木聚糖提取優(yōu)化及對木聚糖酶活性的影響

周義，張東杰，*，李超楠，宋雪健，于果，于金池

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

木聚糖提取優(yōu)化及對木聚糖酶活性的影響

周義1，張東杰1，*，李超楠1，宋雪健1，于果1，于金池1

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

以小米糠為試驗原料，研究小米糠中木聚糖的提取工藝及對腸道木聚糖酶活力的影響。在單因素的基礎(chǔ)上，采用正交試驗優(yōu)化小米糠木聚糖提取工藝，研究料液比、堿提溫度、堿液濃度、堿提時間4個因素對提取木聚糖提取率的影響。并采用著色木聚糖標(biāo)記法測定木聚糖酶活力，研究小米糠木聚糖對大鼠腸道糞便及消化道木聚糖酶活力的影響。結(jié)果表明，小米糠木聚糖的最佳提取工藝：料液比為1∶25（g/mL），堿處理溫度為100℃，堿液濃度為10%，堿處理時間為2 h，在此條件下木聚糖提取率為21.71%。

小米糠；木聚糖；著色木聚糖標(biāo)記法；木聚糖酶活性

谷子是我國東北及西北地區(qū)主要雜糧作物，種植面積達(dá)1 400千畝，年產(chǎn)量370萬噸～450萬噸[1]。小米糠是由褪下的谷殼、種皮、糊粉層和米胚芽組成，占谷子重量的5%～7%[2]，小米糠作為谷子加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物之一，是一種產(chǎn)量較高的可再生資源，并含有豐富的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、維生素、脂肪、礦物質(zhì)和膳食纖維等。但由于小米糠的外觀差、有異味和缺乏可食性等原因，使小米糠在實際應(yīng)用中主要被用作動物的飼料，這樣不僅造成了資源的嚴(yán)重浪費，而且對環(huán)境還會產(chǎn)生不良影響[1-3]。為提高小米糠的利用價值，研究從小米糠中提取木聚糖的工藝具有一定的研究意義。目前，從農(nóng)作物中提取木聚糖的方法主要有超聲波輔助法[4]、超聲處理結(jié)合蒸煮法[5]、堿性過氧化氫[6]等，但由于這些方法并不成熟，現(xiàn)還以堿提-蒸煮法為主。植物組織內(nèi)天然結(jié)構(gòu)的木聚糖受到木質(zhì)素的屏蔽而很難被酶解。即使在牛科動物瘤胃中木聚糖的消化率也只有36%～79%[7]，人體腸胃對木聚糖的消化率并沒有人直接檢測過。然而，提純后的木聚糖可解除木聚糖的屏蔽[8]。本文以正交試驗優(yōu)化蒸煮-堿提取法提取小米糠中木聚糖工藝條件，并建立以木聚糖作為日常飲食干預(yù)的大鼠模型，并用染料法測定大鼠糞便的木聚糖酶酶活性變化。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

小米糠：大慶市農(nóng)貿(mào)市場；D-木糖、木二糖、木三糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）：日本和光純藥工業(yè)株式會社；木聚糖酶（酶活6000 IU/mL）：諾維信生物技術(shù)有限公司；健康雄性SD大鼠（SPF級）：大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；氣巴藍(lán)：西寶生物科技股份有限公司；1.4-丁二醇二環(huán)氧甘油醚、葡萄糖、無水乙醇、氫氧化銨、濃硫酸等：天津市大茂化學(xué)試劑；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器設(shè)備

TD4A離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；722S可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DGG-9140B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-S12型電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；DELTA320型酸度計：梅特勒—托制多儀器（上海）有限公司；TDZ5-WS臺式離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；T6紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

2 試驗方法

2.1 小米糠提取木聚糖的工藝流程

小米糠→粉碎過80目篩→加水蒸煮→乙醇浸提→離心機(jī)離心→堿處理→離心→取上清液→中和沉淀→離心→取上清液→乙醇沉淀→離心→蒸餾水洗滌→干燥→木聚糖

工藝要點：將小米糠水洗干凈，干燥，用高速粉碎機(jī)粉碎，然后過80目的篩子備用。稱取2.0 g小米糠，加入12 mL的水，在90℃蒸煮1.5 h后，用3倍體積即36 mL的工業(yè)酒精浸泡12 h、過濾并水洗濾渣得沉淀，按不同的料液比在沉淀中加入一定濃度的NaOH，在一定溫度下提取后離心，得到上清液用6 mol鹽酸調(diào)pH值至5，靜置12 h，離心得沉淀A留用，而上清液中則加入3倍體積工業(yè)酒精靜置1.5 h離心得沉淀B。將A，B沉淀混合干燥24 h即得到木聚糖。

2.2 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

DNS法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，將6.3 g的DNS和2 mol/L NaOH 262 mL溶液，加到500 mL含有185 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g亞硫酸鈉和5 g結(jié)晶酚。冷卻后加蒸餾水定容至1 000 mL，保存?zhèn)溆茫慌渲? mg/ mL標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸取1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)糖液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20分別于25 mL具塞試管中，加1.8 mL蒸餾水和3 mLDNS試劑，于沸水浴中保溫5 min顯色，迅速冷卻，加入20 mL蒸餾水，測定糖液520 nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

2.3 小米糠提取木聚糖單因素試驗

2.3.1 堿液濃度對木聚糖提取率的影響

精準(zhǔn)稱取2.0 g小米糠，分別加入6倍體積水，在90℃下蒸煮1 h后，分別采用5%、10%、15%、20%的NaOH溶液，料液比為1∶20（g/mL），在溫度90℃下加熱提取1.5 h，醇沉?xí)r調(diào)節(jié)pH值為5，干燥后稱取木聚糖質(zhì)量，計算木聚糖的提取率。

2.3.2 料液比對木聚糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.0 g小米糠，加入6倍體積水，90℃下蒸煮1 h后，采用10%NaOH溶液，料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），在溫度90℃下加熱提取1.5 h，醇沉?xí)r調(diào)節(jié)pH值為5，干燥后稱取木聚糖質(zhì)量，計算木聚糖的提取率。

2.3.3 堿提溫度對木聚糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.0 g小米糠，加入6倍體積水，90℃下蒸煮1 h后，采用10%NaOH溶液，料液比1∶20（g/ mL），在溫度70、80、90、100℃下加熱提取1.5 h，醇沉?xí)r調(diào)節(jié)pH值為5，干燥后稱取木聚糖質(zhì)量，計算木聚糖的提取率。

2.3.4 堿提時間對木聚糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.0g小米糠，加入6倍體積水，90℃下蒸煮1 h后，用10%NaOH溶液，在90℃溫度下分別提取0.5、1、1.5、2 h，料液比1∶20（g/mL），醇沉?xí)r調(diào)節(jié)pH值為5，干燥后稱取木聚糖質(zhì)量，并計算木聚糖的提取率。

2.3.5 小米糠木聚糖提取工藝優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選用L9（34）正交試驗設(shè)計表，以堿提濃度（A）、料液比（B）、堿提溫度（C）、堿提時間（D）為影響因素，以木聚糖提取率為指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝參數(shù)。因素水平見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

2.4 小米糠木聚糖對大鼠腸道木聚糖酶活性的影響

2.4.1 大鼠分組與飼養(yǎng)

取20只健康雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以體重為指標(biāo)，將20只大鼠隨機(jī)分為木聚糖組和正常組，每組10只，每籠5只。木聚糖組在飼料中添加2.38 g/（kg·d）的木聚糖，正常組在飼料中以等量水替代木聚糖。飼喂期間大鼠可自由飲水。飼料配方：豆粉26%+面粉20%+玉米粉20%+麩皮16%+其他18%[10]。

2.4.2 小米糠木聚糖交聯(lián)著色

將小米糠木聚糖2 g加入30 mL蒸餾水，浸潤后加入10 mL的2 mol/LNaOH溶液溶解，然后加入1.5 g氣巴藍(lán)，1.2 mL 1，4-丁二醇二環(huán)氧甘油醚，攪勻，靜置48 h后形成彈性極好的凝膠。將凝膠搗碎成細(xì)小顆粒，沸水反復(fù)沖洗至洗出液無色。凝膠顆粒依次用25%、50%、75%、95%乙醇洗滌脫水，最后用丙酮，石油醚處理，80℃真空揮干石油醚后得深藍(lán)色粉末狀氣巴藍(lán)-蔗渣木聚糖不溶性固體染料[11]。

2.4.3 氣巴藍(lán)著色木聚糖染料法測定酶活力

用pH5.0，0.005 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，按照終濃度為6%進(jìn)行配制氣巴藍(lán)著色小米糠木聚糖懸浮液。取氣巴藍(lán)著色小米糠木聚糖懸浮液3.8 mL，并分別加入酶活力為0.04、0.08、0.12、0.16 IU/mL的木聚糖酶0.2 mL，60℃振蕩保溫10 min，加入10%NaOH終止反應(yīng)，4 000 r/min離心5 min，在625 nm處測定吸光值，建立木聚糖酶活力與氣巴藍(lán)著色小米糠木聚糖吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.4 鼠便木聚糖酶酶活力測定

采用逼迫法采集大鼠新鮮糞便樣品，并立即放入-20℃環(huán)境中保存。由于每天鼠便的酶活性有可能存在差異，因此，將每周鼠便樣品測定的木聚糖酶活力進(jìn)行核算。

小鼠糞便酶活力測定：稱取糞便樣品，加入20倍純水，搗碎，再加入過量的氣巴藍(lán)木聚糖作為底物，37℃保溫3.5 h，每0.5 h振蕩一次，反應(yīng)結(jié)束后立即離心（16 000 r/min，10 min），取1 mL上清液定容至3 mL，測定625 nm處吸光值，按下式計算糞便中的木聚糖酶活力（IU/g）。

式中：Y1為酶活力，IU/mL；20為樣品稀釋倍數(shù)；3為反應(yīng)液檢測稀釋倍數(shù)；3.5為反應(yīng)時間，h；60為h換算為min；10為（1）式的反應(yīng)時間，min。

2.4.5 大鼠不同腸段小米糠木聚糖降解率的測定

大鼠飼喂7周后用正常飼料代替氣巴藍(lán)小米糠木聚糖飼料，飼喂1周，采用頸椎脫臼法處死大鼠，快速解剖，收集大鼠空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸新鮮內(nèi)容物，加入2倍水振蕩均勻，浸泡5 min，16 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液定容至3 mL，測定625 nm處吸光值[10]。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

試驗數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差即MS±SD表示，采用SAS 9.1統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義，Origin 8.5軟件繪制相關(guān)圖表。

3 結(jié)果與分析

3.1 木聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

木聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 木聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Xylose standard curve

由圖1可知，木聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程y= 0.870 9x-0.007 8，其中R2=0.998 9，說明標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合較好，可用于后續(xù)試驗。

3.2 小米糠木聚糖單因素試驗結(jié)果

3.2.1 堿液濃度對小米糠木聚糖提取率的影響

堿液濃度對小米糠木聚糖提取率的影響見圖2。

圖2 堿液濃度對小米糠木聚糖提取率的影響Fig.2 Effect of alkaline concentration on extraction rate of mittle bran

由圖2可知，小米糠木聚糖的提取率隨著堿液濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在堿液濃度為10%時提取率達(dá)到最高為19.15%。這是因為堿液濃度較低時，對小米糠的透壁作用較差導(dǎo)致木聚糖的提取率較低，但是當(dāng)堿液濃度較高時會造成木聚糖的分解從而引起提取率降低。因此選取堿液濃度為5%、10%、15%作為正交試驗水平。

3.2.2 料液比對小米糠中木聚糖提取率的影響

料液比對小米糠木聚糖提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對小米糠木聚糖提取率的影響Fig.3 Effect of material/liquid ratio on the extraction rate of xylan from wheat bran

由圖3可知，小米糠木聚糖的提取率隨著提料液比的升高呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，并在料液比為1∶25（g/mL）時提取率達(dá)到最高為21.31%。這是因為所用溶劑越多，被浸提出的物質(zhì)就越多，而當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡時，再增加溶劑量也不會使浸出物質(zhì)增加[11]。因此選用料液比為1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）作為正交試驗水平。

3.2.3 堿提溫度對米糠木聚糖提取率的影響

堿提溫度對小米糠木聚糖提取率的影響見圖4。

圖4 堿提溫度對小米糠木聚糖提取率的影響Fig.4 Effect of alkaline temperature on extraction rate of mittle bran

由圖4可知，小米糠木聚糖的提取率隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在提取溫度為90℃時提取率達(dá)到最高為19.58%。這是因為溫度較低時，料液中的分子運動較慢導(dǎo)致小米糠內(nèi)木聚糖往溶液中擴(kuò)散提取較慢而使提取率較低，但溫度過高時有可能會導(dǎo)致部分木聚糖分解而引起提取率降低。因此選擇堿提溫度為80、90、100℃作為正交試驗水平。

3.2.4 堿提時間對小米糠中木聚糖提取率的影響

堿提時間對小米糠中木聚糖提取的影響見圖5。

圖5 堿提時間對小米糠中木聚糖提取的影響Fig.5 Effect of alkaline time on extraction of xylan from millet bran

由圖5可知，小米木聚糖的提取率隨著堿提時間的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在堿提時間為1.5 h時提取率達(dá)到最高為19.93%。這是因為堿提時間較短時，對小米糠中木聚糖的提取不充分導(dǎo)致木聚糖提取率較低，但堿提時間過長時溶液中的雜質(zhì)溶出較多引起提取率降低。因此選取堿提時間為1.0、1.5、2.0 h作為正交試驗水平。

3.3 小米糠木聚糖提取工藝的正交優(yōu)化試驗

在單因素試驗的結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇堿提濃度、料液比、堿提溫度、堿提時間設(shè)計成四因素三水平的正交試驗表，以小米糠木聚糖的提取率為指標(biāo)，按照正交表L9（34）進(jìn)行正交試驗。正交試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

由表2、表3可知，4個因素對小米糠木聚糖提取率影響的主次順序為C＞B＞A＞D，即堿提溫度＞料液比＞堿提濃度＞堿提時間，且堿提溫度、料液比、堿提濃度和堿提時間對小米糠木聚糖提取率均為極顯著影響。由正交試驗表得出最佳優(yōu)化工藝組合為A1B2C3D3，即堿提溫度100℃，料液比為1∶25（g/mL），堿液濃度為10%，堿提時間2 h，該組合不在正交試驗之列，通過驗證試驗該組合提取率21.71%。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results

3.4 木聚糖對大鼠腸道木聚糖酶活性的影響

3.4.1 氣巴藍(lán)酶活力和吸光值關(guān)系曲線

木聚糖酶酶活力與染料釋放量（OD625nm）關(guān)系見圖6。

圖6 木聚糖酶酶活力與染料釋放量（OD625nm）關(guān)系Fig.6 The relationship between xylanase activity and dye release（OD625nm）

由圖6可知，木聚糖酶酶活力與染料釋放量（OD625nm）之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=1.902 8x-0.013 6，R2=0.997 4，說明染料釋放量（OD625nm）與木聚糖酶酶活力具有良好的正相關(guān)性。

3.4.2 小米糠木聚糖對大鼠糞便木聚糖酶活性的影響

飼料中添加木聚糖對鼠便木聚糖酶活性的影響見圖7。

木聚糖酶是一種誘導(dǎo)酶，只有存在于木聚糖環(huán)境的微生物才會分泌此種酶。由圖7可知，從第二周之后的正常組的木聚糖酶活力明顯低于木聚糖組，正常組鼠便能檢測到一定的木聚糖酶活力是因為基礎(chǔ)飼料中款皮（約19.42%）含有一定量的木聚糖。而兩組大鼠糞便的木聚糖活性均在飼養(yǎng)5周之后進(jìn)入高峰，其原因可能是：木聚糖促使大鼠腸道產(chǎn)酶微生物增殖，或菌群整體產(chǎn)酶水平的提高，至少需要5周以上時間的誘導(dǎo)才能達(dá)到高峰，木聚糖組鼠便的酶活性（3.461 IU/g）已經(jīng)升高到飼喂起點的24倍，比同期正常組的酶活性（0.125 IU/g）也提高了6.8倍，此后基本趨于穩(wěn)定。

圖7 飼料中添加木聚糖對鼠便木聚糖酶活性的影響Fig.7 Effect of adding xylan on feed xylanase activity

3.4.3 鼠不同腸段木聚糖降解率

大鼠不同腸段降解著色木聚糖的活性見圖8，著色木聚糖在大鼠不同腸段的降解率見圖9。

圖8 大鼠不同腸段降解著色木聚糖的活性Fig.8 The activity of stained xylan in different intestinal segments of rats

圖9 著色木聚糖在大鼠不同腸段的降解率Fig.9 Degradation rate of colored xylan in different intestinal segments of rats

以吸光值表示染料的相對含量，代表不溶性氣巴藍(lán)著色木聚糖到達(dá)不同階段之后的酶解程度（圖9）。以直腸段釋放的染料含量為100%，表示木聚糖達(dá)到此腸段的水解率己經(jīng)達(dá)到100%，則到達(dá)盲腸段、結(jié)腸段木聚糖的水解率分別達(dá)到60%、85%，在小腸段（空腸、回腸）酶解的木聚糖不到攝入總量的10%。由此得出，大腸是木聚糖的主要水解場所，且盲腸水解木聚糖占大腸水解木聚糖的60%左右，之后有不到20%的木聚糖到直腸段才水解，這表明，小米糠木聚糖幾乎可以送到腸道的最遠(yuǎn)端供微生物發(fā)酵利用。

4 結(jié)論

在小米糠提取木聚糖試驗中，通過正交試驗優(yōu)化小米糠中木聚糖的提取工藝，得到最佳提取條件：堿處理溫度為100℃，料液比為1∶25（g/mL），堿液濃度為10%，堿處理時間為2 h，在此條件下木聚糖提取率為21.71%。

采用不溶性氣巴藍(lán)標(biāo)記小米糠木聚糖對胃腸木聚糖酶活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明小米糠木聚糖可顯著提高大鼠腸道糞便的木聚糖酶活力，并且需要5周以上時間的誘導(dǎo)才能達(dá)到高峰，并與正常組相比木聚糖酶活力顯著提高，此后基本趨于穩(wěn)定，并且?guī)缀蹩梢运偷侥c道的最遠(yuǎn)端供微生物發(fā)酵利用。

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Extraction of Xylan and Its Effect on Xylanase Activity

ZHOU Yi1，ZHANG Dong-jie1，*，LI Chao-nan1，SONG Xue-jian1，YU Guo1，YU Jin-chi1
（College of Food Science，Heilongjiang BaYi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China）

Small rice bran as raw material testing，research in rice bran extraction process small impact on the xylan and xylanase activity of the intestinal tract.On the basis of single factor，orthogonal experiment was used to optimize the extraction process of millet bran chitosan.The effects of four factors，such as ratio of material to liquid，alkali temperature，alkali concentration and alkali extraction time，on the extraction process were studied.And the xylanase activity was measured by the method of coloring xylan labeling to study the effects of millet chaffidan on intestinal fecal and xylanase activity in digestive tract.The results showed that the best extraction process was as follows：the ratio of material to liquid was 1∶25（g/mL），the alkali treatment temperature was 100℃，the alkali concentration was 10%，the alkali treatment time was 2 h，and the xylan was rate of 21.71%.

millet bran；xylan；coloring xylan labeling method；xylanase activity

2017-04-28

周義（1992—），男（滿），研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

*通信作者：張東杰（1966—），男，教授，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與安全。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.015