• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于金/石墨烯/C60納米復(fù)合材料為基質(zhì)構(gòu)建ECL傳感器用于“signaloff”模式中Pb2+的檢測

    2017-08-09 09:55:03余燕清茍?zhí)壹?/span>
    化學(xué)傳感器 2017年1期
    關(guān)鍵詞:納米材料底物孵育

    鄧 煒,余燕清,徐 暢,祁 樂,茍?zhí)壹?,?明*

    (1.重慶市三峽庫區(qū)農(nóng)業(yè)面源污染控制工程技術(shù)研究中心,西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,重慶400715)

    (2.重慶市建設(shè)用地事務(wù)中心,重慶400015)

    (3.重慶市納米材料及傳感技術(shù)工程實驗室,西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶400715)

    (4.重慶市煙草專賣局,重慶400023)

    基于金/石墨烯/C60納米復(fù)合材料為基質(zhì)構(gòu)建ECL傳感器用于“signaloff”模式中Pb2+的檢測

    鄧 煒1,2,余燕清3,徐 暢4,祁 樂1,茍?zhí)壹?,高 明1*

    (1.重慶市三峽庫區(qū)農(nóng)業(yè)面源污染控制工程技術(shù)研究中心,西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,重慶400715)

    (2.重慶市建設(shè)用地事務(wù)中心,重慶400015)

    (3.重慶市納米材料及傳感技術(shù)工程實驗室,西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶400715)

    (4.重慶市煙草專賣局,重慶400023)

    該實驗通過將分子內(nèi)自增強的電致化學(xué)發(fā)光(ECL)釕復(fù)合物分子(PAMAM-Ru)直接標(biāo)記到8-17 DNAzyme底物鏈上,利用PAMAM-Ru分子內(nèi)的相互作用及電子的快速傳遞,極大地提高了ECL試劑的發(fā)光效率及穩(wěn)定性。另一方面,制備了納米金功能化的石墨烯和C60的復(fù)合物(Au@rGO-C60),由于該納米復(fù)合材料自身的比表面積較大,能夠固載大量的8-17 DNAzyme酶鏈,使其與底物鏈結(jié)合形成Pb2+特異剪切位點;同時由于Au@rGO-C60納米復(fù)合材料自身具有促進電子傳遞的作用,以其作為固載基質(zhì)將實現(xiàn)信號的進一步放大。另外,S2O82-作為分子間共反應(yīng)試劑與PAMAM-Ru分子內(nèi)自增強作用相結(jié)合實現(xiàn)ECL信號的雙重放大,獲得較強的初始信號。當(dāng)Pb2+存在時,能夠識別特異性的剪切位點,從而使結(jié)合到電極表面的PAMAM-Ru離開電極,導(dǎo)致ECL信號顯著降低,因此構(gòu)建了“signaloff”型ECL鉛離子傳感器。其檢測范圍為1.0×10-15mol/L到1.0×10-8mol/L,檢測限為3.34×10-16mol/L。

    8-17DNAzyme;“signaloff”;PAMAM-Ru;分子間共反應(yīng)試劑;Au@rGO-C60納米復(fù)合材料

    0 引言

    隨著指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)不斷發(fā)展,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種脫氧核酶(DNAzyme),這些DNAzyme表現(xiàn)出了多種催化反應(yīng)功能,且具有片段短,反應(yīng)迅速,穩(wěn)定性好,成本低且易于合成等特點而被廣泛應(yīng)用于金屬離子分析檢測中[1-2]。在所發(fā)現(xiàn)的這些脫氧核酶中,其中一類脫氧核酶能夠切割RNA,或者說能夠催化一些RNA固定位置的切割。8-17DNAzyme(8-17DNAzyme)便是其中一種,其是根據(jù)在1014個隨機序列體外篩選時第8輪循環(huán)的第17個克隆而得名而來[3]。在Pb2+出現(xiàn)時,8-17DNAzyme發(fā)生自催化切割反應(yīng),底物斷裂為兩段并與酶鏈分離,從而可以設(shè)計基于8-17 DNAzyme的Pb2+分析新方法。

    碳納米材料近些年來開始被廣泛地應(yīng)用到電致化學(xué)發(fā)光傳感器領(lǐng)域,例如一維碳納米材料碳納米管,二維碳納米材料石墨烯等[4-5]。還原氧化石墨烯 (rGO)是新型二維蜂窩狀的碳納米材料,它具有較高比表面積和很多含氧基團,可以為納米顆粒的負(fù)載提供活性位點[6]。金納米顆粒/還原氧化石墨烯納米片(Au/rGO)復(fù)合材料通常情況下都是通過原位還原HAuCl4到rGO納米片表面得到的,由于其大的比表面積展現(xiàn)出了高效的催化活性和大的固載容量[7]。C60作為一種新型碳納米材料由于其特殊的零維結(jié)構(gòu)和非定域化的π電子自從被發(fā)現(xiàn)開始就得到了廣泛關(guān)注[8-9],它可以作為一種新型、高效的傳感界面用于生物分子電致化學(xué)發(fā)光傳感器的構(gòu)建。C60納米顆粒有大的比表面積,可以有效增加其他納米材料的固載量,從而有效提高傳感器靈敏度。

    實驗中,基于分子內(nèi)/分子間雙重共反應(yīng)試劑信號放大策略,構(gòu)建了ECL傳感器用于Pb2+檢測。首先,利用共價交聯(lián)作用將樹枝狀共反應(yīng)試劑分子(PAMAM)與羧基化聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+結(jié)合,得到分子內(nèi)自增強ECL分子PAMAM-Ru。PAMAM-Ru作為發(fā)光物質(zhì),通過分子內(nèi)的相互作用及快速電子傳遞,極大地提高了Ru(bpy)32+的發(fā)光效率及穩(wěn)定性。另一方面,以還原的氧化石墨烯和C60納米顆粒作為固載基質(zhì),并進一步吸附金納米顆粒,可以得到納米金顆粒修飾的復(fù)合納米材料(Au@rGO-C60)?;贏u@rGO-C60較大的比表面積可以固載更多8-17 DNAzyme,并且其自身具有促進電子傳遞作用,利用Au@rGOC60作為固載基質(zhì)實現(xiàn)了信號的進一步放大。另外,S2O82-可以增強PAMAM-Ru的信號,利用S2O82-作為分子間共反應(yīng)試劑,與PAMAM分子內(nèi)自增強作用相結(jié)合實現(xiàn)信號的雙重放大。

    1 實驗部分

    1.1 試劑與儀器

    富勒?。–60)和氧化石墨烯(GO)購于北京百靈威生物科技有限公司;羧基改性的聚酰胺-胺型樹枝狀分子(PAMAM-COOH)、牛血清白蛋白(BSA,96-99%)、肼、氨水、過硫酸鉀、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、氯金酸(HAuCl4)和聚乙烯吡咯烷酮 (PVP,MW=40000)均采購自美國Sigma-Aldrich公司;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)從上海國藥集團有限公司購買;氨基聯(lián)吡啶釕(Ru-NH2)購于蘇州鈉凱科技有限公司。所用其它化學(xué)試劑均為分析純并且應(yīng)用時未經(jīng)過進一步純化,實驗用水為去離子水。磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH7.4,0.1 mol/L)用0.10 mol/L Na2HPO4, 0.10mol/LKH2PO4和0.1mol/LKCl制備。50mol/L Tris-HCl緩沖溶液 (pH7.4)用于適體溶液的配制;實驗所需的土壤樣品的預(yù)處理方法為Tessier連續(xù)提取法。

    DNA單鏈訂購與大連寶生物有限公司,對應(yīng)

    序列為:

    Pb2+-DNAzyme的底物鏈(17-DS):

    使用MPI-A型電致化學(xué)發(fā)光分析儀 (西安瑞邁電子科學(xué)技術(shù)有限公司,中國)進行ECL檢測;循環(huán)伏安表征用的是CHI610A型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司,中國)。檢測過程中使用三電極體系,即用被修飾的玻碳電極(GCE,Φ=4 mm)為工作電極,鉑電極作為對電極,Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極。利用掃描電子顯微鏡(SEM,S-4800,日本Hitachi Instrument公司)對不同納米復(fù)合材料的形貌進行表征。MP230酸度計(瑞士Metter Toledo公司)用于實驗中的pH調(diào)節(jié),稱量用AB204-S電子天平 (瑞士Metter Toledo公司)。BRANSONIC200超聲清洗儀(德國BRANSON ULTRASCHALL公司)和TGL-20M高速臺式冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)用于實驗材料的溶解、離心和洗滌等。

    1.2 ECL信號分子標(biāo)記的Pb2+-DNAzyme底物鏈(PAM AM-Ru-17-DS)的制備

    首先,在2mLRu-NH2(1.25mg/mL)溶液中依次加入100μL PAMAM-COOH、5mg EDC和1.2mg NHS,并于4℃下攪拌約8 h。在EDC/NHS的輔助作用下,PAMAM上的-COOH被活化,再通過酰胺化反應(yīng)與Ru-NH2交聯(lián)形成酰胺鍵,制得終端帶氨基的產(chǎn)物PAMAM-Ru。然后,將250 μL羧基修飾的Pb2+-DNAzyme的底物鏈(10 μmol/L,17-DS)加入500μL上述PAMAM-Ru溶液中,在4℃下攪拌過夜;因而,進一步通過酰胺鍵將該PAMAM-Ru與Pb2+-DNAzyme的酶鏈交聯(lián)來獲得ECL信號分子標(biāo)記的Pb2+-DNAzyme底物鏈 (PAMAM-Ru-17-DS)。將得到的PAMAM-Ru-17-DS復(fù)合物離心洗滌去除多余的試劑,再分散到1mL磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)中并置于4℃冰箱備用。

    1.3 Au@rGO-C60復(fù)合納米材料的制備

    取1mg氧化石墨烯(GO)加入到2mLC60納米溶膠中(2mg/mL),超聲30min使二者充分混勻,接下來,將40mg PVP溶解到上述溶液并在室溫下攪拌12 h,通過π-π堆積作用可以得到rGO-C60納米復(fù)合物,離心洗滌,分散于2mL磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)中。緊接著,在攪拌的情況下,3.5μL肼和200μL氨水被依次加入上述溶液中并在95℃下加熱1 h,然后,離心洗滌,將所得的產(chǎn)物溶于1.5mL磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)中。再次,向上述制得的溶液中加入10mg PVP和1.5mL的抗壞血酸溶液(AA,0.2mol/L),攪拌并加熱,當(dāng)溫度達到90℃后,逐滴滴入300μL HAuCl4(0.1mol/L)溶液,將溫度保持在90℃下攪拌3 h。最后,將制備好的Au@rGO-C60復(fù)合納米材料離心洗滌后溶于1 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)并儲于冰箱備用。

    1.4 鉛離子傳感器的制備

    在修飾前,將玻碳電極(GCE,Ф=4mm)分別用0.3,0.05μm的三氧化二鋁(Al2O3)粉在麂皮上打磨、拋光,再用去離子水洗凈并依次用乙醇和去離子水超聲洗凈,清洗后的電極置于室溫下自然晾干備用。

    該鉛離子傳感器的制備過程如圖1所示:首先,在預(yù)處理的GCE表面滴涂10μL分散好的Au@rGO-C60納米復(fù)合物,待其自然晾干成膜。接下來,將15μL巰基標(biāo)記的Pb2+-DNAzyme的酶鏈(5μmol/L,17-E)滴于上述修飾電極表面于4℃下孵育過夜,利用Au-S鍵使Pb2+-DNAzyme的酶鏈連接在電極表面。為了封閉電極上的非特異性吸附位點,15μLBSA(1%)被滴在電極表面并于室溫下反應(yīng)40min。然后,取15μL制備好的PAMAM-Ru標(biāo)記的Pb2+-DNAzyme的底物鏈(PAMAM-Ru-7-DS)溶液滴加到修飾好的電極表面,在室溫下反應(yīng)2 h以形成Pb2+特異性識別性的剪切位點。最后,將所得到的修飾電極置于含有不同濃度Pb2+的溶液中,在37℃下孵育70 min,至此,鉛離子傳感器制備成功。傳感器構(gòu)建過程中的每一步修飾后都用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)洗滌。

    1.5 電極的測試過程和信號響應(yīng)原理

    圖1 ECL傳感器制備過程的原理圖Fig.1 Schematic diagram ofpreparation of the ECLbiosensor

    實驗測量電致化學(xué)發(fā)光信號采用三電極體系:修飾的玻碳電極、Ag/AgCl(飽和KCl)電極以及Pt電極分別作為工作電極、參比電極和對電極。將修飾好的電極置于3mL 0.1mol/L K2S2O8的PBS(pH=7.4)測試底液中,光電倍增管高壓設(shè)置為800 V,電壓掃描范圍為-1.6 V~0 V。在沒有目標(biāo)物Pb2+存在的情況下,ECL信號分子(PAMAM-Ru)通過標(biāo)記到Pb2+-DNAzyme底物鏈上接近于電極表面,因而產(chǎn)生較高的ECL初始信號;然而,當(dāng)目標(biāo)Pb2+存在的情況下,底物鏈將被剪斷,連接在底物鏈上的ECL信號分子也隨之脫離電極表面,分散到底液中,ECL檢測信號急劇下降,并且目標(biāo)物Pb2+的濃度越大,越多的底物鏈將被剪斷,那么結(jié)合到電極表面的PAMAM-Ru便會越少,ECL信號越低。因此,實現(xiàn)了“signal off”型Pb2+生物傳感器的檢測。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 納米材料的表征

    利用掃描電子顯微鏡 (SEM)對所制備的Au@rGO-C60進行表征。如圖2(A)和放大的圖像2(B)所示,可以觀察到金納米顆粒均勻的分散在rGO-C60的表面上,金納米顆粒粒徑在50±30 nm左右,從上述形貌表征證明了Au@C60-rGO納米顆粒的成功制備。

    圖2 納米材料的SEM表征Fig.2 SEM characterization of(A)Au@rGO-C60and(B)theenlarge imageofAu@rGO-C60

    2.2 電極構(gòu)建過程的CV表征

    利用循環(huán)伏安(CV)法來表征傳感器的制備過程,及將每一步修飾后的電極置于含有0.1 mol/LKCl的[Fe(CN)6]3-/4-(5mmol/L)溶液中進行循環(huán)伏安測試。正如圖3所示,曲線a為裸玻碳電極,可以觀察到準(zhǔn)可逆氧化還原峰的存在。當(dāng)Au@rGO-C60固載到電極表面后,由于金納米顆粒加快了電子的傳遞,曲線電流值增強(曲線b)。接下來,在電極表面依次修飾17-E、BSA和PAMAM-Ru-17-DS后,電流值依次降低 (曲線c、d、e),原因在于17-E、BSA和PAMAM-Ru-17-DS均為生物大分子,本身不導(dǎo)電,因此在電極表面形成了一層阻礙層,不利于電子的傳遞。最后,1.0×10-10mol/L的Pb2+溶液被滴于修飾電極表面,電流值明顯增加 (曲線f),那是由于Pb2+剪切Pb2+-DNAzyme的底物鏈后,剪切的底物鏈離開電極表面,使得電極表面的空間位阻降低,從而電活性探針[Fe(CN)6]3-/4-的氧化還原信號增強。基于以上電極修飾過程的氧化還原峰電流強度的變化可以很好地證明傳感器的成功制備。

    圖3 傳感器修飾過程得的CV表征Fig.3 CV characterization ofsensorpreparation process(a.GCE,b.Au@rGO-C60/GCE,c.17-E/Au@rGO-C60/ GCE,d.BSA/17-E/Au@rGO-C60/GCE,e.PAMAM-Ru-17-DS/BSA/17-E/Au@rGO-C60/GCE,f.Pb2+/PAMAMRu-17-DS/BSA/17-E/Au@rGO-C60/GCE)

    2.3 PAMAM-Ru-17-DS的ECL性能研究

    通過ECL光譜對PAMAM-Ru-17-DS的電致化學(xué)發(fā)光性能進行了測試。在3mL 0.1mol/L K2S2O8的PBS(pH=7.4)溶液中,加入10μL PAMAM-Ru-17-DS的溶液,對其進行分光,如圖4所示:該溶液的ECL光譜在625 nm處出現(xiàn)最大峰。根據(jù)之前的文獻報道,O2/S2O82-體系中單線態(tài)氧(1(O2)2*)的發(fā)光在575 nm處[10],因此可以確定放光體是激發(fā)態(tài)的Ru配合物[11],而不是激發(fā)態(tài)的單線態(tài)氧(1(O2)2*)的發(fā)光。其本質(zhì)就是S2O82-作為共反應(yīng)試劑,促進PAMAM-Ru-17-DS的發(fā)光。

    圖4 PAMAM-Ru-17-DS的ECL光譜圖Fig.4 ECL spectra of PAMAM-Ru-17-DS

    2.4 Pb2+孵育時間的優(yōu)化

    考慮到Pb2+的孵育時間會直接影響傳感器的性能,為此實驗用一定濃度的Pb2+(1.0×10-10mol/L)溶液對孵育的時間進行了優(yōu)化,如圖5所示。傳感器ECL強度先隨孵育時間的增加而增大,而當(dāng)孵育時間超過40min時,ECL強度又隨著隨孵育時間的增加反而減小,孵育時間達到70 min后ECL信號趨于平穩(wěn)。從傳感器性能和節(jié)約時間角度綜合考慮,實驗選擇70min作為該研究的最佳孵育時間。

    圖5 Pb2+孵育時間的優(yōu)化Fig.5 The relationship between ECL intensity and the incubation time ofPb2+

    2.5 傳感器對Pb2+的響應(yīng)性能

    在最優(yōu)的實驗條件下,于0.1mol/LK2S2O8的檢測底液中,在-1.6~0 V電位下,對不同濃度的Pb2+所孵育的一系列傳感器進行了檢測。如圖6所示,傳感器的ECL信號隨著反應(yīng)的Pb2+濃度的增加而減小,其檢測范圍為1.0×10-15mol/L到 1.0×10-8mol/L(曲線a~h), 校正曲線方程為I= -444.8 lg c-1833.6(其中I代表ECL強度,c代表Pb2+的濃度),相關(guān)系數(shù)為0.9922(如圖6插圖所示),檢測限(根據(jù)公式LOD=3SB/m計算,其中SB代表空白標(biāo)準(zhǔn)偏差,m代表校正曲線的斜率)為3.34×10-16mol/L。

    圖6 該傳感器對不同濃度Pb2+的ECL響應(yīng)曲線和傳感器的校準(zhǔn)曲線Fig.6 ECLprofilesof thesensor in the presenceofdifferentconcentrationsofPb2+and the corresponding calibration curve for Pb2+detection.(a~h):1.0×10-8,1.0×10-9,1.0×10-10,1.0×10-11,1.0×10-12,1.0×10-13,1.0×10-14and 1.0×10-15mol/L

    2.6 傳感器相關(guān)性能的研究

    圖7 該傳感器的(A)選擇性和(B)穩(wěn)定性Fig.7 (A)The selectivity of the proposed ECL sensor.ion concentrations:Pb2+(1.0×10-8mol/L),other interfering ions(1.0×10-5mol/L).(B)The stability of the proposed ECL sensor incubatedwith 1.0×10-7mol/LPb2+under consecutive cyclic potentialscans for7 cycles

    為了探究傳感器的選擇性,選擇Na+、Mg2+、Cu2+、Ca2+、Cd2+、Ag+、Co2+作為干擾離子。對孵育有1.0×10-5mol/L各種干擾離子的傳感器和1.0×10-8mol/LPb2+的傳感器在最優(yōu)的實驗條件下分別進行了ECL對比。如圖7(A),相對于干擾離子而言,傳感器孵育有Pb2+的溶液時,其ECL響應(yīng)降低非常明顯,而干擾離子所孵育的傳感器的ECL降低不明顯。同時,考慮到干擾離子是目標(biāo)物Pb2+濃度的1000倍,所以該結(jié)果能夠證明制備的傳感器對Pb2+有良好的選擇性。另外,也對傳感器的穩(wěn)定性進行了探究,這是評價傳感器性能的另一項重要指標(biāo)。將孵育有1.0×10-8mol/LPb2+的傳感器進行連續(xù)掃描(7圈),如圖7(B)所示,出現(xiàn)了穩(wěn)定的ECL信號,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)為1.8%,證明該傳感器有非常好的穩(wěn)定性。

    2.7 實際土壤樣品中的Pb2+檢測

    將制備的傳感器用于實際土壤樣品中Pb2+的檢測,并采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對傳感器的回收率進行了測定。首先將用Tessier連續(xù)提取法所獲得的提取液稀釋10~100倍,然后加入不同濃度的Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品,并用所制得的傳感器分別測定土壤樣品加標(biāo)前后的Pb2+含量。如表1所示,所得回收率介于91.0%~107%之間,說明傳感器具有較好的實際應(yīng)用價值。

    表1 實際土壤樣品的加標(biāo)回收率實驗Tab.1 Determ ination of Pb2+added in soilextraction solution w ith the proposed biosensor

    3 結(jié)論

    在此工作中,通過設(shè)計特定的DNA序列,利用形成的Pb2+-DNAzyme的酶鏈構(gòu)建了Pb2+的特異性識別位點,實現(xiàn)了對Pb2+簡便、靈敏的ECL檢測。首先,通過合成新型分子內(nèi)自增強ECL分子PAMAM-Ru為信號探針,并結(jié)合溶液中的分子間共反應(yīng)試劑S2O82-,構(gòu)建了基于分子內(nèi)/分子間雙重共反應(yīng)試劑來實現(xiàn)信號放大的ECL傳感器,獲得了較強的初始信號,從而提高了“signal off”響應(yīng)模式的靈敏度。其次,以Au@C60-rGO復(fù)合納米材料作為固載基質(zhì),其提供了大量活性位點可高效固載更多的Pb2+的酶鏈,實現(xiàn)了信號的進一步放大。根據(jù)“signaloff”響應(yīng)原則,強調(diào)傳感器的ECL信號隨著反應(yīng)的Pb2+濃度的增加而減小,其檢測范圍為1.0×10-15mol/L到1.0×10-8mol/L,檢測限為3.34×10-16mol/L。當(dāng)干擾離子Na+、Mg2+、Cu2+、Ca2+、Cd2+、Ag+、Co2+的濃度為Pb2+的1000倍時,該傳感器對Pb2+仍然展現(xiàn)出良好的響應(yīng)性能。

    [1]Zhao X H,Kong R M,Zhang X B,et al.Graphene–DNAzyme based biosensor for amplified fluorescence“turn-on”detection of Pb2+with a high selectivity[J].Analyticalchemistry,2011,83:5062-5066.

    [2]Xiang Y,Tong A,Lu Y.Abasic site-containing DNAzyme and aptamer for label-free fluorescent detection of Pb2+and adenosinewith high sensitivity,selectivity,and tunable dynamic range[J].Journalof the American ChemicalSociety,2009,131:15352-15357.

    [3]Kim H K,Liu J,Li J,etal.Metal-dependentglobal folding and activity of the 8-17DNAzyme studied by fluorescence resonance energy transfer[J].Journal of the American ChemicalSociety,2007,129:6896-6902.

    [4]Xiao FN,WangM,Wang FB,etal.Graphene–ruthenium(II)complex composites for sensitive ECL immunosensors[J].Small,2014,10:706-716.

    [5]LiF,Yu Y,LiQ,etal.A homogeneous signal-on strategy for the detection of rpob genes ofmycobacterium tuberculosis based on electrochemiluminescent graphene oxide and ferrocene quenching[J].Analytical chemistry, 2014,86:1608-1613.

    [6]Huang J,Zhang L,Chen B,etal.Nanocompositesofsizecontrolled gold nanoparticlesand graphene oxide:formation and applications in SERS and catalysis[J].Nanoscale,2010,2:2733-2738.

    [7]ChoiY,Bae H S,Seo E,etal.Hybrid gold nanoparticlereduced graphene oxide nanosheetsasactive catalysts for highly efficient reduction of nitroarenes[J].Journal of MaterialsChemistry,2011,21:15431-15436.

    [8]Shi J,Wang L,Gao J,et al.A fullerene-based multifunctional nanoplatform for cancer theranostic applications[J].Biomaterials,2014,35:5771-5784.

    [9]Miao Y,Xu J,Shen Y,et al.Nanoparticle as signaling protein mimic:robust structural and functionalmodulation of CaMKII upon specific binding to fullerene C60nanocrystals[J].ACSnano,2014,8:6131-6144.

    [10]YaoW,Wang L,Wang H,etal.Cathodic electrochemiluminescence behaviorofnorfloxacin/peroxydisulfate system in purely aqueous solution[J].Electrochimica Acta, 2008,54:733-737.

    [11]Xiong CY,Wang H J,LiangW B,etal.Luminescence‐Functionalized Metal-Organic Frameworks Based on a Ruthenium(II)Complex:A Signal Amplification Strategy for Electrogenerated Chemiluminescence Immunosensors [J].Chemistry-A European Journal,2015,21:9825-9832.

    A“signal-off”electrochem ilum inescence sensor for Pb2+based on the matrix of Au/Graphene/C60nanocom posite

    DengWei1,2,Yu Yan-qing3,Xu Chang4,QiLe1,Gou Tao-ji1,GaoMing1*
    (1.Center for AgriculturalNon-pointSource Pollution Control in the ThreeGorgesReservoir Area,Collegeof
    Resourcesand Environment,SouthwestUniversity,Chongqing 400715,China)
    (2.Chongqing Construction Land AffairsCenter,YuZhong District,Chongqing 400015,China)
    (3.Chongqing Nanomaterialsand Sensing Technology Engineering Laboratory,College ofChemistry and Chemical Engineering,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China)
    (4.Chongqing TobaccoMonopoly Bureau,JiangBeiDistrict,Chongqing 400023,China)

    In thiswork,the intramolecular self-enhanced ECLmolecule PAMAM-Ru was directly labeled with 8-17 DNAzyme substrate chain,which could greatly improve the luminous efficiency and stability of ECL reagents through intramolecular interactions and rapid electron transport.On the other hand,the Au nanoparticles functionalized graphene and C60complex(Au@rGO-C60)could actasmatrix to immobilize a large amountof 8-17 DNAzyme enzyme chain via its large specific surface area.The 8-17 DNAzyme enzyme chain could be further hybridized with the 8-17 DNAzyme substrate chain to form Pb2+-specific DNAzyme.Meanwhile,the Au@rGO-C60asmatrix could further amplify the ECL signal owing to its large specific surface area and desirable electrical conductivity.In addition,the double signalamplification was obtained by using S2O82-as intermolecular co-reactionreagentand PAMAM-Ru as intramolecular ECL luminophore,resulting in the generation of the strong initial signal. In presence of target Pb2+,the ECL signal significantly decreased comparingwith that in the absence of Pb2+,which indicated that the PAMAM-Ru labeled 8-17 DNAzyme substrate chain was irreversibly self-cleaved to release PAMAM-Ru from the electrode surface.The prepared“signal off”ECL biosenesorwas suuccesfully constructed, and the detection rangewas1.0×10-15mol/L to 1.0×10-8mol/L,the detection limitis3.34×10-16mol/L.

    8-17 DNAzyme;“signaloff”;PAMAM-Ru;intermolecular co-reagents;Au@rGO-C60nanocomposite

    “十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD14B18);中央高?;緲I(yè)務(wù)費專項(XDJK2015D020)

    *通信聯(lián)系人,E-mail:gaoming@swu.edu.cn

    猜你喜歡
    納米材料底物孵育
    武器中的納米材料
    學(xué)與玩(2022年8期)2022-10-31 02:41:56
    兩種品牌大腸菌群酶底物法檢測試劑性能的比較
    云南化工(2021年6期)2021-12-21 07:30:56
    二維納米材料在腐蝕防護中的應(yīng)用研究進展
    解析參與植物脅迫應(yīng)答的蛋白激酶—底物網(wǎng)絡(luò)
    科學(xué)(2020年2期)2020-08-24 07:57:00
    三物黃芩湯組分(群)配伍在大鼠肝微粒體孵育模型中的相互作用
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:27
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    大鼠肝微粒體孵育體系中2種成分的測定及其代謝
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    MoS2納米材料的制備及其催化性能
    泛素連接酶-底物選擇關(guān)系的研究進展
    抗輻照納米材料的研究進展
    欧美97在线视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩一区二区三区影片| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 两个人看的免费小视频| 黄片大片在线免费观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 热re99久久国产66热| 中文字幕色久视频| 电影成人av| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产一级毛片在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 女人精品久久久久毛片| 丁香六月欧美| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 91九色精品人成在线观看| 午夜老司机福利片| 国产亚洲精品久久久久5区| 天天影视国产精品| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 人人澡人人妻人| 亚洲成国产人片在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 十八禁网站网址无遮挡| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 热99re8久久精品国产| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 老司机福利观看| 亚洲视频免费观看视频| 男人添女人高潮全过程视频| 欧美日韩视频精品一区| 曰老女人黄片| 久久久国产一区二区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美日本中文国产一区发布| 久久亚洲精品不卡| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲熟女毛片儿| 国产精品熟女久久久久浪| 久久青草综合色| 欧美少妇被猛烈插入视频| 欧美日韩一级在线毛片| 国产精品 国内视频| 一个人免费在线观看的高清视频 | 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 黄片小视频在线播放| 久热这里只有精品99| 国产深夜福利视频在线观看| 欧美成人午夜精品| 91九色精品人成在线观看| 免费在线观看日本一区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| av视频免费观看在线观看| 一个人免费看片子| 黄色 视频免费看| 高清欧美精品videossex| 真人做人爱边吃奶动态| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 一区二区av电影网| 日韩大码丰满熟妇| 最近最新中文字幕大全免费视频| 五月开心婷婷网| 亚洲视频免费观看视频| 91成人精品电影| 午夜视频精品福利| 亚洲五月色婷婷综合| 超碰成人久久| 色播在线永久视频| 一区二区三区四区激情视频| 欧美大码av| 精品久久蜜臀av无| 亚洲伊人久久精品综合| 久9热在线精品视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 欧美黑人欧美精品刺激| 老司机靠b影院| 我要看黄色一级片免费的| 制服人妻中文乱码| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 一区在线观看完整版| 天堂中文最新版在线下载| 91精品三级在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 精品国内亚洲2022精品成人 | 亚洲欧美成人综合另类久久久| 成人免费观看视频高清| 丝袜喷水一区| 国产又色又爽无遮挡免| 国产av国产精品国产| 老司机福利观看| 国产黄色免费在线视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 他把我摸到了高潮在线观看 | 99国产精品99久久久久| 久久青草综合色| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 十分钟在线观看高清视频www| 国产熟女午夜一区二区三区| 丝袜人妻中文字幕| 国产成人精品久久二区二区91| 男女之事视频高清在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲国产日韩一区二区| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲久久久国产精品| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲人成电影观看| 亚洲中文av在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 精品人妻在线不人妻| 两个人免费观看高清视频| 精品一区二区三卡| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产在线一区二区三区精| 嫩草影视91久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 男人舔女人的私密视频| 老熟女久久久| 久久精品国产a三级三级三级| 男女午夜视频在线观看| 波多野结衣av一区二区av| 国产在线观看jvid| 亚洲欧美色中文字幕在线| 丁香六月天网| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精品人妻1区二区| 国产精品影院久久| 好男人电影高清在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 精品久久久精品久久久| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产97色在线日韩免费| 少妇人妻久久综合中文| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久久久国内视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 中国美女看黄片| 这个男人来自地球电影免费观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 伊人亚洲综合成人网| 电影成人av| 1024视频免费在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产色视频综合| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 中文字幕人妻熟女乱码| 日韩制服骚丝袜av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 99香蕉大伊视频| 一区二区av电影网| 久久久久国产一级毛片高清牌| 2018国产大陆天天弄谢| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产成人啪精品午夜网站| 精品一区在线观看国产| 91大片在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 日日爽夜夜爽网站| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| av电影中文网址| 超碰成人久久| 国产精品国产三级国产专区5o| 在线观看www视频免费| 激情视频va一区二区三区| 蜜桃国产av成人99| 成人国产一区最新在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 韩国精品一区二区三区| 十八禁高潮呻吟视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久亚洲国产成人精品v| 在线天堂中文资源库| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产有黄有色有爽视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 一区在线观看完整版| 亚洲伊人久久精品综合| 久久久国产一区二区| 亚洲情色 制服丝袜| 色播在线永久视频| 午夜激情av网站| 亚洲精品国产一区二区精华液| 午夜久久久在线观看| 午夜激情久久久久久久| 青春草亚洲视频在线观看| 国产1区2区3区精品| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲中文字幕日韩| 乱人伦中国视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久毛片免费看一区二区三区| 欧美日本中文国产一区发布| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 一级,二级,三级黄色视频| 后天国语完整版免费观看| 国产国语露脸激情在线看| 2018国产大陆天天弄谢| 精品少妇久久久久久888优播| 午夜福利影视在线免费观看| 水蜜桃什么品种好| 三上悠亚av全集在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 日本精品一区二区三区蜜桃| cao死你这个sao货| 91麻豆av在线| 国产片内射在线| 精品少妇内射三级| 国产精品免费视频内射| 91字幕亚洲| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲男人天堂网一区| 女人久久www免费人成看片| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| av又黄又爽大尺度在线免费看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 99国产精品99久久久久| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲精品国产区一区二| 搡老岳熟女国产| 高清视频免费观看一区二区| 成年美女黄网站色视频大全免费| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 热re99久久精品国产66热6| 亚洲成人免费av在线播放| 免费在线观看完整版高清| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲美女黄色视频免费看| 免费不卡黄色视频| 国产片内射在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 999久久久精品免费观看国产| 美女午夜性视频免费| 岛国毛片在线播放| 日韩人妻精品一区2区三区| 午夜老司机福利片| 国产精品一区二区在线不卡| 午夜福利影视在线免费观看| 12—13女人毛片做爰片一| h视频一区二区三区| 五月开心婷婷网| 桃红色精品国产亚洲av| 各种免费的搞黄视频| 淫妇啪啪啪对白视频 | 亚洲成人免费电影在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 啦啦啦在线免费观看视频4| 男女下面插进去视频免费观看| 青青草视频在线视频观看| 国产精品免费视频内射| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 99精品欧美一区二区三区四区| 黄频高清免费视频| 波多野结衣一区麻豆| 黑人猛操日本美女一级片| netflix在线观看网站| 好男人电影高清在线观看| 午夜福利免费观看在线| 各种免费的搞黄视频| 久久久久精品人妻al黑| 99精品久久久久人妻精品| 午夜日韩欧美国产| 国产xxxxx性猛交| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 欧美乱码精品一区二区三区| h视频一区二区三区| 久久免费观看电影| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产在线一区二区三区精| 久久久久久久久久久久大奶| 色视频在线一区二区三区| 好男人电影高清在线观看| 在线av久久热| 黄色怎么调成土黄色| 女性被躁到高潮视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 啪啪无遮挡十八禁网站| 成人国产av品久久久| 大型av网站在线播放| 99久久国产精品久久久| 久久ye,这里只有精品| av免费在线观看网站| 日本91视频免费播放| 女性生殖器流出的白浆| tocl精华| www.熟女人妻精品国产| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 久久精品人人爽人人爽视色| 国产黄色免费在线视频| 老司机福利观看| av不卡在线播放| 99国产极品粉嫩在线观看| www.999成人在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 一级片'在线观看视频| 国产精品久久久久成人av| 丝瓜视频免费看黄片| 十八禁网站免费在线| 视频在线观看一区二区三区| 国产激情久久老熟女| 免费日韩欧美在线观看| av在线app专区| av有码第一页| 亚洲美女黄色视频免费看| 正在播放国产对白刺激| 一二三四在线观看免费中文在| 青春草视频在线免费观看| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲av男天堂| 国产视频一区二区在线看| 久久久久精品人妻al黑| 精品国产一区二区久久| 久久青草综合色| 亚洲熟女毛片儿| 男人添女人高潮全过程视频| 免费观看av网站的网址| 日韩大片免费观看网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久久久久久国产电影| 啦啦啦 在线观看视频| 久久性视频一级片| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久热爱精品视频在线9| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美精品一区二区大全| 夫妻午夜视频| 少妇 在线观看| 1024香蕉在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 999久久久精品免费观看国产| 欧美变态另类bdsm刘玥| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲免费av在线视频| 丰满少妇做爰视频| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲人成77777在线视频| 热99re8久久精品国产| 国产免费视频播放在线视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日韩三级视频一区二区三区| 国产熟女午夜一区二区三区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久久久久久国产电影| 午夜福利免费观看在线| 亚洲国产av新网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 精品亚洲成a人片在线观看| 大香蕉久久网| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲第一av免费看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲国产中文字幕在线视频| 少妇 在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 免费在线观看黄色视频的| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 最近中文字幕2019免费版| 成年女人毛片免费观看观看9 | 免费黄频网站在线观看国产| 欧美xxⅹ黑人| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲国产看品久久| 电影成人av| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 视频区图区小说| 亚洲国产欧美网| 国产一区有黄有色的免费视频| 男女下面插进去视频免费观看| av一本久久久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 女人久久www免费人成看片| 国产区一区二久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久久欧美国产精品| 久9热在线精品视频| netflix在线观看网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 中亚洲国语对白在线视频| 中国国产av一级| 免费在线观看影片大全网站| 岛国毛片在线播放| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲成人国产一区在线观看| 91国产中文字幕| 啦啦啦在线免费观看视频4| 涩涩av久久男人的天堂| 天天添夜夜摸| 午夜久久久在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 国产精品.久久久| 久久久久视频综合| 午夜两性在线视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久久久视频综合| 午夜两性在线视频| 视频区欧美日本亚洲| 国产成人欧美在线观看 | 高清视频免费观看一区二区| 麻豆国产av国片精品| av电影中文网址| 男女无遮挡免费网站观看| 日韩大码丰满熟妇| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 午夜福利在线观看吧| 久久ye,这里只有精品| 午夜视频精品福利| 免费观看av网站的网址| 国产片内射在线| 三上悠亚av全集在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 久久ye,这里只有精品| 成年av动漫网址| 欧美精品一区二区大全| 淫妇啪啪啪对白视频 | 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产黄色免费在线视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 韩国精品一区二区三区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 亚洲欧洲日产国产| 国产日韩欧美视频二区| 日韩视频在线欧美| 日韩人妻精品一区2区三区| 丁香六月欧美| 欧美97在线视频| 18在线观看网站| 国产一区二区在线观看av| 欧美大码av| 韩国精品一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 国产高清videossex| 韩国精品一区二区三区| 69av精品久久久久久 | 成人三级做爰电影| 亚洲国产成人一精品久久久| 女人久久www免费人成看片| 少妇的丰满在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久久久视频综合| 亚洲中文字幕日韩| 天天添夜夜摸| 搡老乐熟女国产| 日韩欧美国产一区二区入口| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 精品一区在线观看国产| 男人舔女人的私密视频| 久久人妻熟女aⅴ| 精品一区二区三区av网在线观看 | 久久99热这里只频精品6学生| 精品亚洲成a人片在线观看| 成人手机av| 18禁国产床啪视频网站| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲av成人一区二区三| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美日韩视频精品一区| av不卡在线播放| 捣出白浆h1v1| 免费av中文字幕在线| 丝瓜视频免费看黄片| 满18在线观看网站| 国产精品一区二区在线不卡| 国产亚洲精品第一综合不卡| 青草久久国产| 99国产精品一区二区三区| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲avbb在线观看| www.自偷自拍.com| 国产黄色免费在线视频| 久久精品国产综合久久久| 国产91精品成人一区二区三区 | videosex国产| 久久久久精品国产欧美久久久 | 日韩三级视频一区二区三区| 777米奇影视久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 交换朋友夫妻互换小说| 国产成人a∨麻豆精品| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 午夜免费成人在线视频| 青草久久国产| 男人爽女人下面视频在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 国产精品一区二区在线不卡| 国产一区有黄有色的免费视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 男女下面插进去视频免费观看| 精品高清国产在线一区| 亚洲男人天堂网一区| 午夜久久久在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 麻豆国产av国片精品| 99热全是精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 久久久久久久大尺度免费视频| cao死你这个sao货| 亚洲专区字幕在线| 黄色视频不卡| 伦理电影免费视频| 啦啦啦免费观看视频1| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产精品国产av在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 超碰97精品在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 久久香蕉激情| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 免费高清在线观看日韩| 久久国产精品人妻蜜桃| 丁香六月天网| 精品久久久久久电影网| 妹子高潮喷水视频| a级毛片在线看网站| 美女福利国产在线| 另类亚洲欧美激情| 亚洲国产欧美在线一区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 一级片免费观看大全| 丰满少妇做爰视频| 在线精品无人区一区二区三| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲 国产 在线| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产成人啪精品午夜网站| 日本91视频免费播放| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国产精品av久久久久免费| 99国产精品99久久久久| 亚洲第一青青草原| 国产成人av教育| 美国免费a级毛片| 亚洲少妇的诱惑av| 狠狠狠狠99中文字幕| 中文字幕最新亚洲高清| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲中文av在线| 亚洲国产中文字幕在线视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 色老头精品视频在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 黄色怎么调成土黄色| 蜜桃在线观看..| 国产男女内射视频| 成年动漫av网址| 欧美国产精品一级二级三级| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美中文综合在线视频| avwww免费| av一本久久久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲第一青青草原| 黄片播放在线免费| www.999成人在线观看| 脱女人内裤的视频| 成人免费观看视频高清| 午夜福利视频精品| 久久久久精品人妻al黑| 久久久久久久久免费视频了| av视频免费观看在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产精品 欧美亚洲| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产男女内射视频| 考比视频在线观看| 伦理电影免费视频| 亚洲男人天堂网一区| 91大片在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 看免费av毛片| 久久久水蜜桃国产精品网| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 色94色欧美一区二区| 咕卡用的链子| 免费观看av网站的网址| 国产成+人综合+亚洲专区| 永久免费av网站大全| av免费在线观看网站| 青草久久国产| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产一区二区在线观看av|