嚴重生精障礙男性精子DNA碎片指數(shù)及Hcy水平的研究分析

何海洪??郭偉權(quán)??柯娟玉??蘭希??吳潤安??周義文

[摘要] 目的 探討同型半胱酸、精子DNA碎片指數(shù)與嚴重生精障礙男性的精子計數(shù)之間的相關性研究。 方法 2015年12月～2017年2月期間在醫(yī)院就診的嚴重生精障礙男性患者56例，按WHO標準分為嚴重無、少精子癥組25例和弱精子癥組31例，對照組為無生育障礙的男性27例。對所有納入研究者進行精子參數(shù)、精子DNA碎片指數(shù)和血清Hcy水平的檢測。結(jié)果 嚴重生精障礙男性的精子DNA碎片指數(shù)和Hcy均高于正常對照組。精子DNA碎片指數(shù)與血清Hcy水平、精子濃度呈正相關，而Hcy水平和精子濃度呈負相關。結(jié)論 Hcy水平和精子DNA碎片指數(shù)的升高，可能是嚴重生精障礙男性的重要病因，但其具體機制有待進一步研究。

[關鍵詞] 男性；精子DNA碎片指數(shù)；同型半胱氨酸；精子

[中圖分類號] R698.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）11-14-04

Research and analysis of sperm DNA fragmentation index and Hcy level of males with severe spermatogenesis dysfunction

HE Haihong GUO Weiquan KE Juanyu LAN Xi WU Run'an ZHOU Yiwen

Clinical Laboratory Center， Shenzhen Hospital of Southern Medical University， Shenzhen 518110， China

[Abstract] Objective To explore research on correlation between homocysteine， sperm DNA fragmentation index and sperm count of males with severe spermatogenesis dysfunction. Methods 56 male patients with severe spermatogenesis dysfunction who were treated in our hospital from December 2015 to February 2017 were selected. According to WHO standard， they were divided into the severe azoospermia and oligospermia group with 25 cases and the asthenospermia group with 31 cases. In the control group， there were 27 males without fertility barrier. Sperm parameters， sperm DNA fragmentation index and serum Hcy level of all included research objects were detected. Results Sperm DNA fragmentation index and Hcy level of males with severe spermatogenesis dysfunction were both significantly higher than those of the normal control group. Sperm DNA fragmentation index was positively correlated with serum Hcy level and sperm concentration while Hcy level was negatively correlated with sperm concentration. Conclusion Improvements of Hcy level and sperm DNA fragmentation index may be the main causes for males with severe spermatogenesis dysfunction but concrete mechanism needs to be further studied.

[Key words] Males； Sperm DNA fragmentation index； Homocysteine； Sperm

在發(fā)達國家大約有8%～10%的夫婦患有不育癥，而發(fā)展中國家的數(shù)據(jù)更高，有研究報道國內(nèi)不育率達到18%[1]，在這些不育夫婦中大約有30%～55%是由于男方因素造成的[2]。在男性生殖領域，精子發(fā)生是一個復雜的過程，受感染、性激素失衡、吸煙、飲酒、染色體異常、Y染色體微缺失、易位、囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子基因突變和其他的遺傳因素等多種因素的影響[3]。近年來，國外一些研究發(fā)現(xiàn)，嚴重生精子障礙男性的同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）濃度明顯高于正常男性，同時證實精液中的Hcy水平升高可以損害精子的質(zhì)量并引起出生缺陷[4-5]。而國內(nèi)卻鮮見Hcy和嚴重生精障礙男性的相關性研究。有研究表明，精子DNA碎片和不明原因的不育男性密切相關[6]，也有研究[7]表明，精子DNA碎片指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI）和精子常規(guī)各參數(shù)之間沒有相關性，有學者卻得出相反的結(jié)果[8]，因此精子DNA碎片指數(shù)和與精液密度、精子活力、存活率、畸形率等參數(shù)的相關性存在爭議。

本次研究旨在研究嚴重生精障礙男性的精子DFI和血清Hcy水平，以及精子DFI、Hcy水平與精液參數(shù)之間的關聯(lián)性的研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年12月～2017年2月期間，按WHO男性不育推薦標準[9]，收集南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院遺傳生殖、泌尿外科門診的精液標本，納入研究者共56例，被分為兩組：嚴重無、少精子癥組（SOM組）[<5×106 個/mL，n=25，年齡（30.0±7.1）歲]和弱精子癥組（OAT組）[5～20×106 個/mL，n=31，年齡（31.0±7.7）歲]。正常對照組（NM組）為無生育障礙的男性共27例，年齡為（29.0±6.1）歲，已知的遺傳因素包括嚴重生精障礙原因的個體（染色體異常、Y染色體AZF微缺失等），不良的生活方式因素（酗酒、吸煙、職業(yè)等），以及臨床因素（精索靜脈曲張、隱睪等）排除在本次研究外。納入研究的對象均知情同意。

1.2 試劑與儀器

美國哈密爾頓-索尼 HAMILTON THORNE IVOSⅡ型電子計算機全自動精液分析儀（CSA）及原裝進口的耗材，羅氏Cobas 8000 全自動生化流水線，HCY檢測用羅氏原裝試劑盒，采用珠海BASO Diff-Quik法精子形態(tài)學快速染色試劑盒、深圳博銳德生物科技有限公司生產(chǎn)的精子DNA碎片檢測試劑盒。

1.3 血清Hcy水平檢測

BD真空促凝采血管采集血液，自然凝固，3500 r/min，分離血清，羅氏Cobas 8000自動生化流水線檢測。按照試劑盒說明書，Hcy參考區(qū)間為4.5～13.6?mol/L，批內(nèi)和批間不精密度變異系數(shù)不超過4%。

1.4 精液參數(shù)和DFI分析

采集精液前，要求患者禁欲2～7d，運用美國哈密爾頓HAMILTON THORNE IVOSⅡ型電子計算機全自動精液分析儀（CSA）檢測精子濃度，精子總活力，精子存活率等項目，運用WHO推薦的Kruger標準[10]，運用Diff-Quik法檢測精子畸形率，運用精子染色質(zhì)擴散法（sperm chromatin dispersion，SCD）檢測精子DFI，正常參考范圍為小于25%。

1.5 統(tǒng)計學分析

各組間精子參數(shù)、HCY水平和精子DFI指數(shù)數(shù)據(jù)分析采用Mann-Whitney和Kruskall Wallis的非參數(shù)檢驗，采用box-whisker箱式圖進行中位數(shù)比較，采用Passing-Bablok線性回歸分析進行相關性分析，對不符合Passing-Bablok線性回歸分析的采用散點線性趨勢分析圖，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，所有數(shù)據(jù)分析均采用Medcalc統(tǒng)計分析（12.0版本）。

2 結(jié)果

2.1 各組間精子參數(shù)、精子DFI和Hcy水平比較

比較嚴重無、少精子癥組（SOM組）和弱精子癥組（OAT組）之間的存活率（t=0.532，P=0.5971）、精子DFI（t=-0.590，P=0.5579）和Hcy水平（t= -0.968，P=0.3357），差異無統(tǒng)計學意義（表1）。由于精子存活率、DFI和Hcy水平在SOM組和OAT之間沒有差異，所以本研究令兩個組別數(shù)據(jù)合并與正常對照組比較分析，運用box-whisker箱式圖進行中位數(shù)比較（圖1），精子存活率和DFI對照人群明顯高于精子異常人群，而Hcy水平則相反。

2.2 精子DNA碎片指數(shù)、Hcy水平和精子濃度相關性分析

分析精子DFI與精子濃度以及精子Hcy和精子DFI的的相關性，采用Passing-Bablok回歸分析，回歸方程分別為：Y=21.071+0.286X，Y=10.705+0.053X，說明精子DFI與精子濃度、血清Hcy水平均呈正相關，而Hcy水平和精子濃度研究采用散點線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)Hcy水平越高，精子濃度則越低（圖2）。

3 討論

同型半胱氨酸是體內(nèi)含硫氨基酸之一，是甲硫氨酸循環(huán)和半胱氨酸代謝的重要中間產(chǎn)物，其本身不參加蛋白質(zhì)的合成，尤其在葉酸代謝過程環(huán)節(jié)發(fā)生問題時，會引起Hcy堆積，從而導致高同型半胱氨酸血癥，進而對機體產(chǎn)生一系列有害影響，甚至會影響男性的生殖系統(tǒng)[11]。葉酸參與DNA的合成，精子DFI是反應精子DNA受損的最直接指標，研究表明，精子DNA損傷會對自然生育，輔助生殖技術治療結(jié)局產(chǎn)生負影響，并與復發(fā)性流產(chǎn)有關，甚至有可能導致胎兒畸形率升高[12-13]。精子DFI、Hcy水平在不明原因的嚴重生精障礙患者中的比例是否存在密切關系，以及它們之間是否存在相關性，缺乏相關數(shù)據(jù)。

本次研究表明，精子存活率、精子DFI和Hcy水平在嚴重無、少精子癥組（SOM組）和弱精子癥組（OAT組）之間比較，統(tǒng)計學無差異。遂合并SOM組和OAT組與正常對照組進行箱式圖比較分析，精子畸形率和精子DFI兩個項目的結(jié)果在對照人群中明顯高于精子異常人群，而Hcy水平則相反，說明精子DFI、Hcy和精子濃度存在一定關系。進而對精子DFI和精子濃度進行Passing-Bablok回歸分析，發(fā)現(xiàn)精子DFI和精子濃度呈正相關，說明精子的DNA損傷越大和精子的數(shù)量越低，與孫超等[8]研究結(jié)果一致。而血清Hcy水平和精子濃度存在負相關，表明精子濃度越低，Hcy水平越高，戈一峰等[14]的研究一致。由于Hcy和精子DFI和精子濃度都存在一定的相關性，為了進一步明確Hcy和精子DFI是否存在相關性，繼續(xù)對Hcy和精子DFI進行相關行研究，發(fā)現(xiàn)隨著Hcy的緩慢升高，精子DFI出現(xiàn)了較為明顯的升高，說明精子DFI的改變對Hcy較為敏感。分析其中的原因，可能由于高Hcy使抗氧化物酶的活性受到抑制，同時生成過多的ROS，這使精子細胞，以及細胞內(nèi)蛋白質(zhì)甲基化反應，造成精子發(fā)生的減少[15]。而氧化應激是精子DNA損傷發(fā)生的其中機制之一，ROS的產(chǎn)生超過了抗氧化物的清除能力，使精子DNA受到ROS的攻擊，導致精子DNA的嚴重損傷[16]。但是要明確精子DNA損傷和精子發(fā)生減少，是否和Hcy升高導致的ROS升高的機制有關，還需要更加確鑿的證據(jù)。

嚴重生精障礙男性的精子DFI和Hcy水平均和正常對照組存在差異，因此，精子DFI和Hcy水平升高是不明原因嚴重生精障礙男性患者的重要病因，這兩個項目的可作為這類患者的重點監(jiān)測指標，但是它們升高的機理還有待進一步的研究。

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（收稿日期：2017-03-31）