山梨獼猴桃根化學(xué)成分及細(xì)胞毒活性研究

黃初升　馬思遠(yuǎn)　劉紅星　陸倩　石靈高　廖娜　韋柳斌

[摘要]探究山梨獼猴桃Actinidia rufa根的化學(xué)成分。采用葡聚糖凝膠色譜法、薄層色譜硅膠色譜法、高效液相色譜法等方法分離得到9個(gè)化合物，鑒定為：2α， 3β， 19α， 23， 24五羥基烏蘇12烯28OβD吡喃葡萄糖苷（1）、2α， 3α， 19α， 24四羥基烏蘇12烯28OβD吡喃葡萄糖苷（2）、2α， 3α， 24三羥基烏蘇12烯28酸（3）、2α， 3α， 24三羥基齊墩果12烯28酸（4）、2α， 3α， 23， 24四羥基烏蘇12烯28酸（5）、2α， 3β， 23， 24四羥基烏蘇12烯28酸（6）、2α， 3β， 23三羥基烏蘇12烯28酸（7）、2α， 3β， 23三羥基烏蘇12， 20（30）二烯28酸（8）、2α， 3α， 24三羥基烏蘇12， 20（30）二烯28酸（9），其中化合物1和2為首次從該屬植物中分離得到。細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果顯示化合物2～4 對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKVO3和人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株TPC1具有強(qiáng)的細(xì)胞毒活性（IC50在1099～1641 μmol·L-1），而化合物3，4對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa具有強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，IC50分別為1553，1307 μmol·L-1。

[關(guān)鍵詞]獼猴桃屬； 山梨獼猴桃； 三萜； 抗腫瘤

[Abstract]To investigate the chemical compounds from the roots of Actinidia rufa， nine compounds were isolated by various column chromatography on silica gel and Sephadex LH20， and high performance liquid chromatography （HPLC） Their structures were elucidated as 2α， 3β， 19α， 23， 24pentahydroxyurs12en28oic acid28OβDglucopyranoside （1）， 2α， 3α， 19α， 24tetrahydroxyurs12en28oic acid28OβDglucopyranoside （2）， 2α， 3α， 24trihydroxyurs12en28oic acid （3）， 2α， 3α， 24trihydroxyolean12en28oic acid （4）， 2α， 3α， 23， 24tetrahydroxyurs 12en28oic acid （5）， 2α， 3β， 23， 24tetrahydroxyurs12en28oic acid （6）， 2α， 3β， 23trihydroxy12en28oic acid （7）， 2α， 3β， 23trihydroxyurs12， 20（30）dien28oic acid （8）， and 2α， 3α， 23trihydroxyurs12， 20（30）dien28oic acid （9） Compounds 1 and 2 were isolated from the Actinidia genus for the first time Compounds 2， 3， and 4 showed cytotoxic activity against human SKVO3 and TPC1 cancer cell lines with IC50 values ranging from 1099 to 1641 μmol·L-1， compounds 3 and 4 have cytotoxic activity against human HeLa cancer cell line with IC50 values of 1553 and 1307 μmol·L-1， respectively

[Key words]Actinidia； Actinidia rufa； triterpenoids； antitumor

山梨獼猴桃Actinidia rufa Planch為獼猴桃科獼猴桃屬植物，藥用其根或根皮[1]，產(chǎn)于廣西山區(qū)龍勝、德保等縣。獼猴桃屬植物自古以來(lái)就有藥用作用，古代藥書(shū)《山海經(jīng)·中山經(jīng)》、《本草拾遺》、《本草綱目》等均有記載[1]；中醫(yī)認(rèn)為其果性寒，味酸、甘，能調(diào)理中氣、生津潤(rùn)燥、解熱除煩、通淋，用于治療消化不良、食欲不振、嘔吐、燒燙傷；其根或根皮性寒、味苦澀，能清熱解毒、活血消腫、祛風(fēng)利濕，用于治療肝炎、水腫、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、痢疾、絲蟲(chóng)病、淋巴結(jié)核、癰癤腫毒、帶下、胃癌、乳腺癌等[2]。迄今，該屬植物研究較多的主要是美味獼猴桃和中華獼猴桃，研究部位集中于果實(shí)和根部。

本課題組對(duì)山梨獼猴桃根進(jìn)行了化學(xué)成分研究，分離得到7個(gè)五環(huán)三萜類(lèi)化合物和2個(gè)烏蘇烷型三萜皂苷，分別鑒定為：2α，3β，19α，23，24五羥基烏蘇12烯28OβD吡喃葡萄糖苷（1）、2α，3α，19α，24四羥基烏蘇12烯28OβD吡喃葡萄糖苷（2）、2α，3α，24三羥基烏蘇12烯28酸（3）、2α，3α，24三羥基齊墩果12烯28酸（4）、2α，3α，23，24四羥基烏蘇12烯28酸（5）、2α，3β，23，24四羥基烏蘇12烯28酸（6）、2α，3β，23三羥基烏蘇12烯28酸（7）、2α，3β，23三羥基烏蘇12，20（30）二烯28酸（8）、2α，3α，24三羥基烏蘇12，20（30）二烯28酸（9），其中化合物1和2為首次從該屬植物中分離得到。細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果顯示化合物2～4 對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKVO3和人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株TPC1具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性[IC50在1099～1641 μmol·L-1]，而化合物3和4對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，IC50分別為1553，1307 μmol·L-1。

1材料

Bruker 300超導(dǎo)型核磁共振波譜儀（德國(guó)布魯克公司，TMS內(nèi)標(biāo)）；紅外光譜儀（賽默飛世爾公司Nicolet 6700型）；質(zhì)譜儀（Finnigan LCQ advatage MAX）；分析型高效液相（北京北方威瑪龍公司，檢測(cè)器UC329）；制備型高效液相（大連依利特，P230P型，檢測(cè)器DAD230+）；C18分析型色譜柱（46 mm×250 mm，5μm，月旭公司）；C18制備型色譜柱（

212 mm×250 mm，5 μm，月旭公司）；Sephadex LH20葡聚糖凝膠（美國(guó)GE公司）；薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠）；立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX50FB 型，上海申安醫(yī)療器械廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHQ9070A型，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；電熱恒溫水箱（DKB8A 型，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（MCO5AC 型，日本SANYO Electric COLtd）；倒置顯微鏡（CKX41 型，日本Olympus公司）；臺(tái)式低速冷凍離心機(jī)（L535R 型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；酶標(biāo)儀（Multiskan MK3型，上海賽默飛世爾儀器有限公司）；超凈臺(tái)（VFB1500型，上海毅昕實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；胎牛血清（FBS）（美國(guó) Gibco 公司）；青霉素鏈霉素溶液（碧云天生物研究所）；胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（上海立菲生物技術(shù)有限公司）；四氮噻唑藍(lán)（MTT）（美國(guó)Sigma公司）；7種人腫瘤細(xì)胞株：口腔表皮樣癌Kb、宮頸癌HeLa、胃癌SGC7901、鼻咽癌CNE2、肺癌A549、卵巢癌SKVO3、甲狀腺乳頭狀癌TPC1（由江陰康眾康民生物醫(yī)藥技術(shù)公司和廣西醫(yī)科大學(xué)提供）；山梨獼猴桃根于2002年6月在廣西植物研究所苗圃采集，由中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所李瑞高和梁木源研究員鑒定，標(biāo)本存于中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，標(biāo)本號(hào)為020617。

2提取與分離

山梨獼猴桃根用95%乙醇常溫提取3次，提取液減壓回收溶劑得到總浸膏，此項(xiàng)工作由廣西大學(xué)陳?；劢淌谔幚硗瓿伞Ｈ〗?920 g懸浮于水中，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓回收溶劑，得到石油醚部位772 g，乙酸乙酯部位1787 g，正丁醇部位512 g。正丁醇部位過(guò)ODS開(kāi)放柱，甲醇水洗脫（3∶7～1∶0），得到FrsC1～C7，F(xiàn)rsC1 （360 mg）和FrsC2 （230 mg）分別經(jīng)凝膠柱色譜（氯仿甲醇1∶1）分離得到相應(yīng)的化合物1（21 mg）和2（15 mg）；FrsC4 （230 mg）經(jīng)制備型高效液相純化（甲醇水60∶40），得到化合物5 （18 mg）和6 （13 mg）。乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱色譜（氯仿甲醇20∶1～5∶1）分離，得到FrsB1～B9，F(xiàn)rsB4 （313 mg）經(jīng)制備HPLC純化（甲醇水65∶35）得到化合物3 （28 mg）和4 （31 mg）；FrsB6 （580 mg）經(jīng)硅膠柱層析（氯仿甲醇15∶1）分離得到化合物7 （35 mg）；FrsB8 （340 mg）制備HPLC純化（甲醇水70∶30）得到化合物8 （15 mg）和9 （20 mg）。

3結(jié)構(gòu)鑒定

4細(xì)胞毒活性（MTT 法）

收集生長(zhǎng)良好的腫瘤細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配制成5×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液，于96孔培養(yǎng)板內(nèi)接種，每孔200 μL（含1×105個(gè)腫瘤細(xì)胞），置37 ℃，5% CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后棄原液，加入樣品溶液200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT 溶液（50 g·L-1，PBS 配制） 20 μL，37 ℃孵育4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 100 μL，振蕩10min，用酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度[10]。

采用MTT 法，測(cè)定了化合物1～9對(duì)7種人腫瘤細(xì)胞株：口腔表皮樣癌Kb、宮頸癌HeLa、胃癌SGC7901、鼻咽癌CNE2、肺癌A549、卵巢癌SKVO3、甲狀腺乳頭狀癌TPC1細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。

結(jié)果顯示化合物9對(duì)人口腔表皮樣癌細(xì)胞株Kb呈現(xiàn)一定的細(xì)胞毒活性，IC50為2879 μmol·L-1，而化合物1～3，5和7 對(duì)該細(xì)胞株呈現(xiàn)較弱的細(xì)胞毒活性，IC50在3158～4563 μmol·L-1；化合物3和4對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa呈現(xiàn)強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，IC50分別為1553，1307 μmol·L-1，而其余化合物對(duì)該細(xì)胞株呈現(xiàn)較弱的細(xì)胞毒活性，IC50在3359～4931 μmol·L-1；化合物5～9對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2呈現(xiàn)一定的細(xì)胞毒活性，IC50在2363～3946 μmol·L-1；化合物1～3，5和7對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC7901呈現(xiàn)較弱的細(xì)胞毒活性，IC50在3255～4791 μmol·L-1；化合物1，4～6和8對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549呈現(xiàn)中等強(qiáng)度的細(xì)胞毒活性，IC50在2263～2996 μmol·L-1，其余化合物對(duì)該細(xì)胞株呈現(xiàn)較弱的細(xì)胞毒活性，IC50在3266～

4285 μmol·L-1；化合物2～4對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKVO3呈現(xiàn)強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，IC50分別為1099，1641，1404 μmol·L-1，化合物1，7，9對(duì)該細(xì)胞呈現(xiàn)一定的細(xì)胞毒活性IC50在2123～3751 μmol·L-1；化合物2～4對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株TPC1呈現(xiàn)強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，IC50分別為1434，1238，1123 μmol·L-1，而化合物1和9對(duì)該細(xì)胞呈現(xiàn)較弱的細(xì)胞毒活性，IC50分別為3979，4570 μmol·L-1。

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[責(zé)任編輯丁廣治]