兔舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌群的檢測(cè)

段會(huì)勇

（泰山職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)工程系，山東 泰安 271000）

疾病防控

兔舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌群的檢測(cè)

段會(huì)勇

（泰山職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)工程系，山東 泰安 271000）

采用ANDERSEN-6級(jí)空氣微生物樣品收集器，以5%公綿羊血瓊脂和麥康凱3號(hào)培養(yǎng)基為采樣介質(zhì)，分別對(duì)3個(gè)不同兔場(chǎng)環(huán)境中氣載需氧菌含量、氣載革蘭氏陰性菌含量與菌群組成進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明：兔舍內(nèi)氣載需氧菌含量在0.78×103～20.10×103CFU/m3之間，氣載需氧革蘭氏陰性菌含量在0.39×102～10.30×102CFU/m3之間，占需氧菌總數(shù)的2.12%～10.20%；革蘭氏陰性菌群包括腸桿菌、奈瑟氏菌、巴氏桿菌和假單胞菌，腸桿菌科細(xì)菌中大腸埃希氏菌占多數(shù)。在其中2個(gè)兔舍中還檢測(cè)到可導(dǎo)致兔發(fā)生肺炎的肺炎克雷伯氏菌。

兔舍；氣載革蘭氏陰性菌；微生物氣溶膠

隨著集約化、規(guī)模化畜牧生產(chǎn)的發(fā)展和養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)的積累，人們已經(jīng)越來(lái)越深入地認(rèn)識(shí)到微生物氣溶膠在流行病傳播中所占的重要地位。畜禽主要烈性傳染病大都通過(guò)氣源性傳播，給畜牧業(yè)造成極大的危害和損失。因此，全面了解畜禽舍內(nèi)、外環(huán)境空氣微生物菌群、含量、分布情況及特性，對(duì)于建立氣源性傳染的傳播模型及流行病的預(yù)防和監(jiān)控十分重要。

國(guó)外在畜禽舍環(huán)境與人類和動(dòng)物的健康方面的眾多研究表明，空氣質(zhì)量狀況會(huì)影響人及動(dòng)物健康，空氣質(zhì)量差會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物及人類一些疾病的發(fā)生，主要是呼吸道疾病、免疫下降等，特別是空氣中的微生物及其代謝產(chǎn)物（內(nèi)毒素、氨、硫化氫等），是影響動(dòng)物健康的潛在因素［1］。

國(guó)內(nèi)外對(duì)細(xì)菌氣溶膠的研究報(bào)道中，革蘭氏陰性菌僅占較小的比例，但其中包含了大量的致病菌和條件性致病菌，其濃度和組分對(duì)于動(dòng)物舍內(nèi)環(huán)境質(zhì)量具有重要意義。許多科研工作者都對(duì)動(dòng)物舍內(nèi)環(huán)境中的革蘭氏陰性菌濃度和組分進(jìn)行了研究［2-4］。Zucker-BA等［5］對(duì)4個(gè)牛舍、1個(gè)豬舍和1個(gè)雞舍中的氣載革蘭氏陰性菌的種類和含量進(jìn)行過(guò)研究，發(fā)現(xiàn)畜舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌占?xì)廨d需氧菌總數(shù)的0.02%～5.20%，未分離出厭氧革蘭氏陰性菌；并指出革蘭氏陰性菌中主要包括腸桿菌、假單胞菌及奈瑟氏菌，腸桿菌中以大腸桿菌和成團(tuán)腸桿菌為主，空氣濕度大的地方假單胞菌的含量也非常高。本研究對(duì)3個(gè)不同結(jié)構(gòu)和飼養(yǎng)方式下的兔場(chǎng)兔舍中氣載需氧、厭氧革蘭氏陰性活菌的含量進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)微生物氣溶膠中革蘭氏陰性菌菌群組成進(jìn)行了檢測(cè)，以期為相關(guān)疫病的預(yù)防和監(jiān)控提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 兔舍情況

實(shí)驗(yàn)兔場(chǎng)有兩個(gè)開(kāi)放式兔舍（A、B）和一個(gè)封閉式兔舍（C）。開(kāi)放式兔舍為雙列3層式，兔舍長(zhǎng)15m，寬4m，高3m；封閉式兔舍長(zhǎng)6m，寬4m，高3m，采用空調(diào)控溫。舍內(nèi)外溫濕度、風(fēng)速在采樣時(shí)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，具體指標(biāo)見(jiàn)表1。

表1 3個(gè)兔舍物理指標(biāo)

1.2 方法

1.2.1 氣載需氧菌和革蘭氏陰性菌樣本的采集 采用2臺(tái)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)收集器ANDERSEN-6級(jí)撞擊式空氣微生物樣品收集器［6］，采集時(shí)標(biāo)準(zhǔn)流量28.3 L/min，分別選用5%的公綿羊血瓊脂和麥康凱3號(hào)培養(yǎng)基（Oxoid公司）為采樣介質(zhì)，收集器設(shè)置于兔舍中央，放置高度50～80 cm，驅(qū)動(dòng)時(shí)間根據(jù)不同衛(wèi)生條件掌握在1～5min，保證六節(jié)平皿上都能采到菌樣，菌落數(shù)以20～250CFU為宜。1.2.2氣載需氧菌濃度計(jì)算 采樣后血瓊脂平板置于恒溫箱37℃需氧培養(yǎng)24 h后，計(jì)算各瓊脂平板上的菌落數(shù)，經(jīng)ANDERSEN校正表校正后，根據(jù)通氣量得到每立方米空氣中的氣載需氧活菌含量。按公式①計(jì)算：

其中，Q1為六節(jié)平皿上菌落數(shù)量矯正后的總和；t為采樣時(shí)間（min）。

1.2.3 革蘭氏陰性菌濃度計(jì)算 用麥康凱3號(hào)培養(yǎng)基采集的樣本一部分在37℃條件下培養(yǎng)24 h，另一部分放入YQX型厭氧培養(yǎng)箱中，40℃厭氧培養(yǎng)24 h，其厭氧環(huán)境為N288%、H27%、CO25%。所有的紅色菌落經(jīng)過(guò)革蘭氏染色和“KOH反應(yīng)”試驗(yàn)鑒定。計(jì)算各平板上的革蘭氏陰性菌菌落數(shù)，ANDERSEN采集的樣本經(jīng)ANDERSEN校正表校正后，根據(jù)通氣量得到每平方米空氣中的氣載革蘭氏陰性活菌。按公式①計(jì)算。

1.2.4 革蘭氏陰性菌菌群的鑒定方法

1.2.4.1 需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性菌的鑒定 將分離得到的純菌種分別接種O-F生化管和氧化酶試紙，按照標(biāo)準(zhǔn)操作方法進(jìn)行，再根據(jù)結(jié)果進(jìn)行初步分離。O-F試驗(yàn)氧化（F）且氧化酶陽(yáng)性（+）的菌株采用API-20E（Bio Merieux，Marcy-I’Etoile，F(xiàn)rance）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，其他菌株采用API-20NE實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。操作及結(jié)果判讀按試劑盒說(shuō)明完成。

1.2.4.2 專性厭氧革蘭氏陰性菌的鑒定 由于本次實(shí)驗(yàn)分離到的菌株大多數(shù)為兼性厭氧革蘭氏陰性菌，未分離到專性厭氧革蘭氏陰性菌，故未進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 氣載需氧菌和氣載革蘭氏陰性菌含量

經(jīng)過(guò)檢測(cè)，3個(gè)兔舍內(nèi)氣載需氧菌含量在0.78×103～20.1×103CFU/m3之間，總氣載革蘭氏陰性菌含量在29～58CFU/m3之間，占需氧菌總數(shù)的2.12%～10.20%。兔舍C內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌含量最高，兔舍B內(nèi)含量最低（見(jiàn)表2）?？晌氲臍廨d革蘭氏陰性菌含量在19～35CFU/m3之間，兔舍C內(nèi)含量最高，兔舍B內(nèi)含量最低（見(jiàn)表2）。而且，每一個(gè)兔舍內(nèi)氣載需氧菌和革蘭氏陰性菌含量差異均不顯著（P＞0.05）?？晌氲臍廨d革蘭氏陰性菌含量占總氣載革蘭氏陰性菌含量的比例在62.7%～65.1%之間，而且3個(gè)兔舍之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表2 3個(gè)兔舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌含量

2.2 氣載革蘭氏陰性菌菌群組成

經(jīng)過(guò)對(duì)3個(gè)兔舍環(huán)境中氣載革蘭氏陰性菌成分分析，結(jié)果表明，兔舍環(huán)境中腸桿菌科細(xì)菌是革蘭氏陰性菌的主要組分（表3），分別占革蘭氏陰性菌含量的64.3%（兔舍A）、84.2%（兔舍B）和72.3%（兔舍C）；其次是假單胞菌、奈瑟氏菌和巴氏桿菌。而在腸桿菌科中大腸桿菌是主要菌群（表4），分別占腸桿菌科細(xì)菌含量的90.5%（兔舍A）、92.5%（兔舍B）和87.6%（兔舍C）。

表3 3個(gè)兔舍舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌菌群分析%

表4 3個(gè)兔舍舍內(nèi)氣載腸桿菌科中各成分分析%

3 討論

3.1 兔舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌的空氣動(dòng)力學(xué)分析

細(xì)菌在ANDERSEN-6空氣微生物采樣器1～6層級(jí)上（總的）分布的統(tǒng)計(jì)采用平均值的統(tǒng)計(jì)方法。因?yàn)椴煌Y(jié)構(gòu)、不同飼養(yǎng)方式的兔舍細(xì)菌含量差異較大，采用平均數(shù)能較好地反映數(shù)值分布。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，可吸入的氣載革蘭氏陰性菌含量占總氣載革蘭氏陰性菌含量的比例在62.7%～65.1%之間，這些顆粒的空氣動(dòng)力學(xué)直徑（Dae50）一般在5.4μm以下，能在空氣中做BROWN運(yùn)動(dòng)，停留時(shí)間長(zhǎng)，可進(jìn)入人畜的氣管、支氣管、細(xì)支氣管甚至肺泡，在環(huán)境條件或飼養(yǎng)因素改變和動(dòng)物體抵抗力下降時(shí)，容易造成下呼吸道感染，對(duì)人及動(dòng)物健康構(gòu)成威脅。

3.2 兔舍氣載革蘭氏陰性菌和氣載需氧菌濃度

本實(shí)驗(yàn)測(cè)得兔舍內(nèi)氣載需氧革蘭氏陰性活菌含量介于0.39×102～10.30×102CFU/m3之間，未檢測(cè)出厭氧革蘭氏陰性菌，說(shuō)明進(jìn)入空氣中厭氧革蘭氏陰性菌均未能形成芽孢，很快死亡。氣載需氧菌活菌含量介于0.78× 103～20.10×103CFU/m3之間。氣載革蘭氏陰性活菌占?xì)廨d需氧菌活菌總數(shù)的2.12%～10.20%。WIEGAND-B等［7］測(cè)定肉雞舍空氣塵埃中的細(xì)菌總數(shù)為2.1×109CFU/g，相當(dāng)于7.7×106CFU/m3空氣；Dutkiewicz-J等［8］測(cè)定豬舍、牛舍、馬舍中嗜溫菌含量分別在568.7×103～1 408.7×103CFU/m3、43.9×103～280.5×103CFU/m3、26.2×103～150.1×103CFU/m3之間；Zucker-BA等［9］測(cè)定牛舍中的需氧細(xì)菌含量和需氧革蘭氏陰性細(xì)菌含量分別為6.96×103～1.06×105CFU/m3和7.20×100～5.05×102CFU/m3空氣。本次實(shí)驗(yàn)在兔舍中測(cè)得的細(xì)菌總數(shù)與其他動(dòng)物舍比較相對(duì)較低，這可能與家兔本身的生活習(xí)性和飼養(yǎng)方式（開(kāi)放式或半開(kāi)放式、籠養(yǎng)、顆粒料等）有直接關(guān)系。

3.3 兔舍環(huán)境革蘭氏陰性菌菌群分析

在所測(cè)量的3個(gè)兔舍環(huán)境中，革蘭氏陰性菌中以腸桿菌科細(xì)菌為主，而且在腸桿菌中又以大腸桿菌占大多數(shù)（表4），類似的結(jié)果以往的研究者也在豬舍和禽舍環(huán)境中檢測(cè)到［5］。在奈瑟氏菌科中以黏液奈瑟氏菌最為常見(jiàn)（在兔舍A中占80.0%，在兔舍B中占57.1%，在兔舍C中占55.6%）。奈瑟氏菌科中有多種奈瑟氏菌（如年液奈瑟氏菌）可以在溫血?jiǎng)游锖腿说酿つぬ幑采?，特別是在鼻咽部及其結(jié)合處［10-11］。在兔舍環(huán)境中檢測(cè)到很多假單胞菌科細(xì)菌，其中包括常見(jiàn)的銅綠假單胞菌，在以往的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)此菌是引起人及動(dòng)物傷口感染的主要菌［12-13］。另外，在其中的兩個(gè)兔舍環(huán)境中（兔舍A和C）還檢測(cè)到巴氏桿菌（表3），并且以多殺巴斯德氏菌為主，兔舍A中76.5%為多殺巴斯德氏菌，兔舍C中多殺巴斯德氏菌占84.5%，這與Kawamoto等［14］在日本報(bào)道的結(jié)果基本一致。多殺巴斯德氏菌是常見(jiàn)的呼吸道致病菌，通常巴斯德氏菌病與兔的上呼吸道疾?。ㄒ员茄?、膿性鼻液為主要癥狀）并發(fā)，有時(shí)還伴有結(jié)膜炎、肺炎、潰瘍、生殖器感染及敗血癥等［15-16］。在調(diào)查過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)兔舍A和C中有些兔有鼻炎癥狀，而在兔舍B內(nèi)未發(fā)現(xiàn)，與檢測(cè)結(jié)果相一致。

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Detection on Airborne Gram-negative Bacterial Flora in Rabbitries

Duan Huiyong
（DepartmentofBiotechnology Engineeringof Taishan Polytechnic，Tai’an 271000，Shandong,China）

The concentration ofairborne aerobic bacteria，airborneaerobic gram-negativebacteriaand the species composition of the airborne gram-negative bacterial flora in 3 rabbitriesweremeasured using 5%buck blood-blood agar and MacConkey agar No.3（Oxoid）with Andersen-6 sampler.The resultsshowed that thenumberof totalairborne aerobic bacteriawasbetween 780 to 20 100CFU/m3，the number ofairborne aerobic gram-negative bacteria between 39 to 1 030 CFU/m3，the species composition of the airborne gram-negative bacterial flora included Enterobacteriaceae，Neisseriaceae，Pasteurellaceae and Pseudomonadaceae. Most of gram-negative Enterobacteriaceae isolated was E.coli.Besides，in two rabbit houses，Pasteurella multocida，themost common respiratory pathogen of rabbits，was isolated.

rabbithouse；airbornegram-negativebacteria；bioaerosol

S852.61

A

2095-3887（2017）04-0034-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.04.009

2017-04-12

段會(huì)勇（1975-），男，講師，博士，主要從事畜禽環(huán)境病原微生物的研究。