異煙肼對人肝細(xì)胞CYP1A1啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響

牛琛，張一楊，李金鳳，李瑩淑，李玉紅，田慎謙，王悅，馮福民(華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北唐山063000)

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·論著·

異煙肼對人肝細(xì)胞CYP1A1啟動(dòng)子區(qū)甲基化的影響

牛琛，張一楊，李金鳳，李瑩淑，李玉紅，田慎謙，王悅，馮福民
(華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北唐山063000)

目的 觀察異煙肼對人肝細(xì)胞細(xì)胞色素P4501A1(CYP1A1)啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化的影響，探討異煙肼致肝細(xì)胞損傷的機(jī)制。方法 將肝細(xì)胞分為觀察組和對照組，觀察組分別加入200、400、800 μg/mL異煙肼，對照組加入同體積含DMSO的培養(yǎng)液。采用乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH水平來觀察細(xì)胞損傷情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞CYP1A1、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)、DNMT3a、DNMT3b mRNA的相對表達(dá)量，酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白水平，采用亞硫酸鹽修飾后測序法檢測CYP1A1啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。結(jié)果 觀察組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH水平均高于對照組，800 μg/mL異煙肼組最高(P均<0.05)。與對照組比較，觀察組隨異煙肼濃度升高，CYP1A1 mRNA表達(dá)呈先升高后降低趨勢，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA和蛋白表達(dá)均隨異煙肼濃度升高而升高，800 μg/mL異煙肼組高于其他組(P均<0.05)。細(xì)胞CYP1A1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為82.9%，高于對照組的79.6%(P<0.05)。結(jié)論 異煙肼可導(dǎo)致肝細(xì)胞CYP1A1基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，進(jìn)而引起肝細(xì)胞損傷。

異煙肼；藥物性肝損傷；細(xì)胞色素P4501A1;DNA甲基化；乳酸脫氫酶；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；人肝細(xì)胞

異煙肼(INH)是WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核一線藥物，臨床廣泛用于治療結(jié)核病。但長期用藥和不規(guī)范用藥均可引起肝臟損傷[1]。體內(nèi)Ⅰ相、Ⅱ相反應(yīng)參與了異煙肼的代謝過程，細(xì)胞色素P450(CYP450)是參與Ⅰ相反應(yīng)的主要酶系[2]，在代謝過程中發(fā)揮重要作用[3]。CYP1A1是CYP450家族成員，CYP1A1基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能在抗結(jié)核藥物性肝損傷的過程中發(fā)揮作用[8]。甲基化是表觀遺傳學(xué)的一部分，指由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的作用下，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的過程[4]?；騿?dòng)子區(qū)的甲基化能夠調(diào)控目的基因的表達(dá)[5]，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，甲基化作用與肝纖維化[6]、急慢性乙型肝炎[7]、肝癌[8]、脂肪肝[9]等疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶(LDH)會(huì)進(jìn)入細(xì)胞外，因此檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH可反映細(xì)胞損傷[10]。DNMT是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，通過檢測細(xì)胞中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b表達(dá)可反映細(xì)胞的甲基化狀態(tài)。2016年10～11月，我們使用異煙肼處理人肝細(xì)胞，觀察細(xì)胞的損傷情況和細(xì)胞CYP1A1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，探討異煙肼致肝損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝細(xì)胞HL-7702購自上海中科院。異煙肼、二甲基亞砜(DMSO)購自日本TCI公司，RPMI1640、胎牛血清、青霉素與鏈霉素分別購自CORNING、CLARK、BI公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自TaKaRa公司，乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自南京建成，Heraeus高速離心機(jī)，C1000 PCR擴(kuò)增儀，熒光定量RCR儀。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 人肝細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素、90% RPMI1640培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長滿后用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化懸浮，加入培養(yǎng)液制成1×105/mL的細(xì)胞懸液，接種到6孔板中。將細(xì)胞分為兩組，預(yù)培養(yǎng)24 h后，異煙肼組分別加入200、400、800 μg/mL異煙肼，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，對照組加入同體積含DMSO的培養(yǎng)液。培養(yǎng)6 h后收獲細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平檢測 取20 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用LDH檢測試劑盒測定LDH活性。

1.4 細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。采用TRIzol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 1 min。CYP1A1上游引物5′-CTCTTTGGAGCTGGGTTTGAC-3′，下游引物5′-GCTGTGGGGGATGGTGAA-3′；DNMT1上游引物5′-ACCTGGCTAAAGTCAAATCC-3′，下游引物5′-ATTCACTTCCCGGTTGTAAG-3′；DNMT3a上游引物5′-CAGCTTCCACGTTGCCTTCT-3′，下游引物5′-CATCTGCAAGCTGTCTCCCTTT-3′；DNMT3b上游引物5′-TTGGAATAGGGGACCTCGTGTG-3′，下游引物5′-AGAGACCTCGGAGAACTTGCCATC-3′；GAPDH上游引物5′-TCTCCCCTCCTCACAGTTGC-3′，下游引物5′-AAGCCGAGACGACGACAGAC-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，目的基因的相對表達(dá)量采用目的基因校正相對表達(dá)量2-ΔΔCt公式進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法。取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取蛋白，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水溫育60 min。棄去液體，洗板。加入底物，37 ℃避光孵育15 min，加入終止液終止反應(yīng)。于450 nm波長處測定各孔OD值。在Excel工作表中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

1.6 CYP1A1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化檢測 采用亞硫酸鹽修飾后測序(BSP)法。使用DNA提取試劑盒提取細(xì)胞DNA，委托上海生工生物工程公司使用甲基化測序分析軟件(QUMA)進(jìn)行甲基化測序。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平比較 200、400、800 μg/mL異煙肼組和對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平分別為(288.10±35.20)、(366.14±63.05)、(515.25±86.21)、(236.84±14.51)U/L。隨異煙肼濃度升高，LDH逐漸升高，800 μg/mL異煙肼組LDH水平高于其他各組(P均<0.01)。

2.2 兩組細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)比較 見表1。與對照組比較，400、800 μg/mL異煙肼組DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)均升高(P均﹤0.05)，其中800 μg/mL異煙肼組DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)高于其他各組(P均﹤0.01)。

表1 兩組細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)比較

注：與對照組比較，#P<0.05，*P<0.01。

2.3 兩組細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白水平比較 見表2。與對照組比較，400、800 μg/mL異煙肼組DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)均升高(P均﹤0.05)，其中800 μg/mL異煙肼組DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)高于其他各組(P均﹤0.01)。

表2 各組細(xì)胞DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達(dá)比較

注：與對照組比較，#P<0.05，*P<0.01。

2.4 兩組細(xì)胞CYP1A1 mRNA表達(dá)比較 200、400、800 μg/mL異煙肼組細(xì)胞CYP1A1 mRNA相對表達(dá)量分別為1.15±0.51、0.78±0.12、0.52±0.19。與對照組的1.00±0.00相比，200 μg/mL異煙肼組CYP1A1表達(dá)升高(P<0.05)；400、800 μg/mL異煙肼組降低(P均<0.01)，800 μg/mL異煙肼組最低。

2.5 兩組細(xì)胞CYP1A1啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平比較 為了明確CYP1A1 mRNA表達(dá)是否受啟動(dòng)子區(qū)的甲基化調(diào)控，本研究選取細(xì)胞損傷最嚴(yán)重、DNMT升高最明顯、CYP1A1 mRNA降低最明顯的800 μg/mL異煙肼組和對照組進(jìn)行甲基化測序。結(jié)果顯示，對照組CYP1A1啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為79.6%，異煙肼組CYP1A1啟動(dòng)子區(qū)甲基化率為82.9%，異煙肼組高于對照組(P<0.05)。

2.6 LDH與CYP1A1、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，LDH與CYP1A1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.814，P<0.01)，與DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r分別為0.661、0.815、0.475，P均<0.05)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，異煙肼可被CYP450家族代謝為有毒產(chǎn)物，導(dǎo)致肝臟損傷[11]。本研究顯示，向肝細(xì)胞中加入不同濃度異煙肼后，細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH水平均高于對照組，800 μg/mL異煙肼組最高，細(xì)胞損傷最嚴(yán)重。

胃癌、肺癌中DNMT呈高表達(dá)[12]。DNMT1不但能參與甲基化狀態(tài)的維持和非CpG位點(diǎn)從頭甲基化，還與甲基化的延伸有關(guān)；DNMT3a、DNMT3b主要參與到啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾的過程中[13]。這三種DNMT的變化從側(cè)面反映了甲基化過程中的變化[14]。本研究顯示，隨著異煙肼作用濃度的升高，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA和蛋白表達(dá)也隨之升高，提示DNMT活性升高可能會(huì)使甲基化的作用加強(qiáng)。相關(guān)性分析顯示，LDH與DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，提示細(xì)胞損傷越嚴(yán)重，DNMT在細(xì)胞內(nèi)參與甲基化的作用越強(qiáng)。

CYP1A1是CYP450家族成員之一。CYP1A1與肺癌相關(guān)性的報(bào)道較多，但異煙肼引起肝損傷的報(bào)道較少，尤其是CYP1A1啟動(dòng)子區(qū)甲基化與異煙肼致肝損傷的關(guān)系。CYP1A1作為CYP450酶系家族成員，在Ⅰ相反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，也是肝癌、子宮平滑肌瘤和食管癌的危險(xiǎn)因素[15～17]。有研究[18]表明，將CYP1A1野生型小鼠和基因缺陷型小鼠暴露于高氧環(huán)境中，經(jīng)過一段時(shí)間飼養(yǎng)后取肺組織檢測其損傷和炎性因子變化;結(jié)果顯示,CYP1A1缺陷型小鼠與野生型小鼠相比肺部組織和血管水腫加重并且炎性因子升高，說明CYP1A1基因缺陷型小鼠肺部更容易受到高氧誘導(dǎo)的損傷，提示CYP1A1缺失可能增加氧化應(yīng)激的敏感性。本研究結(jié)果顯示，人肝細(xì)胞中CYP1A1 mRNA表達(dá)隨異煙肼濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，說明高劑量異煙肼能夠降低CYP1A1表達(dá)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，LDH與CYP1A1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明細(xì)胞損傷越嚴(yán)重CYP1A1 mRNA降低越明顯。另一方面，隨著DNMT表達(dá)升高，提示細(xì)胞中甲基化作用加強(qiáng)，而CYP1A1表達(dá)的降低又暗示可能受甲基化作用的調(diào)控。我們根據(jù)LDH、CYP1A1、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b結(jié)果，選擇變化最明顯的800 μg/mL異煙肼組進(jìn)行CYP1A1啟動(dòng)子區(qū)甲基化測序。結(jié)果顯示，異煙肼組甲基化率為82.9%，高于對照組。說明異煙肼通過提高DNMT表達(dá)，增加CYP1A1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化。

綜上所述，異煙肼對人肝細(xì)胞具有損傷作用，高濃度異煙肼的損傷作用更強(qiáng)；隨著細(xì)胞損傷加重，DNMT表達(dá)隨之升高，提示異煙肼可改變細(xì)胞內(nèi)的甲基化狀態(tài)；經(jīng)過測序檢測發(fā)現(xiàn)異煙肼組CYP1A1啟動(dòng)子區(qū)甲基化升高，與之對應(yīng)的CYP1A1 mRNA表達(dá)降低，提示CYP1A1啟動(dòng)子區(qū)甲基化的升高降低了mRNA表達(dá)。因此認(rèn)為，CYP1A1基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與異煙肼致肝細(xì)胞損傷有關(guān)。

[1] Schaberg T, Rebhan K, Lode H. Risk factors for side-effects of isoniazid, rifampin and pyrazinomide in patients hospitalized for pulmonary tuberculosis[J]. Eur Respir J, 1996,75(9):2026-2030.

[2] Lewis DF, Ito Y. Human cytochromes P450 in the metabolism of drugs: new molecularmodels of enzyme-substrate interactions[J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2008,4(9):1181-1186.

[3] Tang SW, Lv XZ, Chen R, et al. Lack of association between genetic polymorphisms of CYP3A4, CYP2C9 and CYP2C19 and anti-tuberculosis drug-induced liver injury in a community-based Chinese population[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2013,40(5):326-332.

[4] Hernando-Herraez I, Garcia-Perez R, Sharp AJ, et al. DNA Methylation: Insights into Human Evolution[J]. Plos Genet, 2015,11(12):e1005661.

[5] 史玉杰,李慶賀,劉曉輝.DNA甲基化與基因表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志,2013,33(7):90-96.

[6] Asada K, Aihara Y, Takaya H, et al. DNA methylation of angiotensin II receptor gene in nonalcoholic steatohepatitis-related liver fibrosis[J]. World J Hepatol, 2016,8(28):1194-1199.

[7] Gao S, Sun FK, Fan YC, et al. Aberrant GSTP1 promoter methylation predicts short-term prognosis in acute-on-chronic hepatitis B liver failure[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2015,42(3):319-329.

[8] Raggi C, Invernizzi P. Methylation and liver cancer[J]. Clin Res Hepatol Gastroenterol, 2013,37(6):564-571.

[9] Baumeier C, Saussenthaler S, Kammel A, et al. Hepatic DPP4 DNA methylation associates with fatty liver[J]. Diabetes, 2017,66(1):25-35.

[10] Kumar SG, Narayana K, Bairy KL,et al. Dacarbazine induces genotoxic and cytotoxic germ cell damage with concomitant decrease in testosterone and increase in lactate dehydrogenase concentration in the testis[J]. Mutat Res, 2006,607(2):240-252.

[11] Wang P, Pradhan K, Zhong XB, et al. Isoniazid metabolism and hepatotoxicity[J]. Acta Pharm Sin B, 2016,6(5):384-392.

[12] Dhe-Paganon S, Syeda F, Park L. DNA methyltransferase 1: regulatury mechanisms and implications in health and disease[J]. Int J Biochem Mol Biol, 2011,2(1):58-66.

[13] 王志剛,吳建新.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶分類、功能及研究進(jìn)展[J].遺傳,2009,31(9):903-912.

[14] 蘇玉,王溪,朱衛(wèi)國.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)調(diào)控及主要生物學(xué)功能[J].遺傳,2009,31(11):1087-1093.

[15] Yu BW, Zhang LQ, Teng XL, et al. Association between the CYP1A1 polymorphisms and hepatocellular carcinoma: a meta-analysis[J]. Genet Mol Res, 2015,14(1):1076-1084.

[16] Wang F, Chen J, Wang L, et al. CYP1A1 genetic polymorphisms and uterine leiomyoma risk:a meta-analysis[J]. Int J Clin Exp Med, 2015,8(3):3590-3594.

[17] Shen FF, Zhou FY, Xue QS, et al. Association between CYP1A1 polymorphisms and esophageal cancer:a meta-analysis[J]. Mol Biol Rep, 2013,40(10):6035-6042.

[18] Lingappan K, Jiang W, Wang L, et al. Mice deficient in the gene for cytochrome P450 (CYP)1A1 are more susceptible than wild-type to hyperoxic lung injury: Evidence for Protective Role of CYP1A1 Against Oxidative Stress[J]. Toxicol Sci, 2014,141(1):68-77.

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摘自《中國學(xué)術(shù)期刊(光盤版)檢索與評價(jià)數(shù)據(jù)規(guī)范》(修訂版CAJ-CD B/T 1-2006)

Effect of isoniazid on methylation of CYP1A1 promoter region of human hepatic cells

NIUChen,ZHANGYiyang,LIJinfeng,LIYingshu,LIYuhong,TIANShenqian,WANGYue,FENGFumin

(SchoolofPublicHealth,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To observe the effect of isoniazid on methylation of CpG island in cytochrome P4501A1 (CYP1A1) promoter region of human hepatocytes and to explore the mechanism of isoniazid-induced hepatocyte injury. Methods Liver cells were divided into the experimental group and control group. Cells in the experimental group were treated with 200, 400, and 800 μg/mL isoniazid, respectively. Cells in the control group were added with the same volume of DMSO culture medium. The LDH level in the supernatant was measured by lactate dehydrogenase (LDH) assay kit. The relative expression of CYP1A1, DNA methyltransferase 1 (DNMT1), DNMT3a, and DNMT3b mRNA was detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The protein levels of DNMT1, DNMT3a, and DNMT3b were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The methylation of CYP1A1 promoter was detected by bisulfite sequencing PCR. Results The level of LDH in the supernatant of the experimental group was higher than that in the control group, and the LDH level was the highest in the 800 μg/mL isoniazid group (allP<0.05). Compared with the control group, the expression of CYP1A1 mRNA in the experimental group first increased and then decreased with the increasing concentrations of isoniazid (allP<0.05). DNMT1, DNMT3a, and DNMT3b mRNA and protein expression increased with the increase of isoniazid concentration, and the 800 μg/mL isoniazid group was the highest (P<0.05). The methylation rate of CYP1A1 gene promoter region was 82.9%, which was higher than that of control group (79.6%) (P<0.05). Conclusion Isoniazid can cause human hepatocyte injury, and the mechanism may be related to CYP1A1 gene promoter hypermethylation.

isoniazid; drug-induced hepatic injury; cytochrome P4501A1; DNA methylation; lactate dehydrogenase; DNA methyltransferase; human hepatic cells

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81041096)。

牛琛(1992-)，男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)閭魅静〉姆乐巍-mail: 1737147219@qq.com

馮福民(1963-)，男，教授，博士生導(dǎo)師。主要研究方向?yàn)閭魅静〉姆乐巍-mail: fm_feng@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.001

R525

A

1002-266X(2017)26-0001-04

2017-02-18)

的標(biāo)識

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