PEG化脂質(zhì)納米粒促進(jìn)積雪草酸口服吸收研究

張雅雯　尹麗娜　黃夏櫻　梁澤華　陳曉曉　王勝浩

[摘要]采用溶劑擴(kuò)散法制備聚乙二醇修飾的積雪草酸（asiatic acid，AA）納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（pegylated asiatic acid loaded nanostructured lipid carriers，pAANLC），以結(jié)扎腸循環(huán)模型考察其在小腸的吸收分布情況，HPLC檢測健康SD大鼠灌胃給予pAANLC后的膽汁藥物濃度，間接評價(jià)PEG化脂質(zhì)納米粒的促口服吸收作用。結(jié)果顯示，經(jīng)PEG親水性修飾的NLC在小腸黏膜的穿透能力大大提高，小腸內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著增加，大鼠體內(nèi)藥物排泄峰值Cmax較普通納米粒（asiatic acid loaded nanostructured lipid carriers，AANLC）提高了76%，達(dá)峰時(shí)間tmax減慢，消除半衰期t1/2延長1倍，AUC0→t為AANLC組的15倍，提示AANLC經(jīng)PEG親水性修飾后，口服生物利用度顯著提高。

[關(guān)鍵詞]積雪草酸； 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體； 聚乙二醇； 口服吸收

[Abstract]A solvent diffusion method was used to prepare pegylated asiatic acid （AA） loaded nanostructured lipid carriers （pAANLC）， and the ligated intestinal circulation model was established to observe the absorption and distribution in small intestine The concentration of AA in bile after oral administration of pAANLC was detected by HPLC in healthy SD rats to indirectly evaluate the oral absorption promoting effect of PEGmodified namoparticles The results showed that the penetration of pAANLC was enhanced significantly and the transport capacity was increased greatly in small intestinal after PEG modification As compared with the normal nanoparticles （AANLC）， the Cmax of the drug excretion was increased by 76%， the time to reach the peak （tmax ） was decreased and the elimination halflife t1/2 was doubled in the rats after oral administration of pAANLC， and the AUC0→t was 15 times of the AANLC group， indicating that the oral bioavailability of AANLC was significantly improved by hydrophilic modification of PEG

[Key words]asiatic acid； nanostructured lipid carrier； PEG； oral absorption

積雪草酸（asiatic acid，AA）為傘形科積雪草屬植物積雪草Centella asiatica L Urban的有效成分之一，屬于五環(huán)三萜酸，具有治療皮膚創(chuàng)傷、護(hù)肝、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[14]，其代謝產(chǎn)物主要經(jīng)膽汁排泄。AA水中溶解度極小，胃腸道吸收差，體內(nèi)消除較快，口服生物利用度低[5]。本實(shí)驗(yàn)室早期制備了積雪草酸納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（asiatic acid loaded nanostructured lipid carriers，AANLC），但生物利用度改善不顯著[6]，這可能與粒子易被高度黏彈性、附著性的腸道黏膜阻擋而無法進(jìn)入體循環(huán)有關(guān)[78]。

聚乙二醇（PEG）是一種無毒、無免疫原性及抗原性化合物，被FDA批準(zhǔn)可用于注射液、口服制劑。納米脂質(zhì)載體經(jīng)低分子量的PEG（如2 kDa）修飾后，可提高粒子的親水性，降低靜電作用與網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除速率，提高某些藥物的相對生物利用度[911]。因此，本研究以聚乙二醇單硬脂酸酯（PEG2000SA，簡稱PEG）為修飾材料，制得親水性的積雪草酸納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（pegylated asiatic acid loaded nanostructured lipid carriers，pAANLC），通過比較修飾前后納米粒在小腸的吸收分布差異和在體內(nèi)的吸收特點(diǎn)，初步評價(jià)親水性修飾納米粒改善AA口服吸收的作用。

1儀器與材料

11儀器

LC20AD型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；電子天平（AL104，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（LSM710，Zeiss）；NanoZS90粒徑與表面電位分析儀（Malvern Instruments Ltd，UK）；JY922D超聲波細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LGJ10D冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）。

12藥品與試劑

AA（廣西昌洲天然產(chǎn)物開發(fā)有限公司，純度>99%，批號20080625）；甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA，內(nèi)標(biāo)，上海晨易生物科技有限公司，純度>99%，批號200600509）；AANLC與pAANLC（實(shí)驗(yàn)室自制）；PEG（PEG2000SA，Tokyo Chemical Industry，Japan）；硬脂胺異硫氰酸熒光素（ODAFITC，實(shí)驗(yàn)室自制）；硫酸酯酶（效價(jià)23 500 U·g-1）和葡醛酸酶（效價(jià)1萬 U·mg-1）均購自SigmaAldrich；甲醇、乙腈（色譜純，Merck KGaA，Germany），其他試劑均為分析純。

13動(dòng)物

清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20） g，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號SCXK（浙）20140001。

2方法與結(jié)果

21pAANLC的制備與評價(jià)

211納米粒的制備

以單硬脂酸甘油酯與油酸為脂質(zhì)材料，按照文獻(xiàn)方法[12]制備pAANLC。即精密稱取10 mg油酸，40 mg單硬脂酸甘油酯，適量PEG及藥物AA，溶于3 mL無水乙醇中，70 ℃水浴下加至同溫度水中，500 r·min-1機(jī)械攪拌5 min后，得帶乳光的納米分散液。該分散液經(jīng)減壓濃縮、凍干，可得固體粉末。以O(shè)DAFITC作為熒光標(biāo)記物替代AA，同法制備熒光標(biāo)記的納米粒（NLC與pNLC）。

212納米粒的理化性質(zhì)評價(jià)

2121粒徑大小與表面電位納米分散液，以水為分散介質(zhì)，超聲分散，用NanoZS90粒徑與表面電位分析儀測定pAANLC粒徑為（1112±29） nm，表面電位為（-371±09） mV（n=3）。

2122包封率和載藥量參考文獻(xiàn)方法[12]測定包封率（entrapment efficiency，EE）和載藥量（drugs loading efficiency，DL），所采用的色譜方法專屬性、準(zhǔn)確度和精密度良好。精密稱取納米粒凍干粉末（W0），以30%乙醇溶液為分散介質(zhì)，超聲分散，得分散液。①取該分散液適量，2萬 r·min-1離心5 min，精密移取上清液適量，無水乙醇稀釋，045 μm微孔濾膜過濾，HPLC測定游離藥物量（Wfree）。②精密移取分散液適量，無水乙醇稀釋，于70 ℃水浴保溫30 min，冷卻至室溫，045 μm微孔濾膜過濾，HPLC測定續(xù)濾液中總藥物量（Wtotal）。按照公式（1）與公式（2）計(jì)算可得，pAANLC包封率為（911±05）%，載藥量為（154±02）%（n=3）。

包封率=（Wtotal-Wfree）/W投藥量×100% （1）

載藥量=（Wtotal-Wfree）/W0×100% （2）

22大鼠腸道吸收分布考察

221試驗(yàn)方案

采用結(jié)扎腸循環(huán)模型[7]評價(jià)NLC及pNLC在小腸的吸收情況。取自然飲水條件下禁食12 h的雄性SD大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉（40 mg·kg-1），背位固定，沿腹中線打開腹腔，小心分離出空腸段，用37 ℃ KrebsRinger溶液沖洗腸內(nèi)容物，分別注入高、低2檔濃度的NLC，pNLC（100，200 mg·L-1，1 mL），將腸管兩端結(jié)扎，放回大鼠腹腔，2 h后將大鼠處死，取出相應(yīng)的腸段，沖洗腸段內(nèi)容物及未被吸收的藥物。腸段經(jīng)冷凍包埋液包埋，冷凍切片及DAPI染色后，用激光共聚焦顯微鏡觀察納米粒在大鼠小腸的分布情況。

222納米粒腸道吸收情況

為使納米粒在小腸的吸收更加可視化，本研究采用雙熒光標(biāo)記法進(jìn)行，即納米粒用ODAFITC進(jìn)行標(biāo)記（綠色），小腸細(xì)胞核以DAPI試劑染色（藍(lán)色）。將納米粒溶液注入小腸管后，可能會(huì)發(fā)生3種情況：滯留于小腸管；粘附于黏液纖維上，無法穿過黏液層；穿過黏液層并且進(jìn)入小腸上皮細(xì)胞。

2種納米粒在小腸微絨毛分布的激光共聚焦圖（圖1），藍(lán)色熒光代表小腸細(xì)胞的細(xì)胞核，綠色熒光為納米粒。結(jié)果顯示，NLC的綠色熒光只出現(xiàn)在小腸微絨毛的邊緣，當(dāng)提高納米濃度，仍然只有極少量的粒子透過微絨毛；而經(jīng)親水修飾的pNLC能較順利的穿過小腸微絨毛上的黏液層，且隨著納米濃度的增大，透過黏液層的納米粒越多，進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)部的量也更多。

23大鼠口服吸收的初步評價(jià)

231試驗(yàn)方案

取健康雄性SD大鼠10只，分成2組，每組5只，禁食過夜（不禁水）。戊巴比妥鈉麻醉，背部固定，沿腹中線打開腹腔，膽總管插管，并結(jié)扎固定，縫合創(chuàng)口，采集空白膽汁，待動(dòng)物清醒后以50 mg·kg-1的劑量分別灌胃給予AANLC與pAANLC分散液（藥物質(zhì)量濃度約5 g·L-1），于給藥后0～1，1～2，2～3，3～4，4～5，5～6，6～8，8～10，10～12，12～24 h采集膽汁，記錄膽汁體積。

232膽汁樣品的處理

精密移取GA溶液25 μL置干燥試管中，氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)貌煌瑫r(shí)間膽汁樣品50 μL溶解，用002 mol·L-1乙酸調(diào)至pH 5，加入硫酸酯酶（011 U·μL-1）和葡醛酸酶（25 U·μL-1）各10 μL，混勻，37 ℃水浴下酶解24 h后立即取出12 000 r·min-1，離心5 min。將上清液移至另一試管，加入甲基叔丁基醚1 mL提取，渦旋5 min，12 000 r·min-1，離心5 min，取上清液氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)尤隕DC·HCl溶液和對甲苯胺溶液適量衍生化3 h，氮?dú)獯蹈?，殘余物用甲醇乙腈水?75∶375∶25）100 μL溶解，混勻，12 000 r·min-1，離心5 min，吸取上清液進(jìn)樣分析。

233標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取AA和GA 50 mg，各置50 mL量瓶，用甲醇溶解并定容，得AA和GA貯備液質(zhì)量濃度1 g·L-1。4 ℃保存，3個(gè)月穩(wěn)定。

精密移取GA貯備液1 mL置25 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻得40 mg·L-1的GA溶液。分別精密移取AA貯備液適量和上述GA溶液25 μL置干燥試管中，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?0 μL空白膽汁混勻，按232項(xiàng)處理，最終制成AA質(zhì)量濃度為1，2，5，10，20，40，80 mg·L-1的系列溶液。同法制備質(zhì)控樣品質(zhì)量濃度為2，10，40 mg·L-1。

234HPLC方法的建立與驗(yàn)證

2341色譜條件參考已建立的方法[6]進(jìn)行：色譜柱 Diamonsil C8（46 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇乙腈（1∶1）（A），水（B）；梯度洗脫：0～10 min，25% B；10～25 min，11%～25% B，25～28 min，25% B；流速10 mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測波長248 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2342方法學(xué)評價(jià)采用梯度洗脫測定膽汁中的藥物濃度，AA保留時(shí)間在11 min左右，GA保留時(shí)間20 min左右，空白膽汁中的內(nèi)源性雜質(zhì)對兩者檢測均無干擾，顯示良好的專屬性（圖2）。以AA質(zhì)量濃度Y（mg·L-1）為縱坐標(biāo)，AA與GA峰高的比值X為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程Y=4949X+0219（r=0999 5），顯示AA在1～80 mg·L-1線性關(guān)系良好。方法的日內(nèi)、日間精密度均<5%，方法回收率>90%，AA與內(nèi)標(biāo)的提取回收率均>80%（表1）。

235吸收動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析

膽汁排泄率計(jì)算公式：

膽汁排泄率（μg·h-1）=各時(shí)間段膽汁排泄量/t

利用藥物統(tǒng)計(jì)軟件（PKS 10， Shanghai Magnsoft Consulting）計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，藥物峰濃度Cmax和達(dá)峰時(shí)間tmax為實(shí)測值，排泄速率時(shí)間曲線下面積（AUC0t）通過梯形法計(jì)算得到。采用SPSS 190統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

236大鼠口服納米粒后的吸收動(dòng)力學(xué)

取大鼠灌胃AANLC或pAANLC后收集的膽汁樣品適量，經(jīng)酶解、液液提取富集等技術(shù)，采用HPLC方法檢測不同時(shí)間段膽汁中的藥物總濃度。

結(jié)果顯示，脂質(zhì)納米粒經(jīng)PEG親水性修飾后，膽汁中Cmax顯著提高（提高76%，P<001），達(dá)峰時(shí)間tmax有所減慢，消除半衰期t1/2延長1倍，AUC0t為修飾前的15倍（表2）。膽汁中總AA排泄速率時(shí)間曲線（圖3），AANLC經(jīng)PEG修飾后，體內(nèi)滯留時(shí)間大大延長，藥物水平有了明顯提高，24 h累計(jì)排泄量較修飾前增加了50%（圖4）。

3討論

對NLC進(jìn)行表面修飾，主要考慮納米表面的親水親脂性、表面電荷及空間特性等因素的影響。粒子表面親脂性越強(qiáng)，吞噬細(xì)胞對其吞噬能力也越大，因此本研究以低分子量的PEG2000SA為材料對納米粒進(jìn)行表面修飾，改善其親水性，以減少吞噬細(xì)胞的識別與吞噬。由于SA鏈與脂質(zhì)材料有良好的相容性，可作為親脂端插入到納米粒的核心，而具有一定柔韌性的PEG鏈作為親水端處于納米粒的表面，伸向水中，使納米粒的空間結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變，一方面使粒子間產(chǎn)生足夠大的斥力，提高粒子的穩(wěn)定性而不聚集，另一方面，也能夠阻止蛋白質(zhì)的吸附和躲避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕捉，延長納米粒在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，提高生物利用度[1011]。另外，NLC主要依靠細(xì)胞攝取進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，經(jīng)修飾后的NLC細(xì)胞旁路途徑轉(zhuǎn)運(yùn)會(huì)有較大的增加，轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的改變，也可能影響藥物吸收[13]。

AA經(jīng)腸道吸收后，在肝臟發(fā)生二相代謝，主要代謝產(chǎn)物為葡醛酸結(jié)合物和硫酸酯結(jié)合物，且以膽汁途徑排泄為主[14]。本研究通過建立清醒大鼠膽汁引流模型，檢測膽汁中AA的總濃度可間接反映藥物在體內(nèi)的吸收動(dòng)力學(xué)。本文比較了PEG修飾前后納米粒的小腸吸收分布與膽汁排泄特征，發(fā)現(xiàn)納米粒的親水性增大，可明顯提高小腸黏膜的透過能力，大大延長藥物體內(nèi)滯留時(shí)間，提高藥物水平，進(jìn)一步改善口服生物利用度，為新型納米制劑的開發(fā)利用提供了依據(jù)。

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[責(zé)任編輯張燕]