含揮發(fā)油飲片桂枝飲片標準湯劑質量標準的建立及探討

鄧哲　馮偉紅　章軍　焦夢姣　張國瑗　王淑慧　程錦堂　劉安

[摘要]制備桂枝飲片標準湯劑并建立質量標準，為配方顆粒等臨床非傳統用藥形式提供質量參照，同時也為含揮發(fā)油的飲片標準湯劑研究提供參考。從市場上收集14批不同質量的桂枝飲片，在中藥飲片標準湯劑制備原則基礎上進一步完善提取工藝，制備桂枝飲片標準湯劑，計算出膏率、桂皮醛的轉移率、pH等參數，評價工藝穩(wěn)定性；建立指標成分含量測定方法和特征圖譜。結果表明桂枝飲片標準湯劑的出膏率為606%～895%，平均出膏率為718%；桂皮醛轉移率為296%～543%，平均轉移率為432%；pH 433～482。14批桂枝飲片標準湯劑特征圖譜與對照特征圖譜相似度均>09。該研究建立的制備方法穩(wěn)定、質量標準完善，適用于桂枝飲片標準湯劑質量評價。

[關鍵詞]桂枝飲片； 揮發(fā)油； 標準湯劑； 質量標準

[Abstract]To prepare Cinnamomi Ramulus pieces standard decoction and establish its quality standard， provide quality reference for formula granules and other clinic nontraditional forms of medicines， and lay a foundation for standard decoction research for the pieces containing essential oil 14 batches of Cinnamomi Ramulus pieces with different quality were collected from market and their extraction process was further improved based on the preparation principle of standard decoction to prepare the standard decoction of Cinnamomi Ramulus pieces Then its transfer rate of Cinnamaldehyde， dry extract rate and pH value were calculated to evaluate its process stability； and a method for chromatographic fingerprint and content determination was also established Results revealed that the dry extract rate for standard decoction of Cinnamomi Ramulus pieces was from 606%895%， with an average value of 718%； the transfer rate of cinnamaldehyde was at the range of 296%543%， with an average of 432%； and the pH value was at the range of 433482 The fingerprint similarities between 14 batches of standard decoction of Cinnmomi Rammulus pieces and reference fingerprint were all>09 The established method for standard decoction was stable and its quality standard was perfect， suitable for evaluating the quality of standard decoction of Cinnanomi Ramulus pieces

[Key words]Cinnamomi Ramulus pieces； volatile oil； standard decoction； quality standard

中藥飲片標準湯劑是以中醫(yī)理論為指導、臨床應用為基礎，參考現代提取方法，經標準化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑，用于標化臨床用藥，保障用藥的準確性和劑量的一致性[1]。中藥標準湯劑作為一種標準物質和標準體系，可以標化所有以水為溶媒的包括配方顆粒在內的新型用藥形式。它能夠有效的解決配方顆粒標準不統一而導致配方顆粒市場“亂”相的問題[2]。2016年8月5日國家藥典委起草的“中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求（征求意見稿）”也明確提出中藥配方顆粒的所有藥學研究均須與標準湯劑進行對比，以保證與標準湯劑質量一致性。

桂枝來源于樟科植物肉桂Cinnamomun cassia Presl的干燥嫩枝。其辛、溫、甘，歸心、肺、膀胱經，具有發(fā)汗解肌、溫通經脈、助陽化氣、平沖降氣之功效[3]。臨床多用于風寒感冒、脘腹冷痛、血塞經閉、關節(jié)痹痛、痰飲、水腫、心悸等癥?，F代藥理研究表明它有抑菌、抗炎、抗過敏、抗腫瘤、抗病毒、利尿、解熱、鎮(zhèn)痛、擴張血管等多種藥理活性[4]。桂枝主要含有揮發(fā)性成分、有機酸類、香豆素類等化學成分，其中以桂皮醛為主的揮發(fā)性成分是其發(fā)揮藥效的物質基礎。據統計，它是《傷寒論》中繼甘草臨床應用第二多的藥物。結合文獻，有關標準湯劑研究的報道主要集中在不含揮發(fā)油的中藥飲片上，如黃芩[5]、甘草[6]、白芍[7]、人參[8]、紅花[9]、葛根[10]等。而對于含揮發(fā)油、指標成分水溶性差的飲片鮮有文章報道。本文開展了桂枝飲片標準湯劑質量標準研究，以期為含揮發(fā)油類成分的中藥飲片標準湯劑研究提供參考。

1材料

11儀器與試劑

Waters Alliance高效液相色譜儀（美國Waters公司，2695四元溶劑管理器，2996二極管陣列檢測器，Empower 3色譜工作站），XS205型1/10萬電子分析天平（瑞士，梅特勒托利多儀器有限公司）；KQ250 DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；桂皮醛對照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，經HPLC面積歸一化法測定，純度> 98%，批號CHBG029），甲醇、乙腈均為HPLC級（美國，Fisher公司），水為娃哈哈純凈水，其他試劑為均分析純。

12樣品

本研究共收集了14批桂枝飲片，其來源于市場上7家中藥飲片企業(yè)，包含3個不同產地及不同品質的飲片。經DNA條形碼鑒定，14批樣品均為樟科植物肉桂C cassia的干燥嫩枝。其具體信息見表1。

2方法與結果

21桂枝飲片桂皮醛含量測定

按照2015年版《中國藥典》方法測定14批桂枝飲片中桂皮醛的含量，見表2。結果表明14批桂枝飲片均符合桂皮醛不得少于10%的限量要求。

22桂枝飲片標準湯劑的制備

將符合藥典標準的飲片，在《中藥標準湯劑研究策略》一文中建議枝干皮藤類煎煮工藝的基礎上，稍作改進，進行桂枝飲片標準湯劑的制備。其具體工藝參數為：取桂枝飲片100 g，加8倍量的水浸泡30 min后，置揮發(fā)油提取器中提取2 h，接出揮發(fā)油，水提液濾過，藥渣再加7倍量的水，于揮發(fā)油提取器中繼續(xù)提取30 min，接出揮發(fā)油，水提液濾過。合并2次水提液，濃縮至適量，合并2次提取的揮發(fā)油，加入濃縮液中，并加入適量的聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫80），混勻，定容至500 mL，搖勻，得到規(guī)格為02 g·mL-1的桂枝飲片標準湯劑。

23桂枝飲片標準湯劑中桂皮醛含量測定

231色譜條件Chromegabond WR C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm），乙腈（A）水（B），梯度洗脫（0 ～ 30 min，10% ～ 40% A；30 ～ 45 min，40% A），柱溫30 ℃，流速1 mL·min-1，檢測波長290 nm，進樣量10 μL。在此條件下，供試品溶液中的桂皮醛與其他成分分離良好，見圖1。

232對照品溶液的制備取經五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的桂皮醛對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含24 μg的溶液，即得。

233供試品溶液的制備取桂枝飲片標準湯劑搖勻，精密吸取量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過022 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

234線性關系考察精密吸取232項下的桂皮醛對照品溶液02，2，3，4，5，6，7，8，9 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，按231項下方法進樣，測定桂皮醛的峰面積，以桂皮醛的進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到回歸方程Y=108×107X+325×104，R2= 0999 9，線性范圍0024 0～108 μg。

235精密度試驗取同一桂枝飲片標準湯供試品溶液，按231項下色譜條件方法連續(xù)進樣6次，計算供試品溶液中桂皮醛的峰面積的RSD為020%，表明儀器精密度良好。

236重復性試驗平行制備6份桂枝飲片標準湯劑供試品溶液，按231項下色譜條件進樣，結果桂枝飲片標準湯劑中桂皮醛的平均含量為083 g·L-1，RSD 為11%，表明該方法的重復性良好。

237穩(wěn)定性試驗取桂枝飲片標準湯劑供試品溶液，分別于供試品溶液制備后0，2，4，8，12，24 h按231項下色譜條件測定，計算桂皮醛的峰面積的RSD為030%，表明供試品溶液在制備后24 h內穩(wěn)定。

238加樣回收試驗取已知含量的桂枝飲片標準湯劑（099 g·L-1），根據標準湯劑中桂皮醛的含量按約1∶1的量添加桂皮醛對照品（0495 9 mg），平行制備6份供試品溶液，按231項下色譜條件進行試驗，計算供試品溶液中桂皮醛的平均加樣回收率為9520%，RSD為045%，表明該方法的準確度較好。

239樣品測定精密吸取對照品溶液20 μL、桂枝飲片標準湯劑供試品5 μL按231項下色譜條件測定，按外標一點法計算桂皮醛含量，測定14個批次，每批次平行2份，結果見表2。

24桂枝飲片標準湯劑轉移率計算及其他參數測定

241轉移率計算以桂皮醛為指標，計算其轉移率，得出桂皮醛轉移率為296%～543%，平均轉移率為432%，結果見表2。

242其他參數測定pH用pH計（sartorius PB10）測定，pH 433～482，結果見表2。出膏率取桂枝飲片標準湯劑適量，搖勻，精密吸取10 mL置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，稱定質量，每批平行2份，出膏率為606%～895%，平均出膏率為718%。結果見表2。

25特征圖譜的建立

251色譜條件同231項色譜條件，稍有不同是特征圖譜檢測波長為254 nm。

252供試品溶液制備同233項下供試品溶液制備方法。

253精密度試驗取同一批桂枝飲片標準湯劑（GZ09）供試品溶液，按231項下方法連續(xù)進樣6次，以桂皮醛峰（7號峰）為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD，結果表明各峰相對保留時間RSD<01%，相對峰面積RSD<20%，表明儀器精密度良好。

254重復性試驗平行制備6份桂枝飲片標準湯劑（GZ09）供試品溶液，按231項下方法進樣，測定桂枝標準湯劑供試品溶液中各特征峰的保留時間和峰面積。以桂皮醛峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD，結果表明各峰相對保留時間的RSD<030%，相對峰面積的RSD<20%，表明該方法的重復性較好。

255穩(wěn)定性試驗取桂枝飲片標準湯劑（GZ09）供試品溶液，分別于供試品溶液制備后第0，2，4，8，12，24 h按231項下方法進樣測定，以桂皮醛為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果各峰相對保留時間的RSD<020%，相對峰面積的RSD<19%，表明桂枝標準湯劑供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

256樣品檢測與分析分別取14批桂枝飲片標準湯劑，按233項下方法制備供試品溶液，再按251項下色譜條件分別測定，記錄HPLC圖，見圖2。將14批供試品色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2004A），采用中位數法，時間窗為01，進行相似度計算，見圖3，表3。結果發(fā)現14批桂枝飲片標準湯劑與對照特征圖譜相似度均>09，表明各批次桂枝飲片標準湯劑具有較好的一致性。

26工藝穩(wěn)定性驗證

取同一批飲片樣品（GZ09），按22項下桂枝飲片標準湯劑制備方法平行制備3份標準湯劑試樣，分別按233項下供試品溶液制備方法制備供試品，依照231項下色譜條件測定桂枝飲片標準湯劑中桂皮醛的含量，計算轉移率，并進行其他參數的測定。3次試驗中桂皮醛的平均質量分數為1012 g·L-1，RSD為95%；平均轉移率為464%，

3討論

31不同品質的樣品

本研究收集了廣西、廣東、湖北3個產地的桂枝飲片，以廣西居多，其中廣西既是道地產區(qū)也是主產區(qū)。同時這些桂枝飲片來源于7個幾乎分散全國的不同廠家，包含有不同規(guī)格、不同生產日期的飲片。所研究的樣品基本能代表市場上所有流通的桂枝飲片。

32供試品處理考察

對桂枝飲片標準湯劑前處理重點考察了溶劑種類和稀釋倍數。溶劑種類中考察了純水、無水乙醇、甲醇3種溶媒，結果發(fā)現甲醇處理效果最優(yōu)，測得的桂皮醛含量最高。稀釋倍數考察了5，10，25，50倍，不同稀釋倍數，桂皮醛含量接近，10倍稍高點，因此選擇稀釋10倍。所以桂枝飲片標準湯劑前處理為取1 mL樣品，用甲醇稀釋10倍。

33桂枝飲片外觀形態(tài)與標準湯劑中指標成分含量、轉移率和出膏率的相關性

桂枝飲片目前主要是切斜片和切段2種形式。桂枝飲片的同外觀形狀是否直接影響到湯劑中桂皮醛含量、轉移率及出膏率？從研究結果分析，轉移率及出膏率與外觀形狀沒有顯著的關系，而與湯劑中桂皮醛含量相關。一般個小的桂枝飲片其湯劑中桂皮醛含量相對較高。這與藥典規(guī)定的桂枝來源于嫩枝以及桂皮醛主要分布在桂枝皮部[11]結果相一致。同時，這也為感官鑒別桂枝飲片質量提供了參考。

34工藝改進

前期預實驗中隨機選取了GZ08樣品，嚴格按照《中藥飲片標準湯劑研究策略》給定的工藝參數，采取回流提取，不單獨提取揮發(fā)油，分別制備濃縮前和濃縮后的樣品，發(fā)現濃縮后桂皮醛的轉移率偏低，為104%；而濃縮前轉移率為462%。從中可以推斷，濃縮過程顯著的影響桂皮醛的含量。為解決濃縮后轉移率偏低問題，經查文獻[1214]，發(fā)現以桂皮醛為指標成分含量測定時，桂枝的提取大多是用揮發(fā)油提取器提取或水蒸氣蒸餾的方法。因考慮到水蒸氣蒸餾同時會帶有大量的水，后期可能還是面臨濃縮過程。因此，選擇了揮發(fā)油提取器提取的方法。桂枝揮發(fā)油是重油，因此采用重油揮發(fā)提取器按照標準湯劑工藝參數提取。將所得的湯劑濃縮至適量，兌入提取出的揮發(fā)油。通過提取揮發(fā)油后兌入的方法，桂皮醛的轉移率與濃縮前相當。有文獻報道[15]桂枝配方顆粒的研究也需要單獨提取出揮發(fā)油，將提取出的揮發(fā)油經過β環(huán)糊精包合后，然后濃縮、干燥、制粒。因此，對于檢測指標為揮發(fā)性成分且含有揮發(fā)油的，應針對品種特性，重視揮發(fā)油的提取。對于一煎提取時間的確定，依據文獻[16]確定為2 h，加8倍水量，每100 g飲片可提出069 mL揮發(fā)油。對于二煎提取時間的確定，考察了20，30，60 min揮發(fā)油的體積，結果30 min較為合適。因此，確定一煎為2 h，二煎為30 min。

35出膏率問題

出膏率是指固體物得率，一般方法為取適量溶液，105 ℃烘3 h，置干燥器冷卻30 min，稱定質量。而對于桂枝飲片，為快速簡便，仍可以采用這種方法。因為桂枝飲片提取的揮發(fā)油量少，對出膏率的結果幾乎沒有影響。但是，對于含揮發(fā)油量多的飲片，必須把溶液和揮發(fā)油分開，建議做法為取適量溶液（未兌入揮發(fā)油），105 ℃烘3 h，置干燥器冷卻30 min，加入揮發(fā)油，稱定質量。這樣就可以避免干燥過程中揮發(fā)油損失而造成出膏率結果不恰當的問題。

36桂枝飲片標準湯劑的應用

為滿足現代人生活方便、快捷的需求，中藥飲片出現了多種創(chuàng)新形式，如超微顆粒、破壁飲片、配方顆粒。這些新型飲片形態(tài)上失去了傳統飲片的鑒別特征，內在質量又缺失統一的評價標準，不利于市場監(jiān)管和流通。中藥飲片標準湯劑正是為了解決上述問題應運而生，它從定量和定性2個方面共同把控包括配方顆粒在內的新型用藥形式質量。定量指標包括轉移率范圍、出膏率范圍、pH范圍，它能為內在質量評價提供合理的參照數值；定性指標為飲片標準湯劑特征圖譜，它能從譜圖信息上彌補對傳統飲片的鑒別。因此，定量和定性指標之間是相輔相成，共同構成了一個完整的質量標準評價體系。本文對桂枝飲片標準湯劑也著重從定量和定性兩方面加以研究，建立了一套完整的桂枝飲片標準湯劑質量評價體系。因此，它對桂枝配方顆粒在內的新型飲片形式具有標準參照的作用。

[參考文獻]

[1]陳士林，劉安，李琦，等中藥飲片標準湯劑研究策略[J] 中國中藥雜志，2016，41（8）：1367

[2]李睿，翟華強，田偉蘭，等中藥煮散的歷史淵源及其現代配方顆粒的對比性分析[J]中國中藥雜志，2016，41（6）：965

[3]中國藥典一部[S]2015：276

[4]許源，宿樹蘭，王團結，等桂枝的化學成分和藥理活性研究進展[J]中草藥，2013，36（4）：674

[5]李琦，章軍，崔文金，等黃芩飲片標準湯劑的制備和質量標準評價[J]中國實驗方劑學雜志，2017，23（4）：36

[6]林偉雄，樂智勇，車海燕，等甘草飲片標準湯劑的研究[J]中國中藥雜志，2017，42（3）：6

[7]朱廣偉，李西文，陳士林白芍飲片標準湯劑質量標準研究[J]世界中醫(yī)藥，2016，11（5）：753

[8]張鵬，鄔蘭，李西文，等人參飲片標準湯劑的評價及應用探討[J]中國實驗方劑學雜志，2017，23（11）：1

[9]董青，趙嶸，代云桃，等紅花標準湯劑的質量評價[J]中國實驗方劑學雜志，2017，23（7）：12

[10]孫瑩瑩，郭濤，李西文，等葛根飲片標準湯劑的研究[J]世界中醫(yī)藥，2016，11（8）：1586

[11]林佳，徐麗珍，劉江云，等桂枝中桂皮醛、肉桂酸的含量與分布研究[J]中國藥學雜志，2005，40（23）：1784

[12]路麗，關琴笑，趙路，等桂枝茯苓復方中桂枝揮發(fā)油提取及其包合工藝研究[J] 亞太傳統醫(yī)藥，2015，11（1）：20

[13]薛丹，倪健，尹興斌，等 桂枝、干姜、肉桂、辛夷混合揮發(fā)油提取及包合工藝研究[J] 中國中醫(yī)藥信息雜志，2016，23（3）：70

[14]萬里江，范正達，唐風雷，等 桂枝揮發(fā)油的提取及抗菌試驗的考察[J] 海峽藥學，2008，20（12）：32

[15]劉勇，陳娟，戚歡陽，等桂枝配方顆粒提取制備工藝及其鑒別的研究[J]中草藥，2009，40（增刊）：149

[16]李碧淵，吳鑫，曹崗正交實驗優(yōu)選桂枝和肉桂配伍后揮發(fā)油的最佳提取工藝[J]中國中醫(yī)藥科技，2015，22（5）：520

[責任編輯孔晶晶]