畢赤酵母表達系統(tǒng)中啟動元件的研究進展

蔣慧慧

（巢湖學院，安徽 巢湖 238000）

畢赤酵母表達系統(tǒng)中啟動元件的研究進展

蔣慧慧

（巢湖學院，安徽 巢湖 238000）

畢赤酵母是真核細胞常用表達系統(tǒng)之一，具有細胞密度高、純化方法簡單、轉錄后修飾功能完善等優(yōu)點。作為重要的調控元件，表達系統(tǒng)中啟動元件的功能強弱與表達效率的高低密切相關。目前，畢赤酵母表達系統(tǒng)中常用的啟動元件分為三類，分別是以pAOX為代表的甲醇誘導型、以pGAP為代表的非甲醇誘導型，還有一些新型工業(yè)酵母啟動子也是理想的表達系統(tǒng)啟動元件。充分了解這些酵母啟動子的最新研究進展，可以為工業(yè)酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)化提供重要的發(fā)展思路。

畢赤酵母；啟動子；誘導型；組成型

畢赤酵母（Pichia pastoris）是為數不多的商業(yè)化真核表達系統(tǒng)之一，自上世紀70年代Phillips Petroleum公司成功開發(fā)出P.pastoris高密度培養(yǎng)方案，迄今已有超過600種蛋白質成功利用這一微生物細胞工廠實現基因克隆并表達[1]。進入21世紀，P.pastoris在結構基因組學、蛋白質組學等方面也有應用[2]。畢赤酵母表達系統(tǒng)之所以如此受青睞，不僅因為其具有營養(yǎng)成分單一、細胞密度高、純化方法簡單、轉錄后修飾完善等優(yōu)點，還與該系統(tǒng)中可供選擇的受嚴密調控、功能各異的啟動元件密不可分。

畢赤酵母等真核表達系統(tǒng)的表達效率很大程度上取決于啟動元件的功能，而啟動功能的強弱往往決定于它的結構和轉錄條件。目前，酵母等大多數真核生物啟動元件所共有的結構模式已得到普遍認可，如圖1所示[3]，包括上游啟動子和核心啟動子兩部分，其中位于轉錄起始位點上游的TATA區(qū)與原核生物Pribnow區(qū)類似，是富含TA的保守序列[4]；TATA區(qū)的中心位置一般位于-20到-30，主要負責轉錄起始位點的確定；而-40到-110區(qū)的CAAT區(qū)、GC區(qū)屬上游激活序列，主要控制轉錄起始的頻率；增強子則能使連鎖基因轉錄頻率明顯增加。但并不是所有真核基因的啟動子區(qū)都包含上述所有保守序列，且不同基因轉錄條件有所差異，故不同基因來源的啟動子在功能上參差不齊。

畢赤酵母表達系統(tǒng)中常用的啟動元件可分為甲醇誘導型和非甲醇誘導型兩大類，前者包括pAOX1 （alcohol oxidase，醇氧化酶）、pAOX2、pFLD1（formaldehyde dehydrogenase，甲醛脫氫酶）等，后者以pGAP（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，3-磷酸甘油醛脫氫酶）、pYPT1（GTPase酶）為代表，還有一些新型工業(yè)酵母啟動子也是理想的表達系統(tǒng)啟動元件。

圖1 真核基因啟動元件的結構示意圖

1 甲醇誘導型啟動子

1.1 pAOX1和pAOX2

當畢赤酵母以甲醇為唯一碳源時，其細胞通過特殊的甲醇利用途徑進行生長[5]，途徑中的醇氧化酶（AOX）和二羥丙酮合酶（DHAS）等關鍵酶表現出很高的水平。應用最廣泛的甲醇誘導型啟動子pAOX正是來源于AOX基因。畢赤酵母細胞中有兩個基因能編碼合成醇氧化酶，即AOX1（大于90%）和AOX2（小于10%）。一般來說，pAOX1啟動子控制下的蛋白表達水平要高于pAOX2啟動子，然而也有利用pAOX2啟動子或截短倒位的pAOX2啟動子來提高表達水平的成功報道[6]，另外通過添加消泡劑類物質如油酸，可能會提高pAOX2的轉錄調控水平[7]。

在成功進行了細菌、真菌、無脊椎動物、脊椎動物（包括人）、植物、病毒等多種蛋白表達的應用研究后，張震陽等[8]利用pAOX1研究甘油轉運體GT2對甘油等碳源阻遏的影響，通過同源重組的方法，敲除GT2基因，獲得的ΔGT2突變株可以一定程度上解除甘油對甲醇的代謝抑制，暗示甘油轉運體和pAOX1的功能有關。孟祥琨[9]重點研究畢赤酵母AOX1啟動子介導下畢赤酵母中ATG周圍序列對基因表達的影響進行研究，結果說明在ATG周圍插入的序列是通過影響了pAOX1的轉錄，使得mRNA的表達量發(fā)生了改變，從而影響蛋白質的最終產量。針對pAOX控制的不同表型細胞，研究者分別在培養(yǎng)基組成、生長動力學、連續(xù)式培養(yǎng)的發(fā)酵操作策略、甲醇濃度的監(jiān)測與控制、輔助底物的添加等方面進行研究。另一方面，以pAOX1的分子調控機理研究為切入點，研究者希望通過啟動子結構或調控路徑的改造，實現非甲醇物質誘導pAOX1的起始。經過十多年的研究，目前已有多個與甲醇誘導相關的轉錄調節(jié)因子、跨膜蛋白等被發(fā)現，為實現啟動子功能的調控提供可能。

2005年，美國俄勒岡州的Lin-Cereghino GP等[10]最早對甲醇誘導利用相關因子進行研究，實驗克隆得到MXR1（methanol expression regulator 1，可編碼合成甲醇代謝途徑中必要的反式作用因子Mxr1p）。當細胞受到甲醇誘導時，Mxr1p由過氧化物酶體轉移到細胞核，并特異性的結合在pAOX1的5’端啟動子序列；在MXR1基因缺失的突變體中，pAOX1無法正常起始轉錄。研究人員還對Mxr1p在pAOX1轉錄調控區(qū)的可能結合部位進行了研究。

國內華東理工大學周祥山教授團隊關于甲醇誘導型啟動子碳源阻遏機制的研究較為系統(tǒng)和深入。2009年，宣姚吉等[11]在pAOX1啟動子上游-638和-510之間發(fā)現一順式作用調節(jié)元件D區(qū)域（Region D），該區(qū)域包含反向重復序列，參與甲醇誘導pAOX1啟動子的正向調節(jié)。2010年，張平[12]在P.pastoris中克隆并分析了釀酒酵母MIG（multicopy inhibitor of GAL gene expression）同源的碳源阻遏因子編碼基因PpMIG1和PpMIG2，分析結果顯示，基因編碼的蛋白質具有典型的C2H2鋅指結構，可以與受葡萄糖等碳源阻遏的pAOX1啟動子結合，從而影響轉錄起始。另外，通過功能鑒定，畢赤酵母己糖運載體編碼基因PpHXT1受糖濃度調控，不僅影響己糖運輸，其編碼的蛋白質還直接參與pAOX1的阻遏途徑。2011年，柏鵬[13]篩選出pAOX1葡萄糖脫阻遏畢赤酵母突變株，并依此分析出己糖感應體基因PpHXS1的缺失，使突變體在果糖、葡萄糖或甘露糖中具有pAOX1啟動活性的原因；正調節(jié)甲醇誘導pAOX1起始轉錄的PpMPP1和PpTRM1基因也得到了功能鑒定。2012年，亓飛[14]在張平的研究基礎之上，利用亞細胞定位技術，闡釋了碳源阻遏因子PpMIG1和PpMIG2在不同碳源環(huán)境中對pAOX1的影響，即以甲醇為碳源時，阻遏因子位于細胞質，無阻遏現象；以葡萄糖為碳源，阻遏因子則轉移至細胞核參與pAOX1阻遏調控。上述pAOX1調節(jié)因子 （正調控Mxr1p、PpMPP1、PpTRM1和負調控PpMIG1、PpMIG2）之間在表達水平上的關聯也得到闡釋。

1.2 pFLD1

另一類甲醇誘導型啟動子pFLD1受甲醇（碳源）或甲胺（氮源）誘導：當用甲胺誘導時，葡萄糖、山梨醇或甘油可以替代甲醇作為唯一碳源；甲醇誘導時，則不可替換其他碳源?；谶@一特性，可以在包含雙啟動子的表達系統(tǒng)中，通過誘導物甲醇或甲胺的切換，達到目的基因表達的靈活控制。Duan H等[15]在pPIC9K載體上加入pFLD1啟動子序列，重組載體上即具有pAOX1和pFLD1雙啟動子，分別在pAOX1下游串聯GEL（gelatin，骨膠）基因、pFLD1 下游串聯 GFP（green uorescent protein，綠色熒光蛋白）基因，轉化P.pastoris GS115進行后培養(yǎng)。當用0.5%（V/V）甲醇為碳源時，重組菌在pAOX1和pFLD1的分別起始下同時表達GEL（胞外）和GFP（胞內）；而以葡萄糖或山梨醇為碳源、甲胺為氮源時，只有GFP正常表達。為減小有機溶劑對細胞的毒性，甲胺的濃度以不超過0.5%（V/V）為宜。

pFLD1同時具有類似于pAOX1的嚴密調控和轉錄效率，這些特征使pFLD1成為甲醇依賴型啟動子的可能替代對象[6]。Zhan R等[16]在畢赤酵母中首次利用pFLD1實現了IFTase（Inulin fructotransferase，菊粉果糖轉移酶）的高效表達：通過四種底物的流加培養(yǎng)，高密度菌體受甲醇和甲胺鹽酸鹽共同誘導，IFTase活性最高為野生菌的3.2倍，達 62.72U/mL；1—1.5%（W/V）的葡萄糖或0.5—1.5%（V/V）甘油可以替代甲醇作為碳源，pFLD1使重組畢赤酵母無甲醇培養(yǎng)表達IFTase成為現實。

2 非甲醇誘導型啟動子

由于甲醇在大規(guī)模生產中存在安全隱患，pAOX1等甲醇誘導型啟動子的使用受到一定限制，為此非甲醇誘導的啟動子研究隨之展開，具體包含三類：一是組成型啟動子，二是甲醇誘導啟動子的改造，三是新型啟動子的發(fā)現。

2.1 畢赤酵母組成型啟動子

P.pastoris組成型啟動子的最大優(yōu)勢是不需要甲醇誘導，但沒有被廣泛使用的原因之一可能是組成型表達的過量外源蛋白對細胞生長具有毒性[17]。在合適的條件下，含有組成型啟動子的重組菌可以一直在同一碳源（葡萄糖、甘油或油酸等）條件下連續(xù)培養(yǎng)，其組成型表達也可以達到很高的水平。

強組成型啟動子pGAP自1997年被分離出來，已成功應用于重組外消旋-果聚糖酶（LsdB）、羧酸酯酶（TCE）、哺乳動物肽轉運蛋白（hPEPT1和 rPEPT2）、β-內酰胺酶、β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）、乙肝表面抗原（HBsAg）等多種不同外源蛋白的生產實驗[17]。與pAOX1表達強度的對比研究中，pGAP與受甲醇誘導的pAOX1在特定蛋白的表達上各有優(yōu)勢：如pGAP在起始TCE的表達上優(yōu)于pAOX1，而pAOX1起始的GUS表達量高于pGAP[18]。另外，國內外也有利用pAOX1和pGAP聯合作用提高外源蛋白表達量的報道[19]。在碳源的選擇上，pGAP較pAOX1更加寬泛，葡萄糖、甘油、油酸、甲醇等都可以被利用，但作用效果各異，其中甲醇的利用效果最差，葡萄糖和甘油效果最好，葡萄糖多用于搖瓶培養(yǎng)，甘油適用于大規(guī)模生產[20]。

大多數的啟動子研究都以強轉錄活性為啟動子選擇依據，但研究發(fā)現在某些特殊條件下強啟動子的表現不如一些弱啟動子，pYPT1就是這樣一類組成型弱啟動子，其啟動強度明顯弱于pGAP，但卻更適合實現最佳表達，因為強啟動子帶來的過量外源表達會造成細胞壓力過大[21]，所以，選擇最適強度的啟動子是關鍵。秦秀林[22]采用易錯PCR對pGAP進行隨機突變，借助組成型表達文庫篩選的高通量方法，篩選到不同強度的組成型突變啟動子，組成功能性啟動子文庫，并分別在轉錄水平、蛋白和酶活水平上加以驗證，為S-腺苷甲硫氨酸等代謝工程途徑的優(yōu)化提供了思路。

2.2 甲醇誘導啟動子的改造

目前甲醇誘導啟動子的改造主要有兩種思路，一是借助組成型啟動子的調控因子，與誘導型啟動子協(xié)同作用，如Takagi S等[23]通過組成型共表達pGAP的正調節(jié)轉錄因子Prm1p，實現了甲醇誘導型啟動子控制下的無甲醇誘導表達；二是對pAOX1進行基因結構的調整，Hartner FS等[24]通過序列調整，使pAOX1啟動子可能的轉錄因子結合位點缺失或重復，構建了不同啟動子活性（6%-160%的野生型啟動子活性）的啟動子文庫，經過比較找出12個與甲醇誘導有關的反式作用因子，其中一些pAOX1變種啟動子由于部分調控元件的改變在甲醇缺失的條件下仍具有活性。改造后的原甲醇誘導啟動子，不僅擺脫了對誘導物甲醇的依賴，還在一定程度上保留了原啟動子的活性。

2.3 畢赤酵母新啟動子的發(fā)現

畢赤酵母新型啟動子的發(fā)現研究具有多樣性，有些新啟動子是從畢赤酵母中篩選到的新誘導型啟動子，如Cregg J等[25]研究的來源于醇脫氫酶的新誘導型啟動子pADH1，不論是在以甘油為主要碳源的培養(yǎng)基中添加乙醇，還是直接以乙醇為唯一碳源，啟動子都受到嚴格的誘導調控；Stadlmayr G等[26]通過對畢赤酵母轉錄水平較高的基因進行分析，發(fā)現硫胺素合成基因啟動子pTHI11在低特異性生長速率下沒有高轉錄水平，但在添加硫胺素的生長培養(yǎng)基中轉錄活性明顯提高，是新型硫胺素誘導啟動子。亓飛等[27]使用RNA-Seq技術，測序了畢赤酵母的轉錄組，并從中篩選到2個新型強啟動子P437和P1431，其中P437僅受甲醇誘導而受葡萄糖阻遏，P1431在甲醇和葡萄糖碳源中均可驅動外源蛋白表達，并且葡萄糖對其誘導作用更強。張雪[28]從畢赤酵母鼠李糖代謝途徑中挖掘了兩個鼠李糖誘導型啟動子P0075和P0341，均可有效啟動報告基因lacB和gfp的表達。

另一部分新啟動子是基于高轉錄水平篩選到的組成型啟動子，如張軒薇等[29]研究的細胞壁蛋白基因啟動子pGCW14，在南極假絲酵母脂肪酶 B（CALB）的表達實驗中，pGCW14的活力高于pGAP、接近pAOX1，且具有最高的產酶效率；研究者還利用在線分析軟件TESS對pGCW14的可能作用元件進行了預測，并嘗試利用啟動子序列突變提高啟動子活性。

3 新型工業(yè)酵母啟動子

在工業(yè)畢赤酵母表達系統(tǒng)中，還有一些工業(yè)酵母來源啟動子由于其特殊性質 （如耐高溫、耐高滲），在啟動子的結構研究和應用中也占有十分重要的位置。

3.1 耐高溫新啟動子

耐熱酵母Pichia thermomethanolica（后命名為Ogataea thermomethanolica）可以在高溫下以甲醇為唯一碳源生長[30]，2012年該酵母已成功用做P.pastoris啟動子的表達宿主，且轉化效率很高。為提高P.thermomethanolica在大規(guī)模工業(yè)生產中作為外源蛋白表達宿主的能力，研究者對該酵母自身的潛在可利用啟動子展開研究。Harnpicharnchai P 等[30]從 P.thermomethanolica BCC16875中分離出耐高溫的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子ptGAP，該啟動子除具有畢赤酵母pGAP的強組成型表達特性，還可以在高達42℃的多種碳源環(huán)境中有效起始轉錄，降低工業(yè)化生產的冷卻成本。Promdonkoy P等[31]還對來自于該株耐熱酵母的醇氧化酶基因啟動子pOthAOX進行了研究，pOthAOX是耐高溫的甲醇誘導型啟動子，可以在最高45℃溫度下調控植酸酶的表達；且pOthAOX是唯一發(fā)現的、在去阻遏階段起始外源蛋白表達的AOX啟動子。

3.2 耐高滲新啟動子

產甘油假絲酵母（Candida glycerinogenes）是一株從自然界篩選得到的工業(yè)甘油生產菌株，具有耐受高滲透壓、高產甘油的特點[32]。通過對酵母高滲甘油應答途徑（HOG途徑）的分析，多個甘油合成途徑中的關鍵酶基因啟動子被克隆和分析，如pCggpd（胞漿3-磷酸甘油脫氫酶基因啟動子）和pCgSTL3（H+/甘油轉運蛋白基因啟動子）。丁春生[33]和劉愛玲[34]分別在釀酒酵母、煙草中分析了pCggpd受滲透壓調控的特性，劉愛玲還結合啟動子上游存在的七個滲透壓脅迫應答元件（STRE），設計了不同長度啟動子片段，通過報告基因找到1000bp的最強調控啟動子片段。徐丹[35]以pUC19為改造對象，利用pCggpd替換原有啟動子，結合其18s rDNA為整合位點，構建了適用于工業(yè)菌株的穿梭型整合載體pUSGZ。朱佳莉[36]篩選到受HOG途徑核心分子CgHog1調控的啟動子 pCgSTL1、pCgSTL3、pCgZWF，并利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）對三種啟動子受不同滲透壓調節(jié)的啟動強度進行比較，結果顯示在一定范圍內隨著滲透壓的變化，三種啟動子的啟動強度也隨之進行調整，其中pCgSTL3受滲透壓調控作用最強。

4 結論與展望

畢赤酵母表達系統(tǒng)一直是分子生物學的研究熱點，其中核心啟動子由于其特殊性能尤其受到關注。本文主要分三部分介紹畢赤酵母表達系統(tǒng)中常用的啟動元件，即甲醇誘導型、非甲醇誘導型和新型工業(yè)酵母啟動子。這三類啟動子特征顯著，培養(yǎng)要求各異，可以滿足畢赤酵母表達系統(tǒng)中各類外源蛋白的表達需求。結合全面的啟動性能分析、誘導機制調控和啟動強度可調的新啟動子篩選，適合畢赤酵母表達系統(tǒng)的啟動元件庫正逐步豐富，發(fā)現、掌握、改造這些酵母啟動子的作用及應用特點，可以為構建最優(yōu)化工業(yè)酵母表達系統(tǒng)提供參考。

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RESEARCH PROGRESS OF PROMOTER ELEMENTS IN PICHIA PASTORIS EXPRESSION SYSTEM

JIANG Hui-hui
（Chaohu College， Chaohu Anhui 238000）

Pichia pastoris is one of the most common expression systems for eukaryotic cells,with the advantages of high cell density,simple purification methods,and the perfect function of post-transcriptional modification.As an important regulatory element,the function of the promoter element in the expression system is closely related to the level of expression efficiency.At present,the promoter elements commonly used in Pichia pastoris expression system are divided into three types:the methanol inducible promoter represented by pAOX,non-methanol inducible promoter like pGAP,and some new industrial yeast promoters are also ideal promoter elements.To fully understand the latest research progress of these yeast promoters could provide an important development idea for the optimization of industrial yeast expression system.

Pichia pastoris； Promoter element； Inducible promoter； Constitutive promoter

Q939.5

A

：1672-2868（2017）03-0067-06

責任編輯：李 曉

2017-04-06

蔣慧慧（1988-），女，安徽合肥人。巢湖學院化學與材料工程學院，助教。研究方向：分子生物學。