.3μg/kg）＞河南省（平均值：64.2 μg/kg，范圍：13.9～438.8μg/kg）。

表5 中國五省（市）小麥粉DON和ZEN超標(biāo)情況分析

2.3 中國五?。ㄊ校┬←湻壑蠨ON和ZEN污染水平與中國和歐盟真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)對比分析

DON又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol），和ZEN均由鐮刀菌屬（Fusarium）真菌產(chǎn)生。人尤其是兒童如食用了被DON污染的食物可導(dǎo)致嘔吐、腹瀉等疾病[12-13]。ZEN具有一定的類雌激素作用，有研究表明ZEN可能與性早熟和宮頸癌變有關(guān)[14]。《GB 2761-2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》[11]和歐盟（EU）No 165/2010[15]中分別規(guī)定了直接供人類食用的谷物、谷物淀粉、在市場上銷售的供人類直接食用的糠（作為終產(chǎn)品）和小麥、小麥粉中DON和ZEN的限量分別為1 000μg/kg和60μg/kg（中國）、750 μg/kg和75μg/kg（歐盟）。從表5可知，68%（108/158）和70%（111/158）的小麥粉樣品中DON的含量分別超過了我國真菌毒素限量1 000μg/kg和歐盟真菌毒素限量750μg/kg的要求。24%（38/158）和16%（26/158）的小麥粉樣品中ZEN的含量分別超過了我國真菌毒素限量60μg/kg和75μg/kg的要求。

2.4 小麥粉中重要鐮刀菌毒素的相關(guān)性分析

據(jù)已有文獻(xiàn)報道，鐮刀菌屬的某些種如禾谷鐮刀菌（F.g ram inearum，其有性階段為玉米赤霉Gibberella zeae）和黃色鐮刀菌（F.culmorum）等在特定條件下可同時產(chǎn)生多種不同類型的鐮刀菌毒素，如A類單端孢霉烯族化合物、B類單端孢霉烯族化合物和ZEN[16]。因此有必要對樣品中不同真菌毒素間的相關(guān)性進(jìn)行分析。本文中采用Spearman's相關(guān)性分析對158份小麥粉樣品中10種重要鐮刀菌毒素的污染情況進(jìn)行分析，從表6可知，DON和3-A-DON、DON和ZEN、3-A-DON和NIV、ZEN和NIV的污染水平之間具有顯著相關(guān)性，即DON污染水平較高的樣品可能同時伴隨有3-ADON、ZEN的污染；ZEN污染水平較高的樣品可能伴隨有NIV的污染，提示需要關(guān)注多種真菌毒素的協(xié)同污染。本結(jié)果與DON、3-A-DON、ZEN可由同一株鐮刀菌產(chǎn)生的現(xiàn)象相吻合。

表6 中國五?。ㄊ校┬←湻壑兄匾婢舅氐南嚓P(guān)性分析

3 結(jié)論

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織報道，全球每年約有25%的農(nóng)作物被真菌毒素污染，約2%的農(nóng)作物因污染嚴(yán)重而失去營養(yǎng)和經(jīng)濟價值，造成數(shù)千億美元的經(jīng)濟損失[17]。其中鐮刀菌屬的多種真菌如禾谷鐮刀菌（Fusarium g ram inearum）、三線鐮刀菌（F.tricinctum）、梨孢鐮刀菌（F. poae）、串珠鐮刀菌（F.monilifore）產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物和ZEN等真菌毒素是引起谷物污染和人畜中毒的重要毒素。因此，世界各國建立了相應(yīng)的真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)以確保谷物的食用安全。

本試驗在前期對我國小麥樣品中真菌毒素污染調(diào)查的基礎(chǔ)上，選擇了鐮刀菌毒素污染相對嚴(yán)重的安徽省、北京市、河南省、吉林省、山東省五?。ㄊ校┑男←湻蹣悠愤M(jìn)行分析。結(jié)果表明，五省（市）小麥粉樣品DON和ZEN超標(biāo)嚴(yán)重，分別有68%（108/158）和24%（38/158）小麥粉樣品中DON和ZEN的含量超過了我國真菌毒素限量DON 1 000μg/kg和ZEN 60μg/kg的要求[11]，明顯高于熊凱華等[7]對安徽省和河南省兩省小麥粉樣品中DON和ZEN污染情況的調(diào)查，兩省樣品中有10.8%的樣品DON超標(biāo)、38.6%的樣品ZEN超標(biāo)；也顯著高于本實驗室前期對中國2008—2011年24省小麥及其制品中DON的污染調(diào)查，該調(diào)查中DON的超標(biāo)率為1.3%（9/697）[18]。

值得注意的是，本次調(diào)查中還檢出了DON及其衍生物3-A-DON和15-A-DON和其隱蔽型DON（DON-3-G），各毒素的平均污染水平和含量范圍分別為14.9μg/kg和10.6～177.5μg/kg、14.7μg/kg和13.4～23.5μg/kg、13.9μg/kg和8.7～33.3μg/kg。王偉等[19]對中國谷物制品中DON、ZEN、NIV三種毒素的膳食暴露評估研究表明，兒童對3種真菌毒素的膳食暴露量均高于成人，是膳食暴露DON、NIV和ZEN的高危人群。長期攝入DON、ZEN高污染水平的小麥粉和玉米制品對健康造成危害的風(fēng)險也較高。同時2010年4月，CAC第四屆會議同意通過了食品法典委員會提出的制定谷物及谷物產(chǎn)品中嘔吐毒素及其乙?；锏淖畲笙蘖恳?，制定DON及衍生物的限量標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)提上CAC日程[20]。提示有必要對我國現(xiàn)行的DON限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，目前最新修訂的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)將針對單一DON的檢測改為DON及其衍生物的檢測。該標(biāo)準(zhǔn)的實施將有助于推動我國食品安全真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)DON及其衍生物的制定。

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NaturalOccurrence of ImportantMycotoxins Produced by Fusarium in Wheat Flour from Five Provinces in China

HAN Xiaom in1,XUWenjing2,ZHANG Hongyuan1,ZHANG Jing1,ZHAO Xi1,XU Jin1,LIFengqin1*
(1Key Lab of Food Safety Risk Assessm ent of Ministry o f Health,China National Centre for Food Safety Risk Assessm ent,Beijing Chaoyang 100021,China;2SchoolofHuaxiPub lic Hea lth,Sichuan University,Chengdu 610000,China)

To elucidate the natural occurrence of 10 kinds of im portantm ycotoxins p roduced by Fusarium inc lud ing trichothecenes and zearalenone(ZEN)in 158 wheat flour samp les collec ted from five p rovinces Anhui,Beijing,Henan,Jilin, Shandong.Sam p les were extracted w ith acetonitrile-water(84:16,V:V)followed by c lean-up w ith MultiSep 226 multifunctionalcolumn.The electrosp ray positive ionizationmode(ESI+)and electrosp ray negative ionizationmode(ESI-)was em p loyed to acquire the signaland detect the 10 kinds of im portantmycotxins p roduced by Fusarium using the mobile phase for ESI+:0.1%form ic acid containing 2mmol/L ammonium formate-methanoland ESI-:0.1%ammonia water-acetonitrile.Results show that the wheat flour samp les collected from the five p rovinces in China were easy to be contam inated by type B trichothecenes and ZEN.DON was themostseriously contam inated type B trichothecenes and the rate for those higher than the tolerance lim it1 000μg/kg was 68%(108/158)and the average concentration for the positive samp les was 4 084.8μg/kg.At the same time,3-acetyl-DON(3-ADON)and 15-acetyl-DON(15-ADON)and the masked m ycotoxin DON-3-g lucoside(DON-3-G)were also detected in the wheat flour samp les.The rate for those higher than the tolerance lim it 60μg/kg was 24%(38/158)and the average concentration for positive sam p les was 85.8μg/kg for ZEN.The wheatsamp les collec ted from five p rovinces in China were seriously contam inated by DON and ZEN and continuouslymonitoring for thesemycotoxins is necessary.

Fusarium m ycotoxin;wheat flour;liquid chromatography tandem mass spectrometry

R155.51

A

1673-4645(2017)06-0033-07

2017-04-12

北京市自然科學(xué)基金（7163235）；科技基礎(chǔ)工作專項（2013FY113400）

韓小敏（1983-），女，副研究員

*通訊作者：韓春卉，女，主任技師，hanchunhui@c fsa.net.cn