水飛薊的基源鑒定與質(zhì)量分析

張 通，郭萬里，聶作明，周懷香，梁宗鎖，盛 清

(浙江理工大學, a.生命科學學院；b.浙江省植物次生代謝調(diào)控重點實驗室，杭州 310018)

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水飛薊的基源鑒定與質(zhì)量分析

張 通a，郭萬里b，聶作明a，周懷香a，梁宗鎖b，盛 清a

(浙江理工大學, a.生命科學學院；b.浙江省植物次生代謝調(diào)控重點實驗室，杭州 310018)

為了探究不同產(chǎn)地的水飛薊藥材是否達到藥典標準，對分別采集于內(nèi)蒙古自治區(qū)、黑龍江省和遼寧省等地10個批次的水飛薊樣品進行了檢測與分析。通過干燥法、熾灼法和熱浸法對水飛薊樣品的水分含量、灰分含量以及浸出物含量進行檢測分析，結(jié)果表明：所有批次的樣品水分含量均小于10%，灰分含量均小于9%，浸出物含量均高于18%。同時，對水飛薊進行了基源鑒定，通過性狀鑒定、顯微鑒定、DNA條形碼以及高效液相四種方法對采集到的樣品進行基源鑒定研究和比較，結(jié)果表明：四種方法均能夠鑒別中藥材水飛薊，其中性狀鑒定法更為簡便，而DNA條形碼技術和高效液相法準確性更高。

基源鑒定; 質(zhì)量檢測; DNA條形碼; 高效液相

0 引 言

水飛薊(Silybummarianum(L.) Gaertn.)又名水飛雉、奶薊子、奶薊等，為菊科水飛薊屬成員，1～2年生草本植物。原產(chǎn)于印度和巴基斯坦的喀什米爾山區(qū)，作為觀賞植物，北京植物園于1952年從英國引入[1]；而作為藥材種植，水飛薊則是由中國土產(chǎn)畜產(chǎn)進口公司天津土產(chǎn)公司于1972年從德國引進[2-3]。

水飛薊植株高約100～150 cm，莖直立，近圓柱形，具銳刺，多分枝。葉為大型羽狀或橢圓形披針狀，無葉柄，表面亮綠色，有乳白色斑紋，頭狀花序，管狀花，有紫色、白色兩種花色[4]。果實(即種子)為長橢圓形，長約5～7 mm，寬約3 mm，成熟后呈暗棕色或黑色；成熟的果實千粒重約21～27 g，水飛薊果實主要由種子胚和外皮兩部分構成，無胚乳[5]。水飛薊藥用成分水飛薊素主要存在于果實外皮(即種殼)中，含量約為殼中的3%～5%，種胚中水飛薊素較少[6-7]。

水飛薊是一種歷史悠久的天然藥物，被多國藥典所收載，臨床上常用于治療急慢性肝炎、肝硬化、肝損傷等[8]。水飛薊賓、水飛薊亭、水飛薊寧及其同分異構體構成統(tǒng)稱為水飛薊素，是水飛薊藥材的藥用成分，其藥理作用機制包括抑制人體產(chǎn)生一氧化氮、阻斷部分真菌毒素與肝細胞膜受體特異性結(jié)合以及改善肝臟細胞酶活性等[9-10]。近年來水飛薊素的應用被拓寬到癌癥的治療、抗炎和抗衰老等領域[11-12]，因此水飛薊的需求量也逐年上升。水飛薊素是目前市場上銷售的利加隆膠囊、復方益肝靈片等藥物的主要有效成分，西利賓胺和水林佳也是目前臨床治療肝炎、肝硬化和肝損傷的主要輔助藥物，其主要成分是水飛薊賓[13]。

基源鑒定即用各種方法鑒定中藥的來源物種，確定其真實性[14]；基源鑒定是中藥研究的基礎，也是中藥研究學的首要任務。性狀鑒定是最基礎的中藥材基源鑒定方法，是根據(jù)藥材的形狀、顏色、大小、氣味等特征對藥材進行鑒定的方法，因其簡潔、快速的特點至今仍被廣泛應用。顯微鑒定是利用觀察顯微切片的結(jié)構和特征來確定藥材的來源物種，這種方法對于結(jié)構不同的物種十分有效。理化鑒定，則是利用物理的、化學的方法或分析儀器來確定藥材的真實性，常用的方法有薄層色譜法、紫外光譜法、高效液相法等，其中高效液相法既能夠用于藥材的基源鑒定還能夠用于評價質(zhì)量，并能夠準確檢測中藥中有效成分或標志性成分及其含量。DNA條形碼是利用基因組中一段公認的、較短的序列進行物種鑒定的一種分子技術，陳士林等建立的以ITS2為主，PsbA-trnH為輔的植物中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)快速、準確而有效，備受歡迎，其“中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則”已被2015版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱“中國藥典”)所收錄[15]。本文結(jié)合中國藥典、美國藥典及中藥材常用的鑒定方法對采集到的樣品進行基源鑒定和質(zhì)量分析，為水飛薊進一步的分子和藥理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

10個批次的水飛薊樣品于2014年7月中旬和2015年7月中旬分別采集自遼寧省的盤錦市和海城地區(qū)，黑龍江省虎林市的云山農(nóng)場以及呼瑪縣地區(qū)，內(nèi)蒙古自治區(qū)的海拉爾縣地區(qū)、呼倫貝爾市的綽爾河農(nóng)場以及牙克石農(nóng)場，樣品編號、采集重量、采集時間和采集地點如表1所示。所有樣品在37 ℃干燥至恒重保存于4 ℃冰箱中。

表1 樣品采集地點及編號

1.2 質(zhì)量檢測分析

采用《中國藥典》的方法[16]對水飛薊進行質(zhì)量檢測分析，具體過程如下：

水分含量的測定：用分析取水飛薊樣品2～4 g，置于40 mm×25 mm扁形稱量瓶中，并打開瓶蓋放置于真空干燥箱中，設置干燥箱溫度為105 ℃，干燥5 h，待冷卻后，稱重；再在上述樣品至于真空干燥箱中干燥1 h后稱重，若兩次稱重差異不超高5 mg，則依據(jù)減失的重量計算水飛薊中的含水量，若稱重差異超過5 mg，則繼續(xù)放入干燥箱中干燥，直至減失重量的差異不超過5 mg，計算水飛薊樣品中水分的含量。

灰分含量的測定：將水飛薊樣品粉碎通過24目篩子后，精密稱定水飛薊樣品2～3 g，置于高溫爐中，緩緩加熱，提升溫度至600 ℃左右，使水飛薊樣品完全灰化至恒重。根據(jù)剩余的水飛薊殘渣重量，計算水飛薊樣品中總灰分的含量。

浸出物含量的測定：取水飛薊樣品3 g，置于含有100 mL乙醇的250 mL容量的錐形瓶中稱取樣品重量；靜置0.5～1.0 h后，加熱錐形瓶，連續(xù)回流冷凝管并保持微沸1.0 h，關閉加熱套，待放冷后再次稱取樣品重量；用水補足減失的重量，用干燥器濾過，取濾液25 mL置于干燥的揮發(fā)皿中，用80 ℃水浴蒸干后，干燥3.0 h，迅速稱定重量，以干燥品計算水飛薊樣品中浸出物的含量。

1.3 基源鑒定

1.3.1 性狀鑒定

隨機從各個批次的水飛薊樣品中選取20粒種子用游標卡尺測量種子的長度和寬度，計算平均值和標準差。千粒重：隨機從每個批次樣品中選取1000粒用分析天平稱量，重復5次，計算平均值和標準差。同時，觀察并記錄不同批次樣品種子的形狀、大小和色澤等。

1.3.2 顯微鏡鑒定

從每個批次的樣品中隨機挑取5～10粒種子，用溫水浸泡3.0 h后切片，用毛筆將切好的種子橫剖面挑入盛有清水的培養(yǎng)皿中，挑取完整的薄的橫剖面制片，置于顯微鏡下觀察。

1.3.3 DNA條形碼鑒定

水飛薊DNA條形碼鑒定采用ITS2序列[17]進行鑒定。具體過程如下：水飛薊DNA的提取將0.3 g的種子樣品通過外力磨碎，加入DNA Wash Buffer(Ascorbic acid、citric acid、PVP、HEPES free acid配制)1 mL清洗兩次，棄去上清；加入1 mL DNA plant zol:β-巰基乙醇(24∶1)溶液1 mL，充分混勻，置于65 ℃水浴鍋45 min，每15 min混勻一次；加入750 mL氯仿，混合均勻離心取上清；上清液加入適量體積的異丙醇混勻，離心棄去上清；加入75%乙醇對DNA進行清洗，然后將所得到的DNA溶解至0.1 mmol/L進行PCR反應。PCR反應：ITS2序列正向引物：5′-ATGCGATACTTGGT GTGAAT-3′，反向引物：5′-GACGCTTCTCCAG ACTACAAT-3′； 擴增程序為：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s， 56 ℃、30 s，72 ℃、45 s， 40 個循環(huán)；72 ℃、10 min。rTaq酶試劑盒由Takara公司提供，PCR反應以25 μL為參照，包括1×Buffer，0.2 mmol/L dNTPs，0.1 mmol/L引物對和提取的DNA，0.5 μL rTaq酶，ddH2O至25 μL進行在PCR儀進行反應。用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測，并且將所有的有條帶的樣品PCR擴增產(chǎn)物送到測序公司測序。采用MEGA軟件對測序的結(jié)果進行拼接獲得相應的DNA序列，將序列在中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)中進行物種鑒定，確定序列相似性最高的物種。

1.3.4 高效液相法鑒定

水飛薊素標準溶液制備：精密稱取水飛薊提取物粉末標準品7 mg(溶于2 mL甲醇中，20 min超聲處理，用甲醇稀釋到0.7 mg/mL；通過0.45 μm的濾膜過濾去除雜質(zhì)；稀釋5倍獲得0.14 mg/mL的水飛薊提取物粉末標準品溶液。

水飛薊賓標準溶液的制備：精密稱取水飛薊賓標準品1 mg溶于2 mL的甲醇中，再分別稀釋制備成0.500、0.100、0.020、0.004、0.002 mg/mL的水飛薊賓標準溶液，20 min超聲處理；通過0.45 μm的濾膜過濾去除雜質(zhì)。

標準曲線的制作：根據(jù)水飛薊賓5個濃度的標準品溶液，每個濃度的溶液進樣3次，記錄峰面積，以每個峰面積的平均值x為橫坐標，水飛薊賓標準品溶液的濃度(mg/mL)y為縱坐標，進行線性回歸。

樣品溶液的制備的方法參考索氏萃取法[18]，具體過程如下：取約10 g充分研磨的水飛薊粉末精密稱定并置于一個連續(xù)回流的提取套管中，用小棉球塞住冷凝管的上端，將套管裝入250 mL的圓底燒瓶中(內(nèi)含150 mL的正己烷)，加熱4 h除去脂類成分；把裝有正己烷的圓底燒瓶從提取套管分離，棄去正己烷溶液，干燥萃取套管除去附著的正己烷；再將套管裝入配有 250 mL圓底燒瓶(內(nèi)含100 mL乙酸乙酯) 的連續(xù)提取器中，保持微沸，使溶劑輕輕回流。8 h后，把提取物定量轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，添加甲醇至刻度作為樣品儲備溶液。取出1 mL樣品儲備溶液用甲醇稀釋25倍即得到樣品溶液。

表2 HPLC流動相配比及洗脫時間

注：檢測波長：UV288 nm；色譜柱：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；流速：1 mL/min；上樣量：10 μL；流動相：溶液B：V甲醇∶V磷酸∶V水=20∶0.5∶80，溶液D：V甲醇∶V磷酸∶V水=80∶0.5∶20。

2 結(jié)果與分析

2.1 水飛薊的水分、灰分和浸出物含量測定

2015版中國藥典中關于藥材水飛薊的規(guī)定為：水分含量不得超過10%，灰分含量不得高于9%，浸出物含量不得低于18%[16]。不同產(chǎn)地水飛薊的水分、灰分、浸出物的含量測定結(jié)果如圖1所示。水分含量最高的藥材來自遼寧海城，達到7.065%，灰分含量最高的藥材來自于黑龍江云山農(nóng)場，達到5.306%，浸出物含量最高的藥材來自于遼寧海城，達到30.844%。圖1結(jié)果表明：所有產(chǎn)地水飛薊藥材的水分含量均低于10%，灰分含量均低于9%，而浸出物的含量則遠遠高于18%，符合中國藥典的規(guī)定。

圖1 不同產(chǎn)地水飛薊藥材的水分、灰分及浸出物含量

2.2 基源鑒定

2.2.1 性狀鑒定

中國藥典中關于水飛薊的性狀描述為：呈長倒卵形或橢圓形，長5～7 mm，寬2～3 mm，表面淡灰棕色或黑褐色，光滑，有細縱花紋，頂端鈍圓，稍寬，有一圓環(huán)，中間具花柱殘跡，基部略窄[16]。通過實驗測量得到水飛薊樣品的形狀、大小、色澤等性狀特征，并與中國藥典的描述進行比較確定其真實性，如圖2所示。

從圖2可以看出，水飛薊藥材的形狀呈現(xiàn)橢圓形，頂端稍寬，可以清晰地看到花柱殘跡的圓環(huán)，底部比頂端略窄，藥材顏色可分為三種：黑褐色、棕色及灰白色，有縱細花紋貫穿于種皮之上。由表3可以看出，10個批次水飛薊藥材樣品的寬度在2.85～3.50 mm之間，長度在6.40～7.50 mm之間，種子的千粒重在22～28 g之間，通過與藥典描述比較發(fā)現(xiàn)，樣品的形狀和顏色與藥典的規(guī)定完全吻合，但樣品的大小較藥典的規(guī)定稍大，分析后認為樣品的大小與藥材的品質(zhì)優(yōu)劣有關，但不影響性狀鑒定的結(jié)果，因此以上性狀可以作為水飛薊基源鑒定的依據(jù)。

圖2 不同產(chǎn)地水飛薊藥材樣品

編號長度/mm寬度/mm千粒重/gHC-13.15±0.4576.88±0.65825.642±0.77PJ-22.85±0.5386.64±0.32522.556±1.31PJ-33.25±0.2217.16±0.49322.588±0.25YKS-43.35±0.3947.09±0.50923.872±0.58YS-53.38±0.4777.01±0.32126.814±0.31CEH-63.32±0.7197.17±0.87827.972±0.37HLE-73.14±0.6446.93±0.24624.846±0.36HLE-83.20±0.3396.97±0.13322.697±0.83HLE-93.37±0.3037.38±0.34125.026±0.44HM-102.90±0.4416.44±0.43122.574±0.45

2.2.2 顯微鑒定

美國藥典規(guī)定的水飛薊的顯微鑒定的依據(jù)為：水飛薊果壁表皮由無色柵欄細胞構成，無色柵欄細胞與表皮垂直排列，具有加厚的外側(cè)細胞壁，并有裂縫狀腔深入其內(nèi)[18]。通過顯微鏡對樣品的顯微結(jié)構進行觀察和分析，結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3 熒光顯微鏡下的水飛薊種皮

圖3為圖4中樣品PJ-2的放大圖，通過圖3可以清晰地看到外側(cè)細胞壁、裂縫狀的腔以及無色柵欄細胞。不同顏色的種子的外側(cè)細胞壁細胞顏色不同，其中黑褐色種子的外側(cè)細胞壁細胞顏色深，表明含有更多的色素，棕色種子的外側(cè)細胞壁顏色較淺，色素含量少，而灰白色種子的外側(cè)細胞壁為無色，不含色素，裂縫狀的腔排布在外側(cè)細胞壁內(nèi)側(cè)與無色欄珊細胞相接與美國藥典描述的性狀一致。

圖4 各產(chǎn)地水飛薊熒光顯微鏡下的種皮

2.2.3 DNA條形碼鑒定

DNA條形碼技術是通過比較一段通用的DNA序列，對樣品的物種進行鑒定的方法[17]。圖5為水飛薊藥材ITS2序列的PCR電泳圖，10個批次的樣品都成功擴增目的片段，將PCR產(chǎn)物送往生物公司測序。

圖5 水飛薊樣品PCR電泳圖

水飛薊ITS2序列長度在214和216 bp之間，平均GC含量為63.08%，在154 bp處容易發(fā)生CT突變，而在178、189和201 bp處容易產(chǎn)生缺失。并將所有樣品的ITS2序列輸入到中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(http://www.tcmbarcode.cn/china/)或在GenBank數(shù)據(jù)庫中BLAST進行同源性標記，得到的序列相似性最高的物種均為水飛薊，序列相似性為100%。將所有樣品的ITS2序列與GenBank上數(shù)據(jù)庫與水飛薊相似性達到90%的序列構建NJ進化樹分析，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明：水飛薊和其他薊屬的近源物種分別聚為一支，因此ITS2序列可以作為DNA條形碼鑒別水飛薊及其混偽品。

2.2.4 高效液相法鑒定

通過比較水飛薊素標準品液相色譜圖(圖7中1號曲線)和樣品提取物色譜圖(圖7中2號曲線)發(fā)現(xiàn)，樣品提取物每一種成分與水飛薊素標準溶液的相對保留時間是一致的，其中a峰為水飛薊亭，b峰為水飛薊寧，c峰為水飛薊賓A，d峰為水飛薊賓B，e峰為異水飛薊賓A，f峰為異水飛薊賓B，g峰為脫氫水飛薊賓，從圖6可以清晰地看到樣品中每一種成分的色譜峰，通過水飛薊賓標準品標準曲線(圖8)，y=5×10-8x，其中X軸表示通過高效液相測得的峰面積，Y軸表示成分的含量，只要將實驗測得的數(shù)據(jù)即某種成分的峰面積代入標準曲線方程就可以計算出這種成分含量，因此該方法可以作為基源鑒定的依據(jù)，還可以運用此方法測定水飛薊藥材中各種有效成分的含量。

3 討 論

水飛薊作為一種集具藥用價值和觀賞價值的經(jīng)濟作物，在我國種植面積非常廣泛，已經(jīng)成為藥農(nóng)增加收益的選擇之一。近年來隨著水飛薊抗腫瘤活性研究的逐漸深入，市場對于藥材水飛薊的需求量也越來越多，因此建立一套快捷、有效的水飛薊的鑒別方法與質(zhì)量檢測體系已經(jīng)迫在眉睫。本文通過干燥法、熾灼法和熱浸法對不同產(chǎn)地的水飛薊藥材的水分、灰分和浸出物進行檢測，通過與中國藥典[16]的標準進行比較，檢測這些水飛薊樣品是否符合要求。水分、灰分和浸出物作為評價藥材質(zhì)量的重要指標，往往被忽略，然而這些指標成分對于藥材的質(zhì)量和療效具有重要的作用。

圖6 基于ITS2序列構建的水飛薊及其它薊屬植物的NJ樹

1.標準品； 2.樣品圖7 水飛薊素高效液相色譜比較

圖8 水飛薊賓的標準曲線

中藥材品種的混亂及真?zhèn)舞b定方法的欠缺嚴重影響中醫(yī)藥的療效與安全，對于傳統(tǒng)的中藥材基源鑒定方法，性狀鑒定法快速簡便，實用性強，但是準確性不足，容易出錯；顯微鑒定對于區(qū)別不同科屬的植物有著強大的優(yōu)勢，但是對于區(qū)別水飛薊的親緣物種時有一定的難度[14]；高效液相法準確很高，但是對于設備要求比較高，如果想要進一步檢測水飛薊中各種藥效成分的含量，如水飛薊賓、水飛薊亭、水飛薊寧的含量，可以采用高效液相法，既能夠準確地對藥材進行鑒定又能夠檢測藥效成分；DNA條形碼技術作為一種新的分子鑒定技術，因其準確性高，簡便易行的特點，已被廣泛應用于多種中藥材及藥用植物的鑒定中，如冬蟲夏草的鑒定[19]、前胡的鑒定[20]等。本文通過上述四種方法對采集到的水飛薊樣品進行了基源鑒定研究，各種方法的操作過程及步驟已在文中說明，這對于人們選擇一套合適的中藥材基源鑒定方法具有參考意義。目前中藥的安全問題已成為制約中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展和獲得國際認可的“瓶頸”，其中如何對藥材進行基源鑒定對于解決這一問題有著重要意義。

4 結(jié) 論

本文通過干燥法對不同產(chǎn)地的水飛薊樣品的水分進行檢測，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的水飛薊樣品均達到藥典規(guī)定的標準，對于保持中藥材水飛薊中有效成分的藥效和長時間儲存具有重要的意義。通過熾灼法檢測水飛薊樣品中的灰分含量發(fā)現(xiàn)，所有批次的樣品的灰分含量均低于9%(中國藥典的標準)，能夠確保水飛薊的品質(zhì)。浸出物含量是中藥材質(zhì)量控制重要指標之一，本文通過熱浸法對水飛薊的浸出物含量進行了檢測，發(fā)現(xiàn)所有批次的樣品均遠遠超過藥典規(guī)定的標準，對于制藥企業(yè)選購水飛薊藥材用于生產(chǎn)實踐具有重要的意義。本文對采集自東北地區(qū)7個產(chǎn)地的水飛薊樣品采用四種方法進行基源鑒定，對于鑒別不同來源的中藥材的品質(zhì)非常重要。不同品種的中藥材的最適鑒定方法也不同，本文開展的水飛薊基源鑒定對于中藥材鑒定的方法選擇具有借鑒意義。

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(責任編輯： 唐志榮)

Source Identification and Quality Analysis ofSilybumMarianum(L.) Gaertn. from Different Areas of Origin

ZHANGTonga,GUOWanlib,NIEZuominga,ZHOUHuaixianga,LIANGZongsuob,SHENGQinga

(a. College of Life Science; b. Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation of Zhejiang Province，Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018; China)

To explore whetherSilybummarianum(L.)Gaertn. in different producing area reaches the pharmacopoeia criterion, 10 batches ofSilybummarianum(L.)Gaertn. collected from Inner Mongolia, Heilongjiang and Liaoning Province were detected and analyzed respectively. The moisture content, ash content and extractive content of the samples were detected by drying method, burning method and hot dipping method. The results show that the water content of all samples is less than 10%; the ash content is less than 9% and the content of extract is higher than 18%. Besides, source identification was carried out for the samples by four methods including character identification, microscopic identification, DNA barcoding and high performance liquid chromatography(HPLC). The results indicate that the four methods can identifySilybummarianum(L.)Gaertn. Character identification method is simpler, while DNA barcoding technique and HPLC present higher accuracy.

source identification; quality inspection; DNA barcoding; HPLC

10.3969/j.issn.1673-3851.2017.05.025

2016-11-30 網(wǎng)絡出版日期： 2017-04-25

國家自然科學基金青年科學基金項目(81373908)

張 通(1992-)，男，河南南陽人，碩士研究生，主要從事藥用植物分子方面的研究。

盛 清，E-mail：csheng@zstu.edu.cn

Q946.82

A

1673- 3851 (2017) 03- 0467- 08