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    基于ZnO納米棒液相自組裝固定血紅蛋白及其直接電化學傳感器

    2017-08-09 09:55:03段國萍郭小玉楊海峰
    化學傳感器 2017年1期
    關鍵詞:等電點緩沖溶液伏安

    張 琦,段國萍,郭小玉,楊海峰

    (資源化學教育部重點實驗室,上海師范大學化學系,上海200234)

    基于ZnO納米棒液相自組裝固定血紅蛋白及其直接電化學傳感器

    張 琦,段國萍,郭小玉*,楊海峰*

    (資源化學教育部重點實驗室,上海師范大學化學系,上海200234)

    自組裝方法制備納米生物傳感器時,常利用聚電解質(zhì)(如PDDA,poly(diallyl-dimethyl ammonium chloride))與納米材料和酶的相互作用。但是聚電解質(zhì)易導致納米材料團聚,或損害酶的活性,且操作過程較復雜,制備重現(xiàn)性不理想。該工作,利用納米ZnO與血紅蛋白(Hb)等電點差異,直接在納米材料分散液進行酶混合組裝,然后再通過自組裝,固定到玻碳電極表面,從而實現(xiàn)了Hb與電極間的直接電子傳遞。利用紫外吸收光譜(UV-vis)、透射電子顯微鏡(TEM)及循環(huán)伏安等方法對制備過程進行了表征。修飾電極測定H2O2溶液的線性范圍是1.06×10-6~7.82×10-3mol/L,檢測限是8.86×10-7mol/L(S/N=3)。相同實驗條件下,制備電極對相同濃度H2O2的響應電流的相對標準偏差(R.S.D)在1.9%左右,表明該方法制備的生物傳感器制備過程簡單、有好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

    納米ZnO;血紅蛋白;自組裝;直接電子傳遞

    0 引言

    H2O2是生物體內(nèi)許多氧化酶反應的副產(chǎn)物,因此制備生物傳感器[1-5]對其含量進行測定在生物、臨床、食品和環(huán)境分析中具有重要意義[6]。檢測H2O2有很多種方法,電化學法相對比較好。但是,H2O2的直接電化學檢測需要相對較高的超電位[7]。納米ZnO作為一種半導體材料,有很寬的能帶隙,它有較好的生物親和性,比表面積大,良好的生物相容性和高的電子傳遞特性[8]且等電點比較高,適合用來固定生物分子,尤其是低等電點的蛋白酶,比如血紅蛋白(Hb)。

    考慮到利用層層自組裝制備基于納米材料的生物傳感器的研究中[9],遇到的主要技術問題是使用的聚電解質(zhì)如PDDA(poly(diallyldimethyl ammonium chloride))易導致納米材料發(fā)生團聚,或可能損害酶的活性,在電極表面的固定過程比較復雜,傳感器的重現(xiàn)性不理想。該文開展一種基于生物活性分子與納米材料等電點不同,先液相組裝后再構(gòu)建修飾電極:即納米氧化鋅分散液和血紅蛋白混合組裝后,再組裝到玻碳電極(GCE)上。研究表明,這種簡單易行的制備方法很好的實現(xiàn)了Hb與電極間的直接電子傳遞,而且對H2O2響應迅速,傳感器的制備重現(xiàn)性大大提高。

    1 實驗部分

    1.1 化學試劑

    血紅蛋白(Hb,來自牛血清,上海生化試劑公司)、納米ZnO(自制)、H2O2(30%V/V水溶液)、Na2HPO4、KH2PO4、KCl、H3PO4、KCl、NaOH均為分析純試劑,HAuCl4、檸檬酸三鈉(國藥集團化學試劑有限公司),實驗所用水為超純水(>18MΩ·cm)。

    1.2 實驗儀器

    循環(huán)伏安(CV)測量在CHI650電化學工作站(上海辰華公司)上進行,并采用常規(guī)的三電極體系。其中,玻碳電極或經(jīng)過修飾的玻碳電極作為工作電極,鉑片電極作對電極,飽和甘汞電極(SCE)用作參比電極;紫外可見(UV-vis)光譜實驗采用UV-8500型紫外可見分光光度計 (上海天美科學儀器有限公司);PHS-3C精密pH計(上海雷磁儀器廠);SK2200H超聲儀 (上??茖С晝x器有限公司);透射電子顯微譜(TEM譜)由JEOL-JEM200CX型透射電鏡得到。

    1.3 納米ZnO分散液的制備

    納米ZnO是根據(jù)文獻[10]運用種子助長的化學反應法制備的。具體的實驗制備方法是:稱取1.335 g硝酸鋅溶解在100mL的超純水中,同時,稱取0.63 g二亞乙基三胺溶解在100mL的超純水中,攪拌30min后,將這兩種溶液混合并加熱,在500mL的烤箱中在95℃的條件下加熱3 h。最后將得到的產(chǎn)品冷卻、蒸餾水洗滌并晾干。這樣就制得了粒徑大約在10~20 nm左右的棒狀的納米ZnO。 取前面已制備好的納米ZnO 25 mg放入盛有25mL超純水的燒杯中,攪拌4 h使之充分溶解,然后過濾得1mg/mL的納米ZnO分散液。

    1.4 修飾電極的制備

    玻碳電極先用細的金相砂紙打磨干凈,然后用二次蒸餾水超聲,再依次用0.3,0.05μm Al2O3粉末進行拋光。拋光后電極依次用二次蒸餾水、乙醇、和二次蒸餾水進行超聲清洗。將上面制備好的1 mg/mL的納米ZnO分散液與1.34×10-4mol/L的血紅蛋白(Hb,pH7.0)溶液以體積比為1∶1的比例混合。然后將處理干凈的玻碳電極浸泡在混合溶液中放置于冰箱 (4℃)中進行自組裝20 h,制備ZnONRs-Hb/GCE修飾電極。作為對比,相同條件下,還制備了ZnONPs/GCE修飾電極和裸玻碳電極。

    1.5 測量方法

    取10 mL 0.067 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH7.0)于反應池中,連接三電極系統(tǒng),鉑電極為對電極,飽和的甘汞電極為參比電極,修飾電極為工作電極。CV實驗在靜止溶液中操作。計時電流(CA)實驗在攪拌溶液中操作,待基線電流穩(wěn)定后,加入一定量的H2O2,記錄響應電流值。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 TEM表征

    圖1是納米ZnO分散液和納米ZnO-Hb溶液的透射電鏡圖。從圖1(a)中可以發(fā)現(xiàn)所制備的納米ZnO是棒狀的,粒徑在10~20 nm左右,當ZnO分散液和Hb溶液以體積比1∶1混合后,Hb密集地包埋在棒狀的納米ZnO中,如圖1(b)。

    2.2 紫外可見吸收光譜

    圖1 納米ZnO(a)和納米ZnO-Hb(b)的透射電鏡圖Fig.1 TEM imagesof ZnONRs(a)and ZnONRs-Hb(b)

    圖2 不同溶液的紫外可見光譜圖Fig.2 UV-visabsorption spectra of ZnONRs(A)、Hb(B)and ZnONRs-Hb(C)

    圖3 (A)不同修飾電極的循環(huán)伏安圖;(B)ZnONRs-Hb/GCE修飾電極在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中連掃50圈Fig.3 (A)Cyclic voltammograms(CVs)ofbare GCE(a)ZnONRs/GCE(b)ZnONRs-Hb/GCE(c)in PBS(pH7.0).(B)Cyclic voltammograms(CVs)of ZnONRs-Hb/GCE in pH7.0 PBSsolutionwith 50 circles. Scan rateat200mV/s

    圖2是不同溶液的紫外可見光譜,棒狀的納米ZnO分散液在348 nm左右有最大吸收峰,如圖2(A)。從圖2(B)中,可以看到,血紅蛋白(Hb)溶液的Soret帶最大吸收峰出現(xiàn)在408 nm左右,另外,在Q帶、CT帶依次有500和640 nm兩個吸收峰,說明血紅蛋白保持著它原有的活性且二級結(jié)構(gòu)保持完好沒有破壞。當棒狀的納米ZnO分散液和Hb溶液混合后,最大吸收峰在408 nm左右,同時Q帶、CT帶依次有500,640 nm兩個很弱的峰,如圖2(C),這說明棒狀的納米ZnO分散液和Hb溶液混合后,相互作用結(jié)合在一起,同時血紅蛋白仍然保持著它原有的活性且二級結(jié)構(gòu)沒有被破壞。

    2.3 修飾電極的直接電化學行為

    圖3(A)是研究不同修飾電極在pH7.0的PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線。圖3(A)中(a)、(b)依次是裸玻碳電極、ZnONRs/GCE修飾電極的循環(huán)伏安曲線,都沒有氧化還原峰。而ZnONRs-Hb/GCE修飾電極,如圖3(A)中(c),可以很明顯的看到有一對形狀相似的氧化還原峰,這表明Hb實現(xiàn)了它與電極間的直接電子傳遞,反應如下:Hb(FeⅢ)+e=Hb(FeⅡ)。圖3(B)是ZnO NRs-Hb/GCE修飾電極在pH7.0的PBS溶液中連續(xù)掃50圈的循環(huán)伏安曲線,可以看到,除了第一圈,氧化還原峰電位基本不變而且氧化峰電流也基本沒變,這表明Hb比較牢固的固定在玻碳電極上。

    2.4 修飾電極不同掃速的循環(huán)伏安曲線

    圖4(A)考察了不同掃描速度和氧化還原峰電流之間的關系,隨著掃速的增大,氧化還原峰電流也逐漸的增大,但氧化還原峰電位基本不變。當掃速在100~600mV/s(a→f)間變化時,如圖4(B)氧化還原峰電流與掃描速度成一次線性關系,表明這是一個表面控制的反應過程,即為薄層電化學行為。同時,也可以進一步說明Hb成功的固定到電極上并且實現(xiàn)了直接電子傳遞。

    圖4 (A)ZnONRs-Hb/GCE修飾電極在磷酸緩沖溶液(pH7.0)中不同掃速的循環(huán)伏安的曲線;(B)峰電流對掃速的線性關系Fig.4 (A)Cyclic voltammograms(CVs)of ZnONRs-Hb/GCE in pH7.0 PBSsolutionwith differentscan ratesof(from a to f)100,200,300,400,500,and 600mV/s.(B)A plotofpeak currents vs.scan rates

    2.5 溶液pH的影響

    圖5 (A)ZnONRs-Hb/GCE修飾電極在不同pH磷酸緩沖溶液中不同掃速的循環(huán)伏安的曲線;(B)pH對式量電位E?的線性關系圖Fig.5 (A)Cyclic voltammogramsof ZnONRs-Hb/GCE in 0.05mol/LPBSsolutionwith different.pH:4.0,5.0, 6.0,7.0,8.0,9.0(from a to f)(B)A Plotof the formalpotentialsvs.pH values.Scan rate at200mV/s

    用循環(huán)伏安法研究了溶液pH對修飾電極式量電位E?的影響。圖5(A)表明,修飾電極的循環(huán)伏安行為在很大程度上受到外部溶液pH值的影響,該反應是:HbFe(III)+H++e-?HbHFe(II),從圖中可以看到,當?shù)滓旱膒H值改變時,修飾電極的循環(huán)伏安氧化還原峰電位隨緩沖溶液pH值的增加而負移。在pH值在4.0~9.0(a→f)之間時,式量電位E?與溶液的pH值呈線性關系,如圖5(B),斜率是-52.7mV/pH,這一數(shù)值與伴隨一個質(zhì)子轉(zhuǎn)移的單電子可逆電極反應的理論值-57.6mV/pH(20℃)相接近。當從pH9.0返回到pH4.0測定,得到的循環(huán)伏安圖與之前的一致,說明該修飾電極有很好的穩(wěn)定性和可逆性。

    2.6 修飾電極對過氧化氫(H2O2)的催化

    從圖6插圖中,可以看到,裸玻碳電極、ZnO/ GCE修飾電極對H2O2均沒有催化還原作用。但ZnO NRs-Hb/GCE修飾電極對H2O2有明顯的電催化還原作用,如圖4-6(b→e),隨著H2O2濃度的增大,還原峰逐漸的增大而氧化峰逐漸減小甚至消失。這表明ZnONRs-Hb/GCE修飾電極對H2O2有良好的電催化還原作用,反應是:H2O2+ 2HbHFe(II)→2HbFe(III)+2H2O

    圖6 不同修飾電極在磷酸緩沖溶液(pH=6.9)中不含H2O2及含不同濃度的H2O2的循環(huán)伏安曲線,掃速:200mV/sFig.6 Cyclic voltammogramsof ZnONRs-Hb/GCEatscan rateof200mV/s in PBS(pH7.0)withoutH2O2(a)andwith 0.045mol/L ofH2O210μL(b)20μL(c)30μL(d)40μL(e)Inset:bare GCE(a), ZnO/GCE atscan rate of200mV/s in 0.05mol/LPBS(pH7.0)withoutH2O2(b)and with 0.045mol/L of H2O2(c)

    2.7 ZnO NRs-Hb/GCE修飾電極對過氧化氫(H2O2)的響應

    圖7是ZnO NRs-Hb/GCE修飾電極在恒電位-300mV時對不同濃度的H2O2的響應情況。從圖7(A)中可以看出,ZnONRs-Hb/GCE修飾電極的響應電流隨H2O2濃度的增大而增大,每次加入H2O2后,其響應電流在3 s內(nèi)達到穩(wěn)定,說明ZnONRs-Hb/GCE修飾電極對H2O2的響應速度快。通過實驗結(jié)果計算得出,ZnONRs-Hb/GCE修飾電極對H2O2的響應的線性范圍是1.06×10-6~7.82×10-3mol/L(r=0.996),檢測限是8.86×10-7mol/L(S/N=3)。另外,根據(jù)圖7(B)的線性關系圖利用公式算得其Km是0.117mmol/L,表明修飾電極對H2O2的響應迅速而靈敏。

    2.8 重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

    該文還對ZnO NRs-Hb/GCE修飾電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性進行了研究。通過實驗發(fā)現(xiàn),4支ZnO NRs-Hb/GCE修飾電極在相同條件下對在PBS(pH7.0)溶液中對0.15mmol/L的H2O2的響應電流的相對偏差是1.9%左右,說明制備的生物傳感器重現(xiàn)性好。同時,還考察了該修飾電極的穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn),ZnO NRs-Hb/GCE修飾電極在pH7.0的PBS溶液中在0到-0.8 V電位窗口下,以200mV/s的速度連續(xù)掃描50圈,氧化還原峰電位、響應電流基本沒變,說明該修飾電極比較穩(wěn)定。ZnONRs-Hb/GCE修飾電極在0.15mmol/LH2O2中測定后在4℃放置兩周后,相同實驗條件下對H2O2的響應電流是原來的96%,表明制備的生物傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性都比較好。

    圖7 (A)ZnONRs-Hb/GCE修飾電極在10mL pH7.0 PBS溶液中計時電流曲線(工作電位:-300mV)(B)響應電流對H2O2濃度線性關系圖Fig.7 (A)A typicalamperometric i–tcurveof ZnONRs-Hb/GCEat-300mV in 10mLPBS solutionwith pH7.0(B)A plotofsteady-state currentvs.H2O2concentration

    3 結(jié)論

    該文將高等電點棒狀納米ZnO分散液和低等電點的血紅蛋白酶溶液混合,利用它們的等電點較大的差異性,在溶液中相互作用組裝,然后再自組裝修飾到玻碳電極上,制備了直接電子轉(zhuǎn)移的生物傳感器。制備過程簡單,易操作,重現(xiàn)性高。對H2O2的響應迅速,有較寬的檢測濃度范圍、檢測限低。

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    ZnO-nanorods-based self-assembly in liquid phase for immobilization of hemoglobin and directelectrochem istry sensor

    Zhang Qi,Duan Guo-ping,Guo Xiao-yu*,Yang Hai-feng*
    (The Education Ministry Key Lab ofResource Chemistry,DepartmentofChemistry,ShanghaiNormalUniversity, Shanghai200234,China)

    Self-assemblymethod could be used to synthesize nanomaterial-based biosensor by the help of polyelectrolyte such as poly(diallyldimethylammonium chloride)(PDDA).However,polyelectrolyte resulted in severe aggregation ofnanomaterialsor damaging the bioactivity ofhemoglobin(Hb).In addition,the processofpreparationwas relatively complicate and poor reproducibility.In thiswork,we developed a simplermethod that the ZnONPs sufficiently bound with Hb,taking advantage of the great difference of isoelectric pointbetween ZnONPs and Hb,and then self-assemblemethod wasused tomodify them on the cleaned glassy carbon electrode(GCE).The directelectron transfer of Hb was realized on the as-prepared electrode.UV-vis Spectrophotometer,TEM and cyclic voltammetrywere used to characterize the synthesis processofbiosensor.The responses of H2O2were linearly proportional to the concentration from 1.06×10-6~7.82×10-3mol/L with a detection limitof8.86×10-7mol/L(S/N=3).R.S.Dwas about l.9%foras-prepared electrodes in 0.15mmol/LH2O2in 0.05mol/LPBS(pH7.0).Thisbiosensor exhibited the facile-made,good reproducibility and stability.

    ZnO nanoparticles;hemoglobin;self-assembly;directelectron transfer

    國家自然科學基金面上項目(21475088)

    *通信聯(lián)系人,E-mail:haifengyang@yahoo.com,gxy2012@shnu.edu.cn,Tel.:021-64322144

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