縊蟶天然抗性相關(guān)巨噬蛋白2(Sc-Nramp2)基因克隆及其在副溶血弧菌刺激下的表達(dá)分析

林德海，劉晨珊，董迎輝，何琳，林志華*

(1.浙江萬(wàn)里學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315100)

?

縊蟶天然抗性相關(guān)巨噬蛋白2(Sc-Nramp2)基因克隆及其在副溶血弧菌刺激下的表達(dá)分析

林德海1，劉晨珊1，董迎輝1，何琳1，林志華1*

(1.浙江萬(wàn)里學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315100)

克隆得到縊蟶天然抗性相關(guān)巨噬蛋白2(Sc-Nramp2)基因的cDNA全長(zhǎng)序列3 681 bp，該基因的開(kāi)放閱讀框有1 776 bp，編碼591個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為65.86 kDa；其結(jié)構(gòu)具有Slc11蛋白家族的典型特征，包括有10個(gè)典型的跨膜結(jié)構(gòu)和2個(gè)糖基化位點(diǎn)。Sc-Nramp2基因3′-UTR有2個(gè)類似于脊椎動(dòng)物Nramp2中鐵反應(yīng)控制蛋白結(jié)合位點(diǎn)；同源性分析表明，Sc-Nramp2和太平洋牡蠣Nramp2-like的同源性最高為71.6%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，Sc-Nramp2基因在閉殼肌、外套膜、肝胰腺、斧足、水管和鰓6個(gè)組織中均有表達(dá)，其中肝胰腺中的表達(dá)量最高，其次是鰓，與其他組織均有極顯著性差異(P<0.01)；注射副溶血弧菌后，肝胰腺中Sc-Nramp2基因的表達(dá)量較對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.01)，且表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在12 h時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量，推測(cè)Sc-Nramp2基因參與了縊蟶非特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。

縊蟶；Sc-Nramp2；基因克?。桓比苎【?；基因表達(dá)

1 引言

天然抗性相關(guān)巨噬蛋白(natural resistance associated macrophage protein， Nramp)也稱溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族11(solute carrier family 11，SLC11)，是一類古老的膜整合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，含有10～12個(gè)典型的跨膜區(qū)、1個(gè)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特征結(jié)構(gòu)域和1～2個(gè)糖基化的胞質(zhì)外環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在各物種間保持高度保守性[1]。該家族包括Nramp1和Nramp2[2]，Nramp1主要特異性表達(dá)于巨噬細(xì)胞和組織網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)[3]，Nramp2則廣泛表達(dá)于大多數(shù)組織和細(xì)胞[4]。Nramp蛋白對(duì)生物體內(nèi)細(xì)胞的病原體可以起到抵抗的作用，主要是通過(guò)陽(yáng)離子運(yùn)輸功能減少巨噬細(xì)胞內(nèi)金屬離子的濃度，抑制胞內(nèi)病菌對(duì)金屬離子的利用，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的抗菌活性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，人Nramp1基因多態(tài)性與多種自身免疫性疾病和由病毒、細(xì)菌、寄生蟲等引起的傳染性疾病相關(guān)[6]。小鼠Nramp1在抵抗牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)、沙門氏菌(Salmonella)的感染起著重要的調(diào)控作用[7—8]，單個(gè)密碼子突變(Gly169→Asp) 可導(dǎo)致基因功能的喪失[9]。迄今為止，已在人[10]、鼠[1]、豬[11]等哺乳動(dòng)物中克隆得到Nramp基因cDNA全長(zhǎng)。在魚類中，已得到了虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[12]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[13]、鱸魚(Lateolabraxjaponicus)[14]、真鯛(Pagrosomusmajor)[15]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[16]和斑馬魚(Daniorerio)[17]等Nramp基因全長(zhǎng)，并分析了基因的序列特征。然而，關(guān)于Nramp基因的研究主要集中在哺乳動(dòng)物和魚類，在貝類中僅見(jiàn)太平洋牡蠣(Crassostreagigas)Nramp2-like在NCBI上有序列信息。

縊蟶(Sinonovaculaconstricta)是我國(guó)重要海水養(yǎng)殖貝類之一，肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，在浙江、福建、廣東沿海一帶有著悠久的養(yǎng)殖歷史。近年來(lái)，由細(xì)菌性疾病造成的縊蟶病害時(shí)有發(fā)生，其中又以弧菌為主要致病菌[18]。貝類對(duì)病原的防御與脊椎動(dòng)物不同，體內(nèi)不存在特異性免疫淋巴細(xì)胞和相應(yīng)抗體，是通過(guò)巨噬細(xì)胞和多種非免疫球蛋白介導(dǎo)的非特異性免疫殺滅進(jìn)入體內(nèi)的病原[19]。目前在縊蟶中已有熱休克蛋白ScHsc70[20]、小分子熱休克蛋白Sc-sHSP[21]、肌動(dòng)蛋白β-ACTIN1[22]、鐵蛋白[23]和組織蛋白酶B[24]等免疫相關(guān)基因的報(bào)道。本研究對(duì)Sc-Nramp2基因的序列特征、組織表達(dá)和副溶血弧菌感染后的表達(dá)進(jìn)行分析，以期為深入研究其在縊蟶免疫過(guò)程中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用縊蟶材料于2015年10月取自寧波市海洋與漁業(yè)研究院科技創(chuàng)新基地。取健康的縊蟶成貝經(jīng)活體解剖，迅速取其閉殼肌、外套膜、肝胰腺、足、水管和鰓6個(gè)組織，用液氮速凍后分別放入凍存管中，并保存于-80℃冰箱中備用。

2.2 攻毒實(shí)驗(yàn)

取200顆縊蟶暫養(yǎng)于海水中，水溫(18±1)℃，鹽度為25，定時(shí)投喂扁藻、金藻，持續(xù)充氣，每日換水一次，暫養(yǎng)一周后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。

將實(shí)驗(yàn)室保存的副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)活化后，擴(kuò)大培養(yǎng)，用PBS將菌液濃度稀釋到OD600=0.4。將縊蟶隨機(jī)分組，每組100顆。在實(shí)驗(yàn)組每顆縊蟶斧足注射50 μL 副溶血弧菌菌液，對(duì)照組每顆注射50 μL PBS，注射后放回海水中。分別于注射后0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h取樣肝胰腺用液氮速凍，于-80℃冰箱中保存。

2.3Sc-Nramp2基因cDNA全長(zhǎng)的克隆

采用Trizol法提取縊蟶肝胰腺樣品RNA，用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)其完整性，NanoVue微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度。利用SMART RACE試劑盒(Clontech)以總RNA為模板合成cDNA。從縊蟶轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的注釋信息中，檢索到Sc-Nramp2基因的EST片段，以此分別設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE特異性引物N-1和N-2(表1)，用Advantage 2 Polymerase試劑盒(Clontech)根據(jù)試劑盒說(shuō)明書要求擴(kuò)增Sc-Nramp2的cDNA全長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收試劑盒(TIANGEN)割膠純化。純化后的產(chǎn)物與T1 (TransGen)載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α (TaKaRa)中進(jìn)行克隆，挑取出陽(yáng)性克隆送往Invitrogen公司測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的引物及序列

2.4Sc-Nramp2基因的序列及進(jìn)化分析

用DNAMAN 7軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果序列進(jìn)行拼接，得到Sc-Nramp2基因的cDNA全長(zhǎng)序列并搜索開(kāi)放閱讀框，推測(cè)出其編碼的氨基酸序列；用NCBI blast(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)搜索同源序列和功能域；用序列處理在線工具包(http: //www.bio-soft.net/sms/index.html)預(yù)測(cè)翻譯蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；用NetNGlyc 1.0 Server(http: //www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)；用ExPASy ProtScale(http: //web.Expasy.org/protscale/)軟件分析蛋白質(zhì)疏水性；用SignalP 4.1 Serve(http: //www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽；用DAS(http: //www.sbc.su.se/～miklos/DAS/)軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)；用Swiss Model(http: //swissmodel. Expasy. org/workspace/)軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.5Sc-Nramp2基因在不同組織中的差異表達(dá)分析

利用Trizol(Invitrogen)法提取6個(gè)組織(閉殼肌、外套膜、肝胰腺、斧足、水管和鰓，n=3)的RNA，按照Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，用作熒光定量PCR的模板。根據(jù)已獲得的Sc-Nramp2基因cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)Real-N-F和Real-N-R(表1)用為熒光定量引物，以18S rRNA(表1)基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為20 μL，包含：SYBR Green Mix(Bio-rad)10 mL，cDNA模板0.8 mL，上下游特異性引物(10 mmol/L)各1 mL，以DEPC-H2O補(bǔ)足。用ABI 7500 fast熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，具體反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性20 s；95℃變性3 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s，制成熔解曲線。每個(gè)組織樣品設(shè)3個(gè)平行，基因的相對(duì)mRNA水平采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS16.0進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

3 結(jié)果

3.1Sc-Nramp2基因cDNA全長(zhǎng)序列分析

經(jīng)RACE克隆得到Sc-Nramp2基因cDNA序列全長(zhǎng)3 681 bp(GenBank登錄號(hào)：KX197930.1)，開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame， ORF)有1 776 bp，編碼591個(gè)氨基酸，5′末端非翻譯區(qū)(Untranslated Regions， 5′-UTR)長(zhǎng)91 bp，3′-UTR為1 817 bp，包含一個(gè)終止密碼子TAG、加尾信號(hào)和32 bp的polyA尾巴。另外，在3′-UTR發(fā)現(xiàn)了2個(gè)鐵反應(yīng)控制蛋白結(jié)合位點(diǎn)(Iron-responsive regulatory-protein-binding site， IRE) (CNNNNNCAGTG)的特征序列(圖1)。

3.2Sc-Nramp2基因的功能域、結(jié)構(gòu)域與高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

Sc-Nramp2基因共編碼591個(gè)氨基酸，推導(dǎo)出蛋白質(zhì)分子量為65.86 kDa，理論等電點(diǎn)pI=4.93。ExPASy Protscale 軟件預(yù)測(cè)顯示，該蛋白質(zhì)在氨基酸組成上，非極性氨基酸所占比例較高，表現(xiàn)為疏水性；SignalP軟件預(yù)測(cè)該蛋白沒(méi)有明顯的信號(hào)肽；DAS軟件預(yù)測(cè)該蛋白有10個(gè)明顯的跨膜區(qū)域。NCBI Blastx 預(yù)測(cè)該蛋白的功能域結(jié)果顯示，Sc-Nramp2基因有1個(gè)較為保守的結(jié)構(gòu)域，利用NetNGlyc 1.0 Server軟件分析得到2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別在4-7aa，557-560aa。Swiss model軟件預(yù)測(cè)得到的Sc-Nramp2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含291個(gè)氫鍵、19個(gè)α-螺旋和28個(gè)轉(zhuǎn)角(圖2)。

3.3Sc-Nramp2基因氨基酸序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用MAGE6.0軟件將Sc-Nramp2的氨基酸序列同其他物種Nramp1和Nramp2的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)及用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)。氨基酸序列比對(duì)表明，Sc-Nramp2與太平洋牡蠣Nramp2-like(Crassostreagigas， NP_001292237.1)、章魚Nramp2-like(Octopusbimaculoides， XP 014772339.1)、光棘球海膽Nramp1(Strongylocentrotuspurpuratus， XP 003728002.1)等軟體動(dòng)物的同源性為57%～71.6%，與魚類的同源性在53.4%～54.5%之間，與鳥類的同源性為52.2%～53.5%，與兩棲類的同源性為53.9%～54.9%，與哺乳類Nramp1的同源性(52.7%～53.2%)要低于哺乳類Nramp2的同源性(55.6%～56.1%)。從進(jìn)化樹(shù)中可以看出，魚類聚為一支，再與哺乳類Nramp2聚為一大支，而高等脊椎動(dòng)物中鳥類、兩棲類與哺乳類Nramp1聚為一大支，推測(cè)其具有類似的功能。

3.4Sc-Nramp2基因在6個(gè)組織中的表達(dá)差異分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Sc-Nramp2基因在6個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，在6個(gè)組織中均有表達(dá)，其中肝胰腺的表達(dá)量最高，其次是鰓，與其他組織有顯著性差異(圖4)。

3.5Sc-Nramp2基因在副溶血弧菌刺激后的表達(dá)特征分析

縊蟶在被副溶血弧菌侵染刺激后，不同時(shí)間取其肝胰腺組織，檢測(cè)在刺激后的Sc-Nramp2基因的表達(dá)情況。如圖5所示，實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量在刺激后4 h有明顯上升并持續(xù)上升到12 h，在12 h時(shí)的表達(dá)量達(dá)到最大值，約為對(duì)照組的12.7倍，與對(duì)照組和空白組均呈顯著性差異(P<0.01)。表達(dá)量在12 h后開(kāi)始下降，48 h和72 h后的表達(dá)量變化不大。

圖1 Sc-Nramp2基因全長(zhǎng)cDNA序列及其氨基酸序列推測(cè)Fig.1 The nucleotide and deduced amino acid sequence of the Sc-Nramp2 gene加框部分分別代表起始密碼子、終止密碼子和加尾信號(hào)，*代表蛋白翻譯結(jié)束，單下劃線代表跨膜區(qū)，分別標(biāo)注為TM1～10，陰影加粗的是2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，位于 3′-UTR 的2個(gè) IRE 位點(diǎn)用陰影和下劃線標(biāo)出，polyA尾巴用雙下劃線標(biāo)出The letters boxes are the start codon, the stop codon and the polyadenylation signal sequence, the * represents the end of the protein translation, the transmembrane regions (TM) are underlined with single lines and numbered 1-10, the N-glycosylation sites are marked with shaded and bold, the IRE sites located in 3′UTR are underlined and shaded, and the double underlined part is polyA

圖2 Sc-Nramp2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.2 The prediction of Sc-Nramp2 protein secondary structure紅色為α-螺旋，藍(lán)色為轉(zhuǎn)角The red represents the alpha-helix, blue represents the turn

圖3 用MAGE6.0軟件NJ法構(gòu)建的縊蟶與其他物種Nramp1和Nramp2系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Neighbor-joing phylogenetic tree of Nramp between S.constrzcta and other species using MEGA6.0 software

4 討論

本研究克隆得到的Sc-Nramp2基因的全長(zhǎng)cDNA，與已報(bào)道的其他動(dòng)物Nramp氨基酸序列比對(duì)分析，Sc-Nramp2與其他動(dòng)物的Nramp2 較為相似，包含10個(gè)明顯的跨膜區(qū)域，1個(gè)較為保守的結(jié)構(gòu)域和2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，這些特征與小鼠[4]、人[25]、草魚[13]和虹鱒[9]等大致相似。另外，在Sc-Nramp2的3′-UTR發(fā)現(xiàn)了2個(gè)IRE位點(diǎn)。有研究表明，5′UTR 和 3′UTR端 IRE 位點(diǎn)與細(xì)胞中鐵的代謝密切相關(guān)[26]，在哺乳動(dòng)物Nramp2的相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收與IRE位點(diǎn)緊密相關(guān)[27-28]。Saeij等[29]推測(cè)，在鯉Nramp中的IRE可能通過(guò)與鐵調(diào)控蛋白結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)Nramp的mRNA水平，當(dāng)鐵調(diào)控蛋白與Nramp5′-UTR端的IRE位點(diǎn)結(jié)合時(shí)可以阻止RNA的翻譯，當(dāng)與3′-UTR端的IRE位點(diǎn)結(jié)合時(shí)可以保護(hù)RNA免受降解。至于貝類Nramp基因的IRE位點(diǎn)是否與其在哺乳動(dòng)物Nramp2中起著相同的作用還需進(jìn)一步研究。

圖4 Sc-Nramp2基因在6個(gè)組織中的表達(dá)特征分析Fig.4 The distribution of Sc-Nramp2 expression in six tissues of S.constrzcta不同字母代表極顯著差異(P<0.01)Different letters indicates an extremely significant difference (P< 0.01)

圖5 副溶血弧菌感染后，Sc-Nramp2在肝胰腺中的表達(dá)量變化Fig.5 Expression characteristic analysis of Sc-Nramp2 in hepatopancreas by V. Parahaemolyticus**表示該時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)量與0 h相比差異極顯著(P<0.01)，##表示相同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與PBS對(duì)照組基因表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)The “**” indicates an extremely significant difference (P<0.01) from the blank group; the “##” indicates that the experimental group is extremely different from the control group (P< 0.01)

Nramp1基因在哺乳動(dòng)物中呈現(xiàn)特異性表達(dá)，如人的肝臟、腎臟和胰臟[30]，牛的網(wǎng)狀內(nèi)皮中的巨噬細(xì)胞[31]，而Nramp2基因則在哺乳動(dòng)物各組織中廣泛表達(dá)。本研究在縊蟶閉殼肌、外套膜、肝胰腺、斧足、水管和鰓6個(gè)組織中均檢測(cè)到Nramp2基因的表達(dá)但表達(dá)量不同，其中，在肝胰腺中的表達(dá)量最高，鰓組織表達(dá)量?jī)H次于肝胰腺，而在水管、外套膜，在足和閉殼肌中的表達(dá)量最低。Sc-Nramp2基因的這種組織表達(dá)形式與哺乳類Nramp2較為相似。此外，在草魚[13]和鱸魚[11]中發(fā)現(xiàn)Nramp基因在脾臟和腎臟中的表達(dá)量最高，而縊蟶中肝胰腺的Nramp2基因表達(dá)量最高，這與肝胰臟是大多數(shù)動(dòng)物的重要解毒器官有關(guān)。關(guān)于縊蟶免疫相關(guān)基因與病菌感染之間的關(guān)系已有一些研究，金凱等[32]研究發(fā)現(xiàn)縊蟶絲氨酸蛋白酶基因ScSp在被鰻弧菌(Vibrioanguillarum) 誘導(dǎo)感染后4 h和8 h，在肝胰腺中的表達(dá)量顯著上調(diào)；馮冰冰[20]研究發(fā)現(xiàn)縊蟶在被副溶血弧菌和鰻弧菌感染后，縊蟶熱休克蛋白70(ScHsc70)、小熱休克蛋白(Sc-sHSP)和鐵蛋白基因(ScFERs)在肝胰腺組織的表達(dá)量都顯著高于其他組織且呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，這與肝胰腺是大多數(shù)動(dòng)物的一個(gè)具有解毒功效的重要組織有關(guān)。本研究中的縊蟶6個(gè)組織表達(dá)情況也表明了Sc-Nramp2具有組織特異性表達(dá)模式，與上述研究有相似之處，表明肝胰腺是縊蟶合成免疫相關(guān)蛋白的重要組織。

對(duì)縊蟶進(jìn)行副溶血弧菌感染實(shí)驗(yàn)后研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組縊蟶肝胰腺Sc-Nramp2表達(dá)量相較于PBS對(duì)照組有明顯的上調(diào)，在12 h達(dá)到最大值，是PBS對(duì)照組的12.7倍左右，隨著時(shí)間的推移Nramp2表達(dá)量逐漸下降接近正常值，這與半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[33]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[34]、草魚[13]的研究結(jié)果相似。由此推測(cè)，起始由于副溶血弧菌的感染誘導(dǎo)了縊蟶細(xì)胞內(nèi)免疫相關(guān)基因的表達(dá)量上升，隨后由于細(xì)胞病變效應(yīng)且細(xì)胞生長(zhǎng)受到了限制等，致使基因表達(dá)量下降，在小鼠中也報(bào)道過(guò)類似的現(xiàn)象[35]。這些結(jié)果表明，Sc-Nramp2基因參與了縊蟶的先天性免疫應(yīng)答，與被感染后機(jī)體的免疫反應(yīng)密切相關(guān)?？O蟶等貝類屬于低等動(dòng)物，在遭受外界病菌感染時(shí)，依靠先天免疫合成蛋白，而肝胰腺則是縊蟶重要的免疫器官，在對(duì)抗病菌入侵時(shí)發(fā)揮防御作用。至于Sc-Nramp2與副溶血弧菌感染之間的相互作用機(jī)理，及其在免疫系統(tǒng)中扮演的具體角色，還需開(kāi)展大量深入研究。

5 結(jié)論

本研究首次克隆得到縊蟶Sc-Nramp2基因全長(zhǎng)cDNA序列，同源性分析表明和太平洋牡蠣Nramp2-like基因的相似度最高。Sc-Nramp2基因在縊蟶6個(gè)組織中都有表達(dá)，且在肝胰腺中的表達(dá)量最高；經(jīng)副溶血弧菌侵染后，Sc-Nramp2基因在肝胰腺中表達(dá)量上升，表明該基因在肝胰腺中參與了縊蟶的天然免疫過(guò)程。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究縊蟶Sc-Nramp2基因的功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

[1] Skamene E， Pietrangeli C E. Genetics of the immune response to infectious pathogens[J]. Current Opinion in Immunology， 1991， 3(4): 511-517.

[2] Blackwell J M， Goswami T， Evans C A W， et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance[J]. Cellular Microbiology， 2001， 3(12): 773-784.

[3] Feng J， Li Y， Hashad M， et al. Bovine natural resistance associated macrophage protein 1 (Nramp1) gene[J]. Genome Research， 1996， 6(10): 956-964.

[4] Gruenheid S， Cellier M， Vidal S， et al. Identification and characterization of a second mouseNrampgene[J]. Genomics， 1995， 25(2): 514-525.

[5] Bairoch A. The PROSITE dictionary of sites and patterns in proteins， its current status[J]. Nucleic Acids Research， 1993， 21(13): 3097-3103.

[6] Bellamy R.NRAMP1 and susceptibility to tuberculosis[J]. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease， 2002， 6(9): 747.

[7] Gros P， Skamene E， Forget A. Genetic control of natural resistance to Mycobacterium bovis (BCG) in mice[J]. The Journal of Immunology， 1981， 127(6): 2417-2421.

[8] Goto Y， Nakamura R M， Takahashi H， et al. Genetic control of resistance toMycobacteriumintracellulareinfection in mice[J]. Infection and Immunity， 1984， 46(1): 135-140.

[9] Govoni G， Vidal S， Gauthier S， et al. TheBcg/Ity/Lshlocus: genetic transfer of resistance to infections in C57BL/6J mice transgenic for theNramp1Gly169allele[J]. Infection and Immunity， 1996， 64(8): 2923-2929.

[10] Cellier M， Govoni G， Vidal S， et al. Human natural resistance-associated macrophage protein: cDNA cloning， chromosomal mapping， genomic organization， and tissue-specific expression[J]. Journal of Experimental Medicine， 1994， 180(5): 1741-1752.

[11] Sun H S， Wang L， Rothschild M F， et al. Mapping of the natural resistance-associated macrophage protein 1 (NRAMP1) gene to pig chromosome 15[J]. Animal Genetics， 1998， 29(2): 138-140.

[12] Dorschner M O， Phillips R B. Comparative analysis of two Nramp loci from rainbow trout[J]. DNA and Cell Biology， 1999， 18(7): 573-583.

[13] Chen Songlin， Zhang Yuxi， Xu Jianyong， et al. Molecular cloning， characterization and expression analysis of natural resistance associated macrophage protein (Nramp) cDNA from turbot (Scophthalmusmaximus)[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology， 2007， 147(1): 29-37.

[14] 劉洋. 外源基因表達(dá)載體的構(gòu)建以及向斑馬魚(Daniarerio)和鱸魚(Lateolabraxjaponicus)胚胎的轉(zhuǎn)移[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué)， 2004.

Liu Yang. Exogenous genes construction， transfer in to embryos of Zebrafish (DaniaRerio) and Sea Perch (LateolabraxJaponicus)[D]. Qingdao: Ocean University of China， 2004.

[15] Chen Songlin， Xu Meiyu， Ji Xiangshan， et al. Cloning and characterisation of natural resistance associated macrophage protein (Nramp) cDNA from red sea bream (Pagrusmajor)[J]. Fish & Shellfish Immunology， 2004， 17(4): 305-313.

[16] 范玉頂， 徐進(jìn)， 羅曉松， 等. 草魚天然抗性相關(guān)巨噬蛋白基因全長(zhǎng)cDNA的克隆與表達(dá)分析[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)， 2011， 18(1): 38-47.

Fan Yuding， Xu Jin， Luo Xiaosong， et al. Molecular cloning， characterization and expression of natural resistance associated macrophage protein (Nramp) gene cDNA from grass carp (Ctenopharyngodonidella)[J]. Journal of Fishery Sciences of China， 2011， 18(1): 38-47.

[17] Donovan A， Brownlie A， Dorschner M O， et al. The zebrafish mutant genechardonnay(cdy) encodes divalent metal transporter 1 (DMT1)[J]. Blood， 2002， 100(13): 4655-4659.

[18] 邱晴， 謝李珍， 傅興隆， 等. 縊蟶副溶血弧菌的分離與鑒定[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2010， 16(12): 46-47， 89.

Qiu Qing， Xie Lizhen， Fu Xinglong， et al. Isolation and identification ofVibrioParahaemolyticusfromSinonovaculaconstricta[J]. Anhui Agricultural Science Bulletin， 2010， 16(12): 46-47， 89.

[19] Anderson R S. Effects of anthropogenic agents on bivalve cellular and humoral defense mechanism[J]. Special Publication. American Fisheries Society， 1988， 18: 238-242.

[20] 馮冰冰， 牛東紅， 鐘玉民， 等. 縊蟶ScHsc70cDNA的分子特性和表達(dá)分析[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)， 2012， 19(1): 33-44.

Feng Bingbing， Niu Donghong， Zhong Yumin， et al. Molecular characteristics and expression analysis of ScHsc70 cDNA in agamaki clam (Sinonovaculaconstricta)[J]. Journal of Fishery Sciences of China， 2012， 19(1): 33-44.

[21] 馮冰冰. 縊蟶肝胰臟cDNA文庫(kù)構(gòu)建和免疫相關(guān)基因的克隆與表達(dá)研究[D]. 上海: 上海海洋大學(xué)， 2011.

Feng Bingbing. cDNA library construction of hepatopancreas and immune-relevant genes cloning and expression analysis inSinonovaculaconstricta[D]. Shanghai: Shanghai Ocean University， 2011.

[22] 馮冰冰， 鐘玉民， 牛東紅， 等. 縊蟶β-ACTIN1基因的分子特性及其表達(dá)分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)， 2011， 35(5): 650-659.

Feng Bingbing， Zhong Yumin， Niu Donghong， et al. Molecular characteristics and expression analysis ofβ-ACTIN1 gene fromSinonovaculaconstricta[D]. Journal of Fisheries of China， 2011， 35(5): 650-659.

[23] 牛東紅， 馮冰冰， 李家樂(lè). 縊蟶鐵蛋白基因的分子特性及其表達(dá)分析[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 21(5): 641-649.

Niu Donghong， Feng Bingbing， Li Jiale. Molecular characteristics and expression analysis of ferritin gene fromSinonovaculaconstricta[J]. Journal of Shanghai Ocean University， 2012， 21(5): 641-649.

[24] Niu Donghong， Jin Kai， Wang Lei， et al. Identification of cathepsin B in the razor clamSinonovaculaconstrictaand its role in innate immune responses[J]. Developmental & Comparative Immunology， 2013， 41(1): 94-99.

[25] Kishi F， Tabuchi M. Complete nucleotide sequence of humanNRAMP2 cDNA[J]. Molecular Immunology， 1997， 34(12/13): 839-842.

[26] Klausner R D， Rouault T A， Harford J B. Regulating the fate of mRNA: the control of cellular iron metabolism[J]. Cell， 1993， 72(1): 19-28.

[27] Gunshin H， Mackenzie B， Berger U V， et al. Cloning and characterization of a mammalian proton-coupled metal-ion transporter[J]. Nature， 1997， 388(6641): 482-488.

[28] Forbes J R， Gros P. Divalent-metal transport by NRAMP proteins at the interface of host-pathogen interactions[J]. Trends in Microbiology， 2001， 9(8): 397-403.

[29] Saeij J P J， Wiegertjes G F， Stet R J M. Identification and characterization of a fish natural resistance-associated macrophage protein (NRAMP) cDNA[J]. Immunogenetics， 1999， 50(1/2): 60-66.

[30] Cellier M， Shustik C， Dalton W， et al. Expression of the human NRAMP1 gene in professional primary phagocytes: studies in blood cells and in HL-60 promyelocytic leukemia[J]. Journal of Leukocyte Biology， 1997， 61(1): 96-105.

[31] Barthel R， Feng Jianwei， Piedrahita J A， et al. Stable transfection of the bovineNRAMP1 gene into murine RAW264.7 cells: effect onBrucellaabortussurvival[J]. Infection and Immunity， 2001， 69(5): 3110-3119.

[32] 金凱， 牛東紅， 王劦， 等. 縊蟶絲氨酸蛋白酶基因的序列特征及其表達(dá)分析[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 22(4): 481-487.

Jin Kai， Niu Donghong， Wang Lie， et al. Molecular characteristics and expression analysis of serine protease fromSinonovaculaconstricta[J]. Journal of Shanghai Ocean University， 2013， 22(4): 481-487.

[33] 邢賀飛. 半滑舌鰨抗病相關(guān)SNP標(biāo)記的篩選及兩種免疫相關(guān)基因的克隆與初步分析[D]. 上海: 上海海洋大學(xué)， 2015.

Xing Hefei. Screening and identification of disease-resistant related single nucleotide polymorphism markers， and cloning and preliminary analysis of two immune-related genes in half smooth tongue sole (Cynoglossussemilaevis)[D]. Shanghai: Shanghai Ocean University， 2015.

[34] 李同明. 尼羅羅非魚Nramp基因的克隆分析與表達(dá)研究[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013.

Li Tongming. Molecular cloning and expression analysis ofNrampgene in Nile tilapia (Oreochromisniloticus)[D]. Tai′an: Shandong Agricultural University， 2013.

[35] Atkinson P G P， Blackwell J M， Barton C H. Nramp1 locus encodes a 65 kDa interferon-γ-inducible protein in murine macrophages[J]. Biochemical Journal， 1997， 325(3): 779-786.

Cloning of natural resistance associated macrophage protein2 (Sc-Nramp2)gene fromsinonovaculaconstrictaand the expression analysis undervibrioparahaemolyticusstimulation

Lin Dehai1， Liu Chenshan1， Dong Yinghui1， He Lin1， Lin Zhihua1

(1.KeyLaboratoryofAquaticGermplasmResourceofZhejiang，ZhejiangWanliUniversity，Ningbo315100，China)

The cDNA sequence of natural resistance associated macrophage protein inSinonovaculaconstricta(Sc-Nramp2) was cloned by SMART RACE techniques. The ORF of cDNA sequence， coding for a protein of amino acids， was 1 773 bp and the molecular weight was deduced for 65.86 kDa.Sc-Nramp2 protein has the typical structural features with Solute carrier family 11 member， with 10 typical transmembrane domains and 2 glycosylation site. In 3′-UTR，Sc-Nramp2 was the presence of two IRE which was similar to the vertebrate Nramp2. Homology analysis indicated that the identity of Nramp withCrassostreagigaswas 71.6%. Real-time quantitative RT-PCR analysis indicated that the mRNA was expressed in all the six tissues， including adductor muscle， mantle， hepatopancreas， foot， waterpipe and gill. Nramp was expressed with the highest expression level in the hepatopancreas， then the gill， which had extremely significant differences from other tissues(P<0.01). The expression of Nramp in the hepatopancreas injected withV.Parahaemolyticusincreased significantly(P<0.01). It rose to maximum expression at the 12thhour and returned to the initial level. These results indicated thatSc-Nramp2 is involved in innate immunity of this species．

Sinonovaculaconstricta;Sc-Nramp2;gene cloning;VibrioParahaemolyticus;gene expression

10.3969/j.issn.0253-4193.2017.08.007

2016-11-23；

2017-04-13。

國(guó)家現(xiàn)代貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-48)；浙江省重大科技專項(xiàng)(2016C12907-7)；國(guó)家水產(chǎn)種質(zhì)資源平臺(tái)項(xiàng)目(2015DKA30470)；寧波市科技富民項(xiàng)目(2015C1000)；浙江省重中之重學(xué)科學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(CX2015011)；浙江省教育廳一般項(xiàng)目(Y201329410)。

林德海(1990—)，男，浙江省蒼南縣人，從事海洋貝類種質(zhì)資源與遺傳育種研究。E-mail：772351303@qq.com

*通信作者：林志華，博士，研究員。E-mail：zhihua9988@126.com

Q786

A

0253-4193(2017)08-0070-08

林德海，劉晨珊，董迎輝，等. 縊蟶天然抗性相關(guān)巨噬蛋白2(Sc-Nramp2)基因克隆及其在副溶血弧菌刺激下的表達(dá)分析[J].海洋學(xué)報(bào)，2017，39(8)：70—77，

Lin Dehai， Liu Chenshan， Dong Yinghui，et al. Cloning of natural resistance associated macrophage protein 2 (Sc-Nramp2)gene from sinonovacula constricta and the expression analysis under vibrio parahaemolyticus stimulation[J]. Haiyang Xuebao，2017，39(8)：70—77， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2017.08.007