乳腺癌癌癥干細胞的特異基因識別

郭鵬飛,賀平安

(浙江理工大學理學院，杭州 310018)

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乳腺癌癌癥干細胞的特異基因識別

郭鵬飛,賀平安

(浙江理工大學理學院，杭州 310018)

乳腺癌是一種嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤，癌癥干細胞假說的提出為乳腺癌的起因以及治療提供了新的模型。對746個乳腺癌樣本中的18409個基因和1035個miRNAs，通過生物信息學方法構建共表達網絡，將其劃分到不同的共表達模塊中；利用胚胎干細胞和間充質干細胞的特性進一步篩選模塊，得到兩個大小分別為2019和859且與上述兩類干細胞相關的基因集；最后通過構建這兩個基因集的調控網絡，篩選出兩個胚胎干細胞的特異性關鍵基因TPX2和MCM10，以及間充質干細胞的特異基因COL5A2。這些基因可以作為癌癥干細胞的候選特異性標志物，有望成為潛在的乳腺癌治療標靶。

乳腺癌；胚胎干細胞；間充質干細胞；基因調控網絡；關鍵基因

0 引 言

乳腺癌是全世界女性最常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率占女性全身其他惡性腫瘤的10%左右。據(jù)統(tǒng)計，每年約有120萬新發(fā)乳腺癌病例，乳腺癌已成為女性發(fā)病率最高的癌癥[1]。隨著醫(yī)學的發(fā)展和治療手段的進步，乳腺癌患者的生存率已經得到很大改善，但它的耐藥性以及預后復發(fā)等問題依然困擾著許多研究者。

癌癥干細胞假說認為癌癥是由一小群癌癥干細胞造成的，即癌癥干細胞是癌癥異常增殖、侵襲、轉移、耐藥以及復發(fā)等的根源。Wicha等[2]利用不同的細胞表面標記物對細胞進行標記，驗證了乳腺癌中存在著癌癥干細胞，這為癌癥干細胞的研究提供了堅實基礎。此后，Takebe等[3]研究發(fā)現(xiàn)Notch、Hedgehog (HH) 和Wnt等細胞通路在癌癥干細胞的致癌方面起著至關重要的作用，并對通過抑制這些通路從而控制干細胞復制、存活和分化這一新治療策略進行了研究。

此外，許多研究者從基因層面研究癌癥干細胞涉及到的相關生物過程。Xu等[4]研究發(fā)現(xiàn)miR-214在調控卵巢癌干細胞性質方面起著至關重要的作用，并且miR-214可作為治療卵巢癌的潛在的治療靶標。Li等[5]研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs, lncRNAs)能夠抑制其標靶mRNA在膠質母細胞瘤干細胞(glioblastoma stem cells, GSCs)中分化，并利用這種方法識別出一些可用來治愈GSCs的候補lncRNAs。此外，Kalamohan等[6]應用加權的基因共表達網絡分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)和富集度分析的方法分析胃癌的mRNA數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)胃癌的兩種亞型分別與不同的干細胞特征相關。

以上研究表明，癌癥干細胞假說能更好地解釋癌癥的起源，并指導癌癥治療。本文基于以上研究的成果，利用多種生物信息學方法分析現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中乳腺癌的基因表達譜數(shù)據(jù)，期望可以辨別出某些與癌癥干細胞相關的關鍵基因。該研究結果有助于人們更好地理解乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制。

1 數(shù)據(jù)和方法

1.1 數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)預處理

本文研究的乳腺癌的miRNASeq、RNASeqV2數(shù)據(jù)以及乳腺癌患者的臨床數(shù)據(jù)，均下載于The Cancer Genome Atlas (TCGA)數(shù)據(jù)庫，其中RNASeqV2和miRNASeq數(shù)據(jù)是分別通過RNA測序和miRNA測序得到的樣本的基因表達和miRNA表達數(shù)據(jù)。

由于某些miRNAs可以通過調控基因表達進而參與調控細胞分化和癌癥生成等重要生命過程，故本文合并兩種數(shù)據(jù)用于研究分析。首先，如果某個基因或miRNA在超過50%的樣本中其原始數(shù)據(jù)缺失，則將該基因或miRNA刪除；然后使用LIMMA package[7]將處理過的基因和miRNAs原始數(shù)據(jù)轉化為基因表達值，并將二者合并；最后使用反分位數(shù)歸一化(inversely normalize)的方法處理合并的基因表達數(shù)據(jù)，使其處于同一水平進行后續(xù)分析。經過預處理后得到一個由746個乳腺癌樣本中的18409個基因和1035個miRNAs的表達值構成的數(shù)據(jù)集D=(dij)19444×746，其中dij表示第i個基因在第j個樣本中的表達值。

另外，從The Gene Expression Omnibus (GEO)數(shù)據(jù)庫下載了胚胎干細胞(GSE29625)和間充質干細胞(GSE28974)的mRNA表達譜數(shù)據(jù)。

1.2 構建基因共表達網絡

WGCNA算法[8]是一種從表達譜數(shù)據(jù)中挖掘模塊(module)信息的算法。在該算法中模塊被定義為一組具有類似表達譜的基因，即如果某些基因在一個生理過程或不同組織中總是具有相類似的表達變化，則將其定義為一個模塊。

(1)

(2)

(3)

另外考慮到基因i可以通過基因μ與基因j相互作用，故將鄰接矩陣被轉換成拓撲矩陣Ω=(wij)，其中：

(4)

這里lij=∑uaiuauj，表示與基因i、j都相鄰的基因μ之間的鄰接系數(shù)乘積和；ki=∑uaiu為基因i單獨連接的節(jié)點的鄰接系數(shù)的和。

理論上，胚胎干細胞和間充質干細胞在原發(fā)性腫瘤，以及癌細胞的循環(huán)過程和轉移器官中都可以檢測到。因此本文選擇這兩種干細胞為代表通過基因集的富集度分析[9]，查找與癌癥干細胞相關的基因。為此，從MSigDB(molecular signatures database)數(shù)據(jù)庫[10]下載了15個與胚胎干細胞特性相關的基因集以及10個跟間充質干細胞特征相關的基因集，作為背景基因進行富集度分析。

基因集的富集度分析基于超幾何分布，服從超幾何分布(k-1,K,N-K,n)的概率p可通過式(5)來計算：

(5)

其中：n表示模塊中基因的個數(shù)；K表示與胚胎干細胞特性相關的基因集或者跟間充質干細胞特征相關的基因集中基因的個數(shù)；k和N分別為上述模塊和基因集的交集和并集中基因的個數(shù)。錯誤發(fā)現(xiàn)率[11](false discovery rate,FDR)用于評價基因模塊是否富集于與兩種干細胞相關的基因集。

1.4 優(yōu)化與癌癥干細胞相關的基因集

通過基因集的富集度分析得到兩個分別與胚胎干細胞和間充質干細胞相關的基因集，為了優(yōu)化這兩個基因集，本文應用多尺度嵌合基因共表達網絡分析(multiscale embedded gene co-expression network analysis, MEGENA)算法[12]對二者重新進行精確分類。

MEGENA算法首先計算任意兩個基因之間的相關性，并依據(jù)相關性的大小對基因對排序；接著通過平面最大過濾圖算法(planar maximally filtered graph , PMFG)將其嵌入拓撲網絡，從而構建平面濾波網絡(planar filtered networks, PFNs)；然后通過最短路徑距離、本地路徑索引和整體模塊性三個標準對最初的PFNs進行多次迭代處理，得到更精確的分類。

1.5 基因表達的調控網絡的建立

隨機森林算法[13]是一種基于決策樹模型的算法，它主要通過一個重要性評分矩陣來推斷調控網絡。相比于其他構建調控網絡的方法，隨機森林算法可以得到一個有向的調控網絡，使得基因間的調控關系更加明確。故本文利用隨機森林算法在與癌癥干細胞相關的基因集中構建基因調控網絡。

隨機森林算法將預測n個基因間的調控網絡的問題轉化為求解n個不同的回歸問題。首先選取一個基因作為靶基因(因變量)，其余n-1個基因作為輸入基因(自變量)，做回歸分析預測靶基因。每個輸入基因在預測靶基因過程中計算相應的變量重要性評分(variable importance measure，VIM)，并以此作為推定基因間調控關系的指標。將得到的所有靶基因與輸入基因之間的調控關系依據(jù)其大小排序，從而構造調控網絡。本文用R語言中的randomForest package[14]構建有向的基因調控網絡，同時用Cytoscape軟件[15]實現(xiàn)基因調控網絡的可視化。

在有向的基因調控網絡中，基因的頂點出度是以該點為起點的邊的個數(shù)。本文根據(jù)基因的頂點出度的大小篩選與癌癥干細胞相關的關鍵基因。

1.6Kaplan-Meier生存分析

生存分析是將事件的結果和出現(xiàn)這一結果所經歷的時間結合起來分析的一種統(tǒng)計分析方法[16]。Kaplan-Meier生存分析將乘積極限法應用于臨床數(shù)據(jù)中樣本生存或死亡這兩種狀態(tài)所對應的生存時間，從而計算出樣本的生存率及其標準誤差。然后利用log-rank檢驗來比較兩組或多組生存率，并通過p-value來評價不同組的生存率是否相同。

對得到的關鍵基因，本文通過構建Kaplan-Meier生存曲線來驗證它們對乳腺癌的重要性。

2 結 果

2.1 表達數(shù)據(jù)的聚類分析

利用WGCNA算法，輸入數(shù)據(jù)集D中的數(shù)據(jù)，首先計算任意兩個基因之間的皮爾森相關性系數(shù)得到相關性矩陣。接著通過無尺度網絡原則確定β。如圖1所示，當β=5時R2= 0.8220，因此本文選擇β=5作為加權系數(shù)將相關性矩陣轉化為鄰接矩陣。最后利用節(jié)點的相異程度進行分層聚類，結果746個乳腺癌樣本中的18409個基因和1035個miRNAs被聚類到47個不同的模塊中。47個模塊分別被記作M1—M47，并且每個模塊的大小從33到2598數(shù)目不等。由于這些共表達基因傾向于功能相關的，故這種聚類方式也意味著乳腺癌的轉錄組包括47個不同或相關的生物過程。而這些生物過程有助于研究乳腺癌中的分子機制和關鍵性驅動因子，因此這些模塊值得深入研究[6]。

圖1 加權系數(shù) β的選取

2.2 識別與胚胎干細胞和間充質干細胞相關的模塊

將WGCNA算法得到的模塊和MSigDB數(shù)據(jù)庫中下載的與兩種干細胞特性相關的基因集作為輸入數(shù)據(jù)進行富集度分析，本文以FDR<0.05為標準來確定結果。

在與胚胎干細胞特性相關的基因集的富集度分析結果中，有8個基因模塊與胚胎干細胞特性相關，它們分別是M1—M8，具體結果見表1。另一方面，有6個模塊富集于間充質干細胞，分別為M2、M5、M6、M8、M9和M10，其結果如表2所示。

表1 與胚胎干細胞性質相關的模塊的富集度分析結果

表2 與間充質干細胞特征相關的模塊的富集度分析結果

在表1和表2中，第一列和第二列分別表示模塊及其大小，第四列是每個模塊與從MSigDB數(shù)據(jù)庫中得到的任一基因集進行一次富集度分析得到的FDR值，第三列是根據(jù)FDR的值從小到大的排序，第五列是每個基因模塊中富集于MSigDB數(shù)據(jù)庫中的基因集。

為了進一步分析這些基因，本文將與胚胎干細胞性質相關的8個模塊合并成一個基因集E1，內含5751個基因；同時將富集于間充質干細胞的6個模塊合并成一個基因集E2，內含3441個基因。

2.3 分別確定與胚胎干細胞和間充質干細胞相關的基因集

在WGCNA算法的結果中，有4個模塊M2、M5、M6、M8同時富集于胚胎干細胞和間充質干細胞，這使得基因集E1和E2中包含許多相同的基因。為了優(yōu)化上述兩個基因集，本文對這些基因模塊作如下處理：

首先，合并兩個基因集E1和E2得到新的基因集E3，它包含6102個基因。對于E3中的基因，根據(jù)由乳腺癌樣本中基因和miRNAs的表達值構成的數(shù)據(jù)集D構造它的一個子矩陣D1=(dij)6102×746。使用MEGENA算法對該數(shù)據(jù)重新分類得到新的模塊，并對新的模塊進行基因集富集度分析，重新篩選出與兩種干細胞相關的模塊，最后合并模塊得到新的與兩種干細胞相關的基因集。在這一過程中，本文得到兩個基因個數(shù)分別為2009和572的且與胚胎干細胞和間充質干細胞相關的基因集F1和F2。

其次，對基因集E1中的基因，重復上述過程，得到分別由1824和802個基因構成的與胚胎干細胞和間充質干細胞相關的基因集F3和F4，并且F3和F4無交集。

然后，對基因集E2中的基因，重復上述過程，得到兩個分別與胚胎干細胞和間充質干細胞相關的無交集基因集F5和F6，其大小分別為57和386。

最后，取F1、F3和F5的并集，得到一個包含2019個與胚胎干細胞相關的基因集G1；取F2、F4和F6的并集，得到一個大小為859的與間充質干細胞相關的基因集G2。而且新得到的基因集G1和G2沒有交集。表3—表4為上述三組數(shù)據(jù)利用MEGENA算法分類后，新的模塊進行富集度分析的結果。

表3 MEGENA算法分類與胚胎干細胞性質相關的模塊的富集度分析結果

表4 MEGENA算法分類與間充質干細胞特征相關的模塊的富集度分析結果

2.4 驗證基因集G1和G2

為了進一步驗證上述過程得到的兩個與胚胎干細胞和間充質干細胞相關的基因集。首先合并從GEO數(shù)據(jù)庫下載的癌癥胚胎干細胞(GSE29625)和間充質干細胞(GSE28974)的mRNA表達譜數(shù)據(jù)，然后分別使用分位數(shù)歸一化[17]和反分位數(shù)歸一化的方法處理合并后的數(shù)據(jù)，最終得到一個由10195個基因構成的基因表達數(shù)據(jù)T1=(tij)10195×24，這里tij為第i個基因在第j個樣本中的表達值。T1用于驗證上述過程得到的兩個與胚胎干細胞和間充質干細胞相關的基因集G1和G2。

圖2(a)是由與胚胎干細胞相關的基因集G1在數(shù)據(jù)T1中的表達值構成的熱圖，圖中每個小方格表示一個基因在樣本中的表達量，顏色表示表達量的大小。其中首字母為E的是GSE29625中的樣本，首字母為M的是GSE28974中的樣本。圖中結果表明該基因集的大部分基因在整合數(shù)據(jù)中的GSE29625樣本中具有顯著的高表達，在GSE28974樣本中具有顯著的低表達。類似地，圖2(b)是由與間充質干細胞相關的基因集在整合數(shù)據(jù)T1中的表達值構成的熱圖。該基因集中的大部分基因在整合數(shù)據(jù)中的GSE28974樣本中具有顯著的高表達。

圖2 與胚胎干細胞相關的基因集和與間充質干細胞的基因集在兩種干細胞的整合數(shù)據(jù)中的表達模式

基因集G1和G2在整合數(shù)據(jù)T1中的不同表達模式表明二者與兩類干細胞具有明顯的相關性，進一步說明使用本文方法得到的結果具有較強的可靠性。

2.5 構建基因調控網絡

對與胚胎干細胞相關的基因集G1中的2019個基因，利用其在數(shù)據(jù)集D中的表達值，使用R語言中的randomForest package[14]構建它們的調控網絡。隨機森林算法中最重要的參數(shù)有兩個：一個是建立決策樹的個數(shù)，本文取1000；另一個是每個節(jié)點可選擇的候選輸入基因個數(shù)，在本文中該參數(shù)取全部輸入基因數(shù)的平方根。

利用多重假設檢驗，求出重要性評分矩陣的每一個值的FDR值，首先取FDR<0.01的邊來控制調控網絡的大小，得到一個包含53298條邊的調控網絡。圖3是由此網絡中全部基因之間的VIM值繪制的直方圖，從圖中可以看出大部分基因間的重要性評分值小于0.01。為了進一步控制調控網絡的規(guī)模，本文僅選取基因之間的重要性評分值大于0.01的邊。最后得到了一個含有15720條邊的有向調控網絡。

圖3 53298個基因對的 VIM值的頻率分布直方圖

在構造的有向調控網絡中，如果一個基因同時調控多個基因，那么它肯定在某個生物過程中起重要作用，所以文本重點關注那些處于調控關系上游的基因。本文使用R語言中的igraph package[18]計算網絡中每個頂點的出度，并根據(jù)其大小進行排序。在這個有向調控網絡中，TPX2、MCM10、CEP55、BUB1、NCAPG、NCAPH和BUB1B等基因有較大的頂點出度，具體結果如表5所示。特別是TPX2和MCM10這兩個基因調控下游基因的個數(shù)都超過110，所以本文認為這兩個基因是與胚胎干細胞相關的關鍵基因。圖4(a)—(b)是以基因TPX2和MCM10為核心，以及它們調控的基因之間的調控關系構成的調控子網絡。為了顯示清晰，該調控子網絡中僅畫出了VIM值大于0.02的邊。

表5 基因集G1調控網絡中Top12基因的頂點出度

對于包含859個與間充質干細胞相關的基因集G2，本文重復同樣的過程。結果發(fā)現(xiàn)，在與間充質干細胞相關的基因集的調控網絡中，COL5A2、FBN1和COL1A2等基因具有較大的頂點出度，具體結果如表6所示。其中COL5A2基因調控的基因數(shù)超過100。因此，基因COL5A2被看作是與間充質干細胞相關的關鍵基因。它的調控子網絡見圖4(c)。

(a)TPX2

(b)MCM10

(c)COL5A2圖4 三個關鍵基因及其下游調控基因構成的調控子網絡

基因頂點出度基因頂點出度COL5A2102COL6A371FBN187VCAN67COL1A287LUM67COL3A174BNC266THBS272CDH1165

由于上述3個基因在相應的調控網絡中具有極高的頂點出度，說明TPX2、MCM10和COL5A2在癌癥的胚胎干細胞和間充質干細胞的自我更新、分化過程中具有重要作用。故上述三個基因可作為辨別乳腺癌的癌癥干細胞的特征基因，以及治愈乳腺癌的潛在的生物靶基因。

2.6 關鍵基因的生物學分析

本文將3個關鍵基因的表達譜數(shù)據(jù)與TCGA數(shù)據(jù)庫中的臨床數(shù)據(jù)整合成一個由657個樣本構成的新數(shù)據(jù)T2進行Kaplan-Meier生存分析，從而進一步研究關鍵基因的表達方式對乳腺癌患者的生存率的影響，結果如圖5所示。在圖5中，對應的曲線分別為在基因TPX2和MCM10的高表達和低表達情況下乳腺癌患者的生存曲線，其中x軸表示乳腺癌患者的生存時間，y軸表示患者的生存率；event=1代表患者死亡。觀察圖5發(fā)現(xiàn)處于TPX2和MCM10高表達組的癌癥患者相比于低表達組的患者有明顯高的死亡率。而且假設檢驗的p-value都小于0.05，也表明關鍵基因的不同表達方式對乳腺癌患者生存率的影響顯著不同。

基因COL5A2沒有上述結論，但Weng等[19]通過研究血小板反應蛋白2(thrombospondin2,THBS2)的表達模式在肺癌發(fā)展中的作用，發(fā)現(xiàn)COL5A2基因作為THBS2的一個共表達基因，它們的高表達使得肺癌患者具有較低存活率。此外，F(xiàn)ischer等[20]通過對比膠原蛋白的基因在結腸直腸癌患者和正常結腸上皮的組織樣品中的差異表達，發(fā)現(xiàn)基因COL5A2在基質中的表達與結腸直腸癌相關。Zhang等[21]利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的卵巢癌數(shù)據(jù)構建了貝葉斯網絡，其中基因COL5A2同樣被發(fā)現(xiàn)是關鍵基因。

3 結 論

癌癥干細胞假說認為癌癥很可能起源于干細胞的非正常分化，那么通過中斷癌癥干細胞的自我更新從而造成其自我更新障礙，完全可以成為一種治療癌癥的理想方式。本文基于這一思想，利用生物信息學中WGCNA算法和MEGENA算法分析乳腺癌的基因和miRNA混合表達數(shù)據(jù)，將其劃分為具有不同或相似生物功能的基因共表達模塊，同時利用MSigDB數(shù)據(jù)庫中與胚胎干細胞特性和間充質干細胞特征相關的基因集進行富集度分析，得到了兩個分別與乳腺癌胚胎干細胞和間充質干細胞相關的且由2019個基因和859個基因組成的基因集。另外從GEO數(shù)據(jù)庫中下載了癌癥胚胎干細胞和間充質干細胞的mRNA表達譜數(shù)據(jù)，并通過查看上述兩個基因集在mRNA表達譜數(shù)據(jù)中的表達模式，驗證了本文得到的兩個基因集是可靠的。

進一步利用隨機森林算法在上述兩個基因集中構建有向的調控網絡。通過調控網路的分析，發(fā)現(xiàn)了3個在癌癥的胚胎干細胞和間充質干細胞自我更新、分化過程中起重要作用的關鍵基因：TPX2、MCM10和COL5A2。生存分析和已有的結果進一步說明這三個基因是與乳腺癌密切相關的，可以作為治療乳腺癌的潛在的治療靶點。

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(責任編輯： 康 鋒)

Identification of Specific Genes of Cancer Stem Cells of Breast Cancer

GUOPengfei,HEPingan

(School of Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

Breast cancer is a kind of malignant tumor which seriously threats the health of global female. However, the hypothesis of cancer stem cell (CSC) provides a new model for breast cancer causes and treatment. In the paper, coexpression network was constructed with the bioinformatics method for 18409 genes and 1035 miRNA in 746 breast cancer samples, and they were divided into different coexpression modules. The characteristics of embryonic stem cells and mesenchymal stem cells were utilized to further screen the modules, and two gene sets related to the above two types of stem cells (size: 2019 and 859) were gained respectively. Finally, regulatory network for the two gene sets were constructed to screen specific hub genesTPX2 andMCM10 of two embryonic stem cells as well as specific geneCOL5A2 of mesenchymal stem cells. These genes can be considered as candidate specific biomarkers of CSC and potential therapeutic targets in the treatment of breast cancer.

breast cancer; embryonic stem cells; mesenchymal stem cells; gene regulatory network; hub genes

10.3969/j.issn.1673-3851.2017.05.023

2016-11-22 網絡出版日期： 2017-03-28

國家自然科學基金項目(61170110, 61272312)；浙江省自然科學基金項目(LY14F020049)

郭鵬飛(1990-)，男，山西忻州人，碩士研究生，主要從事生物信息學方面的研究。

賀平安，E-mail：pinganhe@zstu.edu.cn

Q612

A

1673- 3851 (2017) 03- 0451- 10