氨基胍對乳酸鹽腹膜透析液致人腹膜間皮細胞損傷及血管內皮生長因子表達的影響

傅碧玲，馮朝瑜，朱賽香，鄒世海，彭鑫

(深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院腎臟內科，廣東深圳518101)

氨基胍對乳酸鹽腹膜透析液致人腹膜間皮細胞損傷及血管內皮生長因子表達的影響

傅碧玲，馮朝瑜，朱賽香，鄒世海，彭鑫

(深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院腎臟內科，廣東深圳518101)

目的研究氨基胍(AG)對乳酸鹽腹膜透析液(L-PDS)致人腹膜間皮細胞(HMrSV5)損傷及血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響。方法采用人腹膜間皮細胞株HMrSV5為體外實驗模型，分為無血清DMEM培養(yǎng)液對照組、L-PDS組(2.5%L-PDS)、L-PDS+AG組(2.5%L-PDS+10 mmol/LAG)、單純AG組(終濃度10 mmol/L)。各組以上不同干預因素與HMrSV5細胞共孵育。MTT法檢測各組細胞增殖、評估細胞活力，Western blot和逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測VEGF蛋白及mRNA的表達。結果MTT試驗表明，L-PDS組OD值為(0.120±0.019)，明顯低于對照組的(0.298±0.031)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；L-PDS+AG組OD值為(0.289±0.022)，明顯高于L-PDS組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Western blot和RT-PCR結果均表明，與對照組比較，L-PDS組細胞中VEGF蛋白和mRNA表達明顯增加，與L-PDS組比較，PDS+AG組VEGF蛋白和mRNA的表達明顯減低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論AG可拮抗乳酸鹽腹膜透析液致人腹膜間皮細胞損傷并下調VEGF的表達。

氨基胍；乳酸鹽腹膜透析液；人腹膜間皮細胞；血管內皮生長因子

持續(xù)不臥床腹膜透析(CAPD)是目前最重要的腎臟替代治療手段之一，其中超濾衰竭是患者退出腹膜透析的重要原因。國內外專家均積極探索在使用現(xiàn)有生物不相容性的腹膜透析液條件下防治腹膜透析失超濾的策略。目前國內普遍使用的是低pH值、高糖、高滲、含葡萄糖降解產物(GDPs)的以乳酸鹽為緩沖堿的腹膜透析液(PDS)，乳酸鹽作為緩沖堿的缺點之一是降低腹膜間皮細胞的代謝及存活率，減低腹腔白細胞功能，使腹腔抵抗微生物入侵能力減弱[1]。同時，此類透析液能夠促進血管內皮生長因子(VEGF)的表達，進而促進腹膜血管新生，后者與PD超濾衰竭密切相關[2]。氨基胍(AG)作為糖基化終產物受體(RAGEs)的抑制劑，可以抑制糖基化終產物(AGEs)的形成。已有試驗證實，在建立的大鼠腹膜透析模型中，PD液中加入AG有助于抑制血管增生[3]。但AG能否抑制腹膜透析液誘導的腹膜間皮細胞損傷及影響細胞因子VEGF的表達，國內外尚未見報道。故本研究以體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細胞株(HMrSV5)為研究對象，觀察AG對L-PDS致HMrSV5損傷及VEGF表達的影響。為腹膜超濾衰竭的防治提供新的理論依據和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基分別購自杭州四季青公司、美國Invitrogen公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)，氨基胍(aminoguanidine，AG)，兔抗GAPDH抗體、小鼠抗人VEGF單抗均購自Sigma公司(美國)；RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 人腹膜間皮細胞(HMrSV5)的培養(yǎng)使用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HMrSV5(中科院上海細胞庫)，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2。換液間隔時間為2～3 d，實驗達標要求：細胞生長融合度達80%左右。實驗時傳代細胞，細胞貼壁后，用培養(yǎng)液(含1%小牛血清)進行同步培養(yǎng)24 h，大部分細胞處于靜止狀態(tài)。

1.2.2 細胞分組實驗分為以下各組：(1)對照組：無血清DMEM培養(yǎng)液；(2)L-PDS組：含2.5% L-PDS(美國Baxter公司提供)；(3)L-PDS+AG組：含2.5%L-PDS及10 mmol/L AG；(4)單純AG組(終濃度10 mmol/L)。

1.2.3 MTT法檢測HMrSV5的增殖胰酶消化細胞后制成細胞懸液，將細胞密度調整為1×105個/mL，接種到96孔培養(yǎng)板內，接種要求為每孔100 μL細胞懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，然后再用培養(yǎng)液(含1%小牛血清)同步24 h，使大部分細胞處于靜止狀態(tài)。棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩遍，每組設3個重復孔，各組加入相應的處理因素100 μL，分別與HMrSV5作用45～60 min。棄去培養(yǎng)液(處理因素)，PBS洗兩遍，加入5%小牛血清培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)20 h后，每個培養(yǎng)孔均加入MTT(100 μL)，使其終濃度保持在0.5 mg/mL，調零組則不加，振蕩然后繼續(xù)孵育4 h。將培養(yǎng)液棄去，每孔加入100 μL DMSO，搖勻大概10 min左右，當結晶被完全溶解后，在Bio-Rad550酶標儀上測定各組的平均吸光度值(OD值)，將波長設定為570 nm。實驗重復3次。

1.2.4 免疫印跡(Western-blot)技術檢測VEGF蛋白質的表達將細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，以105/孔的密度，細胞長至80%融合時，將細胞培養(yǎng)基更換為培養(yǎng)液(1%小牛血清DMEM)，同步24 h后，各組加入相應的處理因素2.5 mL，與HMrSV5共孵育60 min。然后將各組細胞予以收集、裂解，取其上清液，對蛋白濃度進行測定，取30 μg細胞總蛋白進行配置，要求為配成等體積等量，放置于沸水中予以煮5 min，電泳分離(10%SDS-聚丙烯酰胺)，將蛋白通過電轉移至硝酸纖維素膜上，使用5%無脂奶粉進行封閉，一抗孵育雜交過夜，為小鼠抗人VEGF單抗，洗膜后在抗鼠IgG中孵育1 h，其中抗鼠IgG是由過氧化物酶標記的；最后結果用化學發(fā)光法以X線片自顯影進行顯示。圖像經圖像分析軟件Quantity One(BioRad公司)對特異性條帶進行灰度掃描分析，求得各組蛋白電泳條帶灰度與內參GAPDH的比值，反映為VEGF表達含量變化，從而半定量比較目的蛋白。實驗重復3次。

1.2.5 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測VEGF mRNA的表達同樣在6孔細胞培養(yǎng)板中將細胞以105/孔進行接種，再細胞長至80%融合時，對細胞培養(yǎng)基進行更換分組培養(yǎng)。各組加入相應的處理因素2.5 mL，分別與HMrSV5作用60 min后，將各組細胞予以收集，對細胞總RNA進行提取，擴增產物以RT-PCR法得到，PCR產物進行電泳及分析：凝膠在UVP凝膠成像系統(tǒng)中掃描以對結果進行觀察、拍照，對電泳帶灰度進行分析，計算VEGF mRNA相對表達量也就是VEGF mRNA特異性擴增帶灰度/內參GAPDH擴增帶灰度。實驗重復3次。

2 結果

2.1 AG對L-PDS誘導的HMrSV5細胞增殖的影響L-PDS組OD值明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；L-PDS+AG組OD值明顯高于L-PDS組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1AG對L-PDS誘導的HMrSV5細胞增殖的影響

表1AG對L-PDS誘導的HMrSV5細胞增殖的影響

注：與對照組比較，aP＜0.01；與L-PDS組比較，bP＜0.01。

組別OD值對照組L-PDS組L-PDS+AG組單純AG組F值P值0.298±0.031 0.120±0.019a0.289±0.022b0.302±0.028 289.200＜0.01

2.2 AG對L-PDS誘導的HMrSV5細胞VEGF蛋白表達的影響與對照組比較，L-PDS組細胞中VEGF蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.62，P＜0.05)；而單純AG組沒有顯著影響細胞內VEGF的表達(t=0.75，P＞0.05)。與L-PDS組比較，L-PDS+AG組VEGF蛋白的表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t= 5.17，P＜0.05)，見圖1。

2.3 AG對L-PDS誘導的HMrSV5細胞VEGF mRNA表達的影響與對照組比較，L-PDS組細胞中VEGF mRNA表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(t= 4.91，P＜0.05)；而單純AG組，沒有影響細胞內VEGF mRNA的表達(t=0.71，P＞0.05)。與L-PDS組比較，L-PDS+AG組VEGF mRNA的表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.09，P＜0.05)，見圖2。

圖1 四組細胞VEGF蛋白表達的情況

圖2 四組細胞VEGF mRNA表達的情況

3 討論

在我國，血液透析(HD)和腹膜透析(PD)是終末期腎臟病(ESRD)患者腎臟替代治療的兩種主要方式。隨著國家政策的扶持，PD技術的推廣，PD患者生存期的延長，腹膜透析液(PDS)的非生物相容性問題日益凸顯。血液透析有多種透析器可供選擇，且為一次性使用，不再復用。而腹膜透析利用的是生物膜，無可替代或轉換，腹膜持續(xù)或重復地暴露于非生物相容性的透析液，更易于損傷。

目前普遍使用的仍然是以乳酸鹽為載體的高糖、高滲、低pH、含葡萄糖降解產物(GDPs)的透析液。pH中性、低GDPS的新型PDF雖具有更好的生物相容性、可減輕炎癥反應、保護腹膜功能、有更好的超濾能力和代謝效益，但對減少腹膜炎的發(fā)生、提高遠期技術存活效率和生存率方面待更大樣本的RCT證實[4]，且較昂貴，我國尚未能推廣使用。故在現(xiàn)有乳酸鹽腹膜透析液的條件下，仍需要積極探索防治腹膜透析超濾衰竭的方法，減少PD患者的退出。腹膜透析超濾衰竭與腹膜血管新生、間皮細胞損傷以及腹膜的纖維化等因素密切相關。

乳酸鹽腹膜透析液可使腹膜間皮細胞活力下降、損傷，細胞因子(VEGF)表達上調，進而導致腹膜間皮細胞損傷、腹膜血管新生。VEGF通過活化間皮細胞的RAGEs刺激血管的形成[5]，并可通過與一氧化氮合酶(NOS)同工酶的反應使毛細血管通透性增加[6]。RAGEs的阻斷劑，可以干預上述進程。在大鼠腹膜透析模型的體內試驗中證實，AG(RAGEs的阻斷劑)有助于抑制血管增生[3]。

本研究使用MTT法觀察不同干預因素對HMrSV5細胞增殖的影響。L-PDS對于體外培養(yǎng)的HMrSV5增殖具有明顯抑制作用。與對照組比較，L-PDS組OD值明顯減小(P＜0.05)。與L-PDS組比較，L-PDS+AG組OD值明顯增大，說明AG對L-PDS誘導的HMrSV5損傷具有一定保護作用。因此，本研究為運用AG對抗乳酸鹽PDF對腹膜間皮細胞損傷提供了實驗依據。

Western blot和RT-PCR結果分別從蛋白及mRNA水平證實，與對照組比較，L-PDS組細胞中VEGF蛋白和mRNA表達明顯增加(P＜0.05)；與L-PDS組比較，L-PDS+AG組VEGF蛋白和mRNA的表達明顯減低(P＜0.05)，說明AG可拮抗乳酸鹽腹膜透析液誘導的HMrSV5細胞VEGF的表達。VEGF是促進血管新生的主要因素和始動因子。VEGF在腹膜間皮細胞表達不斷增強，進而促進形成新生血管，增加了腹膜對小分子溶質的轉運，加快了透析液葡萄糖的吸收，減弱了跨膜滲透壓梯度，最終使超濾減少甚至引起超濾能力喪失。動物模型中，與使用傳統(tǒng)乳酸鹽PDF組比較，使用中性的、低GDP含量(neutral pH，low-GDP，NpHLGDP)的PDS組，其流出液的VEGF水平、VEGF染色、血管新生等明顯降低[7]。腹膜間皮細胞可能受到前炎癥因子和AGEs影響，而非葡萄糖本身的刺激從而產生(合成)VEGF[8]。AG具有抑制NOS活性和AGEs形成的作用，可以顯著降解GDPs以及明顯抑制L-PDS所致的AGEs堆積。本研究在體外試驗證實，AG可拮抗乳酸鹽腹膜透析液誘導的HMrSV5細胞VEGF過表達。為運用AG對抗L-PDS對腹膜間皮VEGF表達上調提供了實驗依據。

綜上所述，AG可拮抗乳酸鹽腹膜透析液致人腹膜間皮細胞損傷并下調VEGF的表達，可能與其阻斷了RAGE受體通路有關。

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Effect of aminoguanidine on damage in human peritoneal mesothelial HMrSV5 cells caused by lactate peritoneal dialysis solution andexpression of VEGF.

FU Bi-ling,FENG Zhao-yu,ZHU Sai-xiang,ZOU Shi-hai,PENG Xin. Department of Nephrology,Shenzhen Baoan District People's Hospital,Shenzhen 518101,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of aminoguanidine(AG)on damage in human peritoneal mesothelial cells(HMrSV5)caused by lactate peritoneal dialysis solution(L-PDS)and expression of vascular endothelial growth factor(VEGF).MethodsDepending on the culture of the cell,the cultured HMrSV5 cells were divided to control group(cultured in DMEM),L-PDS group(2.5%L-PDS),L-PDS+AG group(2.5%L-PDS+10 mmol/LAG),and AG group(at a final concentration of 10 mmol/L).MTT assay was used to assess the viability and proliferation of the cells. VEGF protein was determined by western blot,and VEGF mRNA was determined by RT-PCR.ResultsThe optical density(OD)value in L-PDS group was(0.120±0.019),significantly lower than(0.298±0.031)in the control group(P＜0.05).The OD value in L-PDS+AG group was(0.289±0.022),which was significantly higher than that in L-PDS group (P＜0.05).Expression of VEGF protein and mRNA increased significantly in L-PDS group as compared with those in control group(P＜0.05),while the expression decreased significantly in PDS+AG group as compared with those in L-PDS group(P＜0.05).ConclusionAG can antagonize the injury of HMrSV5 caused by L-PDS and down-regulate the expression of VEGF.

Aminoguanidine(AG);Lactate peritoneal dialysis solution(L-PDS);Human peritoneal mesothelial cells(HMrSV5);Vascular endothelial growth factor(VEGF)

R459.5

A

1003—6350（2017）14—2251—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.14.005

2017-04-05)

廣東省深圳市寶安區(qū)科技計劃社會公益項目(編號：2013027)

傅碧玲。E-mail：13226686502@139.com