冰凍紅細(xì)胞甘油化與去甘油化的改進(jìn)

（菏澤市中心血站,山東菏澤274000）

冰凍紅細(xì)胞甘油化與去甘油化的改進(jìn)

張成松

（菏澤市中心血站,山東菏澤274000）

目的探討在冰凍紅細(xì)胞去甘油化時(shí)添加適量的蔗糖溶液，提高紅細(xì)胞回收率的可行性。方法選擇6天內(nèi)制備的400 ml去白懸浮紅細(xì)胞60袋，制備成冰凍紅細(xì)胞，置于-80℃～-65℃的冰箱內(nèi)保存，在保存4個(gè)月后取出解凍去甘油化，并隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各30袋。實(shí)驗(yàn)組在去甘油化過程中的第1次洗滌液改用10%的蔗糖溶液，第2次洗滌液改用10%的蔗糖溶液，對(duì)照組仍用0.9%的氯化鈉溶液進(jìn)行洗滌，然后分別比較兩組的紅細(xì)胞回收率，甘油殘留量和去甘油化過程中的各個(gè)洗滌階段的游離血紅蛋白含量。應(yīng)用SPSS13.0軟件，所獲數(shù)據(jù)采用方差分析、t檢驗(yàn)。結(jié)果兩組紅細(xì)胞回收率比較，P＜0.0005；，甘油殘留量比較，P＞0.05。兩組去甘油化第1次洗滌比較，P＜0.0005；第2次洗滌、第3次洗滌、第4次洗滌比較，P＞0.05。結(jié)論冰凍紅細(xì)胞去甘油化過程中第一階段的洗滌過程非常重要，對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，可以顯著提高紅細(xì)胞回收率。

冰凍紅細(xì)胞；甘油化；去甘油化；室溫平衡；蔗糖溶液

紅細(xì)胞深低溫冰凍保存技術(shù)是長(zhǎng)期保存紅細(xì)胞的有效方法，可以保存10年。紅細(xì)胞能夠長(zhǎng)期保存，對(duì)于稀有血型患者輸血，調(diào)節(jié)血液供需平衡，自體輸血技術(shù)的開展都具有十分重要的意義。紅細(xì)胞冰凍保存技術(shù)分為快速冷凍法和慢速冷凍法[1]，現(xiàn)多采用慢速冷凍法。慢速冷凍法紅細(xì)胞冰凍保存需要添加一定的保護(hù)劑，甘油是紅細(xì)胞冰凍保存最常用的添加保護(hù)劑[2]?，F(xiàn)階段紅細(xì)胞冰凍保存的方法是對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行甘油化。當(dāng)甘油濃度達(dá)到20%時(shí)置于-120℃保存，達(dá)到40%時(shí)置于-65℃以下保存。紅細(xì)胞臨床輸注前，一定要洗滌去甘油化，冰凍解凍紅細(xì)胞內(nèi)甘油殘留量過高容易引起溶血[3]。冰凍紅細(xì)胞解凍去甘油化的質(zhì)量控制目標(biāo)主要是提高紅細(xì)胞的回收率，降低甘油殘留量和降低血漿游離血紅蛋白含量。為了提高產(chǎn)品質(zhì)量，在整個(gè)制備過程中一定要嚴(yán)格控制關(guān)鍵點(diǎn)?，F(xiàn)階段冰凍紅細(xì)胞去甘油化時(shí)普遍采用不同濃度梯度氯化鈉溶液分次洗滌，其臨床輸血效果是良好的，但還有改進(jìn)空間。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在冰凍紅細(xì)胞去甘油化過程中的第1階段和第2階段中，洗滌液改用10%的蔗糖溶液[4]，可顯著提高紅細(xì)胞回收率?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料選擇6天內(nèi)制備的400 ml去白懸浮紅細(xì)胞60袋，將懸浮紅細(xì)胞和甘油一起放入37℃的水浴箱中水浴，水浴20 min后取出懸浮紅細(xì)胞和甘油。懸浮紅細(xì)胞用無菌接駁機(jī)無菌連接于適宜于冰凍保存的800 ml專用血袋，將紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移到800 ml新袋內(nèi)，并正確轉(zhuǎn)移對(duì)應(yīng)的獻(xiàn)血碼標(biāo)識(shí)。按紅細(xì)胞離心程序離心后去除上清液。全自動(dòng)血細(xì)胞處理儀ACP215預(yù)先開機(jī)，選擇甘油化程序，正確安裝一次性使用血液甘油化管路后緩慢滴加57%的復(fù)方甘油溶液至紅細(xì)胞袋內(nèi)（1個(gè)單位紅細(xì)胞加甘油160 ml，2個(gè)單位紅細(xì)胞加甘油320 ml），邊加邊振蕩，振蕩頻率為150次/min。甘油化程序結(jié)束后室溫平衡30 min，再放入-80℃～-65℃的冰箱內(nèi)保存。

1.2 方法60袋冰凍紅細(xì)胞從冰箱取出后，立即放入37℃的水浴箱中融化，并輕緩搖動(dòng)，加速其融化。去甘油化時(shí)，把紅細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各30袋。實(shí)驗(yàn)組在去甘油化的第一階段洗滌液改用10%的蔗糖溶液500 ml，第2階段洗滌液改用濃度為10%的蔗糖溶液500 ml。分別于每次離心結(jié)束后去除上清液，充分混勻紅細(xì)胞后留取標(biāo)本5 ml進(jìn)行紅細(xì)胞回收率和甘油殘留量的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)組紅細(xì)胞回收率兩次測(cè)定結(jié)果的均值為（83.99±1.58），甘油殘留量?jī)纱螠y(cè)定結(jié)果的均值為（0.36±0.03）。對(duì)照組在去甘油化的第一階段的洗滌液選用0.9%的氯化鈉溶液500 ml，第二階段的洗滌液選用0.9%的氯化鈉溶液500 ml，同樣是分別于每次離心結(jié)束后去除上清液，充分混勻紅細(xì)胞后留取標(biāo)本5 ml進(jìn)行紅細(xì)胞回收率和甘油殘留量的測(cè)定，對(duì)照組紅細(xì)胞回收率兩次測(cè)定結(jié)果的均值為（81.79±2.07），甘油殘留量?jī)纱螠y(cè)定結(jié)果的均值為（0.35±0.09）。然后對(duì)比兩組的紅細(xì)胞回收率和甘油殘留量。冰凍紅細(xì)胞去甘油化時(shí)需要洗滌四次，實(shí)驗(yàn)組在第一次和第二次的洗滌過程中洗滌液均選用10%的蔗糖溶液500 ml，實(shí)驗(yàn)組在第三次和第四次洗滌的過程中洗滌液均選用0.9%的氯化鈉溶液500 ml。對(duì)照組四次洗滌過程中每次均選用0.9%的氯化鈉溶液500 ml。每次洗滌過程結(jié)束后都留取上清液標(biāo)本5 ml進(jìn)行血漿游離血紅蛋白含量的測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0軟件，所獲數(shù)據(jù)采用方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組紅細(xì)胞回收率和甘油殘留量比較見表1。

2.2 冰凍紅細(xì)胞去甘油化時(shí)不同洗滌次數(shù)后血漿游離血紅蛋白含量比較見表2。

表1 紅細(xì)胞回收率及甘油殘留量()

表1 紅細(xì)胞回收率及甘油殘留量()

兩組紅細(xì)胞回收率比較，t=4.6272，P＜0.0005；甘油殘留量比較，t=0.57735，P＞0.05。

組別n紅細(xì)胞回收率（%）甘油殘留量（g/L）實(shí)驗(yàn)組30 83.99±1.58 0.36±0.03對(duì)照組30 81.79±2.07 0.35±0.09

表2 去甘油化不同洗滌次數(shù)后血漿游離血紅蛋白含量比較（mg/l,）

表2 去甘油化不同洗滌次數(shù)后血漿游離血紅蛋白含量比較（mg/l,）

兩組去甘油化第1次洗滌，t=11.160，P＜0.0005；第2次、第3次、第4次洗滌，t=0.96604、0.62487、0.12487，P＞0.05

組別n第1次洗滌第2次洗滌第3次洗滌第4次洗滌實(shí)驗(yàn)組30 239.19±33.48 182.07±21.78 121.03±10.39 33.37±2.62對(duì)照組30 350.57±43.21 187.63±22.79 123.27±16.66 33.47±3.51

3 討論

冰凍紅細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是可以長(zhǎng)期的保存紅細(xì)胞，可以保存10年。通常用于自身儲(chǔ)存式輸血和稀有血型紅細(xì)胞的保存?？梢苑浅Ｓ行У慕鉀Q稀有血型患者的搶救性輸血問題。

紅細(xì)胞冰凍保存的方法分為快速和慢速冷凍法，但是快速冷凍法要頻繁更換液氮，還需要復(fù)雜的控溫儀器，在我國難以推廣。甘油化紅細(xì)胞深低溫(-80℃)冰凍保存，是目前能夠長(zhǎng)期保存紅細(xì)胞的最好方法。但冰凍紅細(xì)胞在甘油化時(shí)的整個(gè)過程都有可能導(dǎo)致溶血的發(fā)生，影響到了紅細(xì)胞的收集。所以，在紅細(xì)胞甘油化的過程中，加入甘油的速度一定不要太快，控制在15～20 min內(nèi)加完。

在冰凍紅細(xì)胞甘油化過程中，一定要將紅細(xì)胞和甘油溶液在37℃水浴箱中水浴15 min后，再緩慢滴加甘油于紅細(xì)胞袋內(nèi)，這樣可以保證紅細(xì)胞和甘油溶液溫度一致，二者相遇時(shí)可以充分融合，降低冰點(diǎn)損害[5]。

在甘油化的過程中，一定要邊加邊振蕩，但是振蕩設(shè)定的速率不要過大，以避免紅細(xì)胞發(fā)生破裂，產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，影響實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，振蕩速率以150次/min為宜。甘油化程序結(jié)束后，要在室溫中靜止平衡30 min后再冰凍，以保證甘油均勻分布于紅細(xì)胞袋內(nèi)。要排凈血袋內(nèi)的空氣，如果血袋內(nèi)的空氣太多，大的氣泡形成過程中，小氣泡不斷破裂，這樣對(duì)紅細(xì)胞是一個(gè)損害。血袋內(nèi)如有較多的氣體，在冰凍保存的過程中，氣體較多部位容易破裂，造成血液的報(bào)廢。

紅細(xì)胞在冰凍保存時(shí)，生物代謝隨著保存溫度的降低而變慢。血液在零度以下保存時(shí)，細(xì)胞損傷主要來自細(xì)胞脫水引起的化學(xué)損傷和細(xì)胞內(nèi)冰晶形成和增長(zhǎng)導(dǎo)致的機(jī)械性損傷。因此，在冰凍紅細(xì)胞去甘油化的第一個(gè)階段，采取措施對(duì)紅細(xì)胞膜進(jìn)行保護(hù)，就可以相應(yīng)減少紅細(xì)胞的破裂，是提高紅細(xì)胞回收率的關(guān)鍵階段。

冰凍紅細(xì)胞脫離低溫環(huán)境后，要快速放入37℃水浴箱中，水量要能夠完全覆蓋紅細(xì)胞袋，打開振蕩開關(guān)，輕緩振搖，使結(jié)晶的紅細(xì)胞快速融化[6]，但不要用力擠壓血袋，以減少紅細(xì)胞在融化過程中的機(jī)械性損傷，減少溶血的發(fā)生。

現(xiàn)階段，冰凍紅細(xì)胞去甘油化時(shí)，采用了鹽溶液滲透壓梯度遞減的方法進(jìn)行。通常是先加入9%的氯化鈉溶液（1個(gè)單位的紅細(xì)胞加入80 ml，2個(gè)單位加入160 ml）。充分混勻后，用0.9%的氯化鈉溶液分次洗滌，最后再用生理鹽水混懸，即成冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞。但是在紅細(xì)胞的去甘油化過程中，鹽溶液滲透壓梯度的變化，可以對(duì)紅細(xì)胞造成損害，部分紅細(xì)胞破裂造成溶血。如果在去甘油化時(shí)，加入適宜濃度非電解質(zhì)的蔗糖溶液，就會(huì)使紅細(xì)胞袋內(nèi)的電解質(zhì)濃度相應(yīng)降低，離子間的引力相對(duì)減少，與脂蛋白結(jié)合的球蛋白之間又可以相互結(jié)合起來，這樣可以使紅細(xì)胞聚集。紅細(xì)胞聚集后，就可以減少洗滌過程對(duì)紅細(xì)胞膜的沖擊力，從而降低紅細(xì)胞溶血的發(fā)生，就可以提高紅細(xì)胞的回收率。最后一次洗滌完畢，加入電解質(zhì)生理鹽水后，離子間引力增加，紅細(xì)胞又會(huì)呈現(xiàn)出懸浮狀態(tài)，且蔗糖溶液本身是一種營養(yǎng)物質(zhì)，后續(xù)的洗滌過程也會(huì)有效的清除蔗糖溶液的殘留，因此，不會(huì)增加臨床輸血反應(yīng)的發(fā)生。

為了選擇出合適的蔗糖溶液濃度，選用8%、10%、12%、14%的蔗糖進(jìn)行一系列的預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果都要測(cè)定紅細(xì)胞回收率，甘油殘留量，血漿游離血紅蛋白含量。通過實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)在去甘油化的第一階段選用10%的蔗糖溶液，可以明顯提高紅細(xì)胞的回收率。相同的方法，確定第二階段的洗滌液中同樣選用10%的蔗糖溶液。在后續(xù)的洗滌過程中，因?yàn)辂}水梯度變化已經(jīng)很小了，不再添加蔗糖溶液[7]。

冰凍紅細(xì)胞在甘油化和去甘油化過程中的關(guān)鍵，是要降低對(duì)紅細(xì)胞的損害，提高紅細(xì)胞的回收率。在制備過程中，要對(duì)關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制。去甘油化時(shí)采用改進(jìn)后的方法，顯著提高了紅細(xì)胞的回收率（P＜0.05）。而且，采用此方法制備的冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞，完全符合全血和成分血質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[8]。

[1]安乃新,于衛(wèi)建.輸血技術(shù)學(xué)[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社, 2010：165-167.

[2]姜慶紅,楊景春.細(xì)胞洗滌機(jī)去甘油化技術(shù)應(yīng)用[J].中國保健營養(yǎng),2016,26(5)：319.

[3]趙高偉.甘油殘留量測(cè)定方法改進(jìn)性能確認(rèn)[J].中國輸血雜志, 2016,29（3）：308-310.

[4]紀(jì)宏革,王麗,胡喬,等.甘油對(duì)冰凍解凍紅細(xì)胞質(zhì)量的影響探討[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2016,37(4)：564-565.

[5]王惟.冰凍紅細(xì)胞甘油化時(shí)適宜溫度的研究[J].臨床輸血與檢驗(yàn), 2016,18（5）：505-506.

[6]王凱,陳新,張網(wǎng)蘭,等.應(yīng)用MAP在4℃條件下保存冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞的質(zhì)量變化[J].臨床輸血與檢驗(yàn),2015,17（1）：74-75.

[7]于來水,康煒,宮本蘭,等.冰凍紅細(xì)胞解凍洗滌液的改良性研究[J].臨床輸血與檢驗(yàn),2016,18（2）：149-151.

[8]王凱.冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞使用MAP懸浮液對(duì)紅細(xì)胞保存期的影響[D].蘇州：蘇州大學(xué)：2015.

The Glycerin and to Glycerol of Frozen Red Blood Cells

Zhang Chengsong
(The Blood Stations of Heze City,Heze 274000,Shandong)

Objective To explore the frozen red blood cells when to glycerol to add just the right amount of sucrose solution,increasing the recovery ratio of red blood cells.Methods Choose 400 ml of the preparation of 6 days to 60 bag white suspended red blood cells,preparation of frozen red blood cells,under-80℃～-65℃refrigerator save,save 4 months later to take out the thaw to glycerol,and randomly divided into experimental group and control group,each group 30 bags. Experimental group in the first washing liquid in the process of use to glycerin 10%sucrose solution,second washing liquid to switch to 10%sucrose solution,the control group still washing with 0.9%sodium chloride solution,and then respectively to compare two groups of red blood cells,recovery of glycerin residues and to glycerol in the process of free hemoglobin content in all stages of washing.Using SPSS13.0 software,the data obtained using analysis of variance andttest. Results Two groups of red blood cells recovery,deltaP＜0.0005;Residue,glycerin,P＞0.05.Two groups to glycerol first washing comparison,P＜0.0005.Second washing,3 times of washing,4 times of washing,P＞0.05.Conclusion Frozen red blood cells to glycerin is changed in the process of the first stage of the washing process is very important,to protect the red blood cells can significantly improve erythrocyte recovery.

Frozen red blood cells;Glycerolize;To remove glycerol;Room temperature balance;Sucrose solution

R331.141;R457

：A

：1008-4118（2017）02-0066-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2017.02.023

2017-03-24