粒細胞集落刺激因子對心肌梗死大鼠心室肌電生理特性影響的離體實驗研究

羅濤 王永智 鄧旭波 史成龍 史文舉 浦奎

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·基礎研究·

粒細胞集落刺激因子對心肌梗死大鼠心室肌電生理特性影響的離體實驗研究

羅濤 王永智 鄧旭波 史成龍 史文舉 浦奎

目的 探討粒細胞集落刺激因子(G-CSF)對離體心肌梗死大鼠心室肌電生理特性的影響。方法 結(jié)扎左冠狀動脈建立心肌梗死模型，術后存活的67只Wistar大鼠被分為4組：Sham組、對照組、術后即刻給藥組(E-G組)和延遲給藥組(D-G組)，利用離體心臟灌流吸附電極記錄單相動作電位時程(MAP)，記錄有效不應期(ERP)、ERP和MAP90的離散度；常規(guī)電生理方法記錄竇性心動周期(SCL)、最大動作電位幅度(APA)、零相上升最大速度(Vmax)、心室顫動閾值(VFT)及心室顫動時程(VFD)。結(jié)果 心肌梗死后7 d，E-G組電生理參數(shù)(SCL、VFT、VFD、APA、ERP/MAP90、ERP和MAP90離散度)和D-G組電生理參數(shù)(SCL、ERP和MAP90離散度)較對照組均有明顯改善(均P<0.05)；心肌梗死后3個月，E-G組上述電生理參數(shù)較對照組延續(xù)改善(P<0.05)，但D-G組除了部分電生理參數(shù)(SCL、APA、Vmax和MAP90離散度)較對照組改善(P<0.05)外，其他電生理參數(shù)較對照組無明顯改善(P>0.05)，ERP和MAP90甚至有惡化趨勢。結(jié)論 G-CSF干預能夠改善缺血心室肌電生理參數(shù)，即刻干預較延遲干預改善更明顯，即刻干預電生理參數(shù)改善能夠延續(xù)到缺血心室肌慢性恢復期，降低心肌梗死后室性心律失常發(fā)生率。

粒細胞集落刺激因子； 心肌梗死； 單相動作電位時程； 離散度

治療學的發(fā)展如溶栓治療(thrombolysis)和經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)顯著提高了急性心肌梗死(myocardial infarction, MI)患者的存活率。但MI后室性心律失常的發(fā)生率仍非常高，主要原因為受損的心室肌組織不能通過細胞再生修復，只能由無收縮功能的瘢痕組織替代，并通過改變心室肌離子通道功能，導致心室肌細胞電生理特性的改變，促進心律失常的發(fā)生，即“致心律失常性重構”。

目前，應用干細胞治療MI成為了心血管領域的研究熱點。但直接將干細胞移植到MI患者體內(nèi)后，不可避免地發(fā)生心律失常，導致移植治療的失敗，可能的機制假說有：移植的干細胞本身具有潛在致心律失常特性，缺乏縫隙連接蛋白43(Connexin 43,Cx43)及解剖學紊亂形成的折返機制，局部微環(huán)境對干細胞的影響，自主神經(jīng)高度再分布及不均一支配等[1-2]。因此，干細胞的人工植入方法存在局限性，而經(jīng)細胞因子動員干細胞具有體內(nèi)動員、體內(nèi)歸巢、體內(nèi)分化等特點，具有良好的應用前景。

粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)是一種造血生長因子，能夠動員骨髓中多種干細胞至外周血調(diào)控細胞的增殖、分化及凋亡。目前研究發(fā)現(xiàn)G-CSF在MI后“機械重構”和“電重構”中的不同作用機制：通過動員并募集骨髓干細胞到局部心肌組織發(fā)揮轉(zhuǎn)分化或旁分泌效應；通過骨髓干細胞以外的其他途徑發(fā)揮效應，如與心肌細胞上的G-CSF受體(G-CSF receptor，G-CSFR)結(jié)合，通過激活下游Jak2-Stat3信號通路發(fā)揮作用，以及其他未知的途徑[3]。

離體心臟灌流的電生理方法，可以在去除自主神經(jīng)體液等影響下，單獨觀察藥物、壓力作用對心臟的作用。本研究應用該技術研究MI大鼠離體心臟的整體電生理現(xiàn)象，初步探討G-CSF能否通過影響缺血心室肌電生理特性，進而降低室性心律失常發(fā)生率。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及存活情況

雄性Wistar大鼠，8～10周齡，體重220～250 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。飼養(yǎng)條件：室溫18～25℃，相對濕度45%～65%，正常飼料喂養(yǎng)，自由飲水。將大鼠隨機分組建立假手術(Sham)模型和MI模型，建立MI模型的大鼠根據(jù)給藥方案不同分為對照組(Control，僅給予生理鹽水)和G-CSF治療組(G組)。在G組中又根據(jù)給藥時間的不同分為2個亞組：MI后1 h即刻給藥為即刻給藥組(Early-G，E-G組)和MI后24 h給藥為延遲給藥組(Delay-G，D-G組)。分別于術后7 d和3個月時結(jié)束實驗觀察，利用Working Heart離體灌流系統(tǒng)和MP150 16導電生理記錄儀進行離體心臟的電生理實驗。

實驗中共有80只大鼠成功接受左冠狀動脈結(jié)扎手術，觀察期間有13只大鼠死亡，最后納入實驗結(jié)果的為67只，其中22只大鼠為假手術組(無一死亡)，各組大鼠術后存活情況見表1。各實驗組存活大鼠均納入實驗。

本實驗中兩種藥物的劑量和給藥方式為：G-CSF，100 μg/(kg·d)，每日注射1次，連續(xù)5 d；E-G組第1天采用靜脈注射方式，以后連續(xù)4 d采用皮下注射方式；D-G組每天均采用皮下注射方式。

表1 大鼠術后存活情況

注：G-CSF，粒細胞集落刺激因子；E-G組，術后即刻給藥組; D-G組，延遲給藥組

1.2 動物MI模型的建立[4]

0.4%戊巴比妥鈉(20 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，腹部向上固定于手術臺上。胸部皮膚備皮后消毒，于胸骨左緣1～2 mm處行2 cm縱行切口，以止血鉗分離皮下組織，鈍性撕裂胸大肌，暴露出左側(cè)肋骨。接上小動物呼吸機，調(diào)節(jié)呼吸機參數(shù)(頻率114次/min，呼吸時比1∶1.5)后開機，可見動物胸部隨呼吸機頻率起伏，并伴有動物的自主呼吸。以組織鉗于胸骨左緣1～2 mm處剪斷第4肋骨，以止血鉗擴張間隙后，縱隔及左側(cè)胸腔即可暴露，可見跳動的心臟，擠壓右側(cè)胸壁，并以止血鉗協(xié)助擴張胸壁創(chuàng)口，將心臟擠出胸腔。于肺動脈圓錐和右心耳交界處，主動脈起始部2～3 mm處，將縫合針(3/8弧度，3×6規(guī)格)自左心室側(cè)穿入，由肺動脈圓錐處穿出，連同一小束心肌結(jié)扎縫合線。結(jié)扎成功后立刻可見左心室前壁蒼白、運動減弱。同時可見到心電生理記錄儀(MP150)I導聯(lián)出現(xiàn)ST段抬高和室性心律失常。如未見到上述改變，則于原處再縫合一針并予以結(jié)扎。

結(jié)扎大鼠左側(cè)冠狀動脈后，心電圖顯示ST段抬高，逐漸出現(xiàn)ST-T動態(tài)演變和缺血性心律失常[如室性早搏二聯(lián)律、短陣室性心動過速(室速)、心室顫動(室顫)轉(zhuǎn)復等](圖1)。同時出現(xiàn)ST段動態(tài)演變和缺血性心律失常的大鼠被認定為MI模型成功，納入實驗。

MI大鼠模型建立的注意事項：(1)動物麻醉不宜過深，因戊巴比妥鈉有呼吸抑制作用，開胸后可能會造成氣胸，導致術后大鼠恢復自主呼吸時間較長，甚至不能恢復；(2)肌注青霉素(20×104U/kg)，放回鼠籠；(3)氣管插管時盡量靠上，否則極容易插入食管，插管后一定要檢驗是否在氣管內(nèi)；(4)嚴密監(jiān)測大鼠心電圖，確保建模成功以及出現(xiàn)惡性室性心律失常時及時搶救；(5)縫合胸壁時要盡量擠出胸腔內(nèi)血液；(6)術后環(huán)境要舒適，尤其是冬天要保持室內(nèi)溫度在18～25℃。

圖1 大鼠心肌梗死模型制作過程中心電圖的動態(tài)演變 A：正常心電圖；B：結(jié)扎左冠狀動脈后ST段逐漸抬高；C：結(jié)扎冠狀動脈后出現(xiàn)缺血性心律失常，圖為室性早搏二聯(lián)律并短陣室速；D：短陣室速轉(zhuǎn)為室性早搏二聯(lián)律

1.3 試劑與溶液

K-H(Krebs-Henseleit)灌流液成分 (mmol/L)：NaCl 119 mmol/L, KCl 4.8 mmol/L, MgCl21.2 mmol/L, KH2PO4(2H2O) 1.2 mmol/L, CaCl22.5 mmol/L, NaHCO324.9 mmol/L, D-glucose 10 mmol/L (pH使用HCl調(diào)至7.3～7.4)。

1.4 電生理指標的測定

將模型大鼠開胸放置于4℃ K-H液中，經(jīng)初步修剪后，將模型心臟主動脈固定于Working Heart灌流系統(tǒng)灌流管頭端，開始以37℃經(jīng)95%氧氣和5%二氧化碳混合氣飽和的K-H液逆向灌流，此時心臟重新開始跳動。約經(jīng)20 min心臟跳動穩(wěn)定后，分別在兩側(cè)心室刺入兩對電極，分別用于電刺激和記錄。單相動作電位的記錄方法為：使用直徑0.4 mm銀絲，稍加壓力與心室外膜接觸[5]。參考電極通過對照浸泡過的海綿間接接觸心外膜，左心室接觸部位為梗死邊緣區(qū)，右心室接觸部位為遠離梗死區(qū)。數(shù)據(jù)使用Biopac MP150多導電生理記錄儀記錄。

1.5 測定的指標和方法

測量竇性心動周期(sinus cycle length, SCL)，測定起搏閾值，然后以脈寬2 ms，起搏電壓為2倍起搏閾值進行左心室遞減起搏刺激，采用S1S2刺激法測量心室有效不應期(effective refractory period, ERP)：S1S2間期以5 ms時距遞減，負向掃描至不能引起心室去極化。心室ERP定義為不能引起除極的最長S1S2間期。計算心室ERP離散度：左心室ERP與右心室ERP的差值，即LERP-RERP[6]。

測量心室肌外膜單相動作電位時程(monophasic action potential duration, MAP)：MAP20、MAP50和MAP90，分別為零相除極化起始至復極化達20%、50%、90%振幅的水平距離，測量動作電位最大振幅(action potential amplitude, APA)；計算心室MAP90離散度：左心室MAP90與右心室MAP90的差值，即LMAP90-RMAP90[6]。

在左心室(電極固定于梗死周邊部位)測定心室ERP完畢后發(fā)放Burst刺激(起搏周長為50 ms)誘發(fā)室速，共發(fā)放5次，每次持續(xù)1 s，間隔30 s。室速定義為在S1S2或Burst刺激后心電圖出現(xiàn)快速心室激動，體表心電圖表現(xiàn)為寬大QRS波。室速持續(xù)時間大于1 min定義為持續(xù)性室速，應用Burst刺激(起搏周長為50 ms)終止，記錄每只模型大鼠室速的發(fā)生次數(shù)和持續(xù)時間[7]。

待模型大鼠室速相關參數(shù)記錄完畢、心臟穩(wěn)定20 min后，發(fā)放頻率為25 Hz的矩形脈沖，起搏周長為8 ms，刺激時程為500 ms，電流強度以0.1 mA步進，直至誘發(fā)出室顫，記錄此時的室顫閾值及室顫持續(xù)時間，是否能自發(fā)終止或以室顫刺激程序終止[8]。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠MAP、ERP和ERP離散度比較情況(圖2)

MI后7 d，對照組左心室MAP20、MAP50、MAP90和ERP均較Sham組明顯延長(均P<0.05)；E-G組除MAP50外，MAP20、MAP90、ERP均較對照組顯著改善(均P<0.05)，MAP90和ERP恢復到Sham組水平(均P>0.05)；而D-G組MAP20、MAP50、MAP90和ERP較對照組均未見明顯改善(均P>0.05)。對照組右心室MAP20、MAP50、MAP90和ERP均較Sham組明顯延長(均P<0.05)；E-G組MAP20、MAP50、MAP90和ERP均較對照組有明顯改善(均P<0.05)，但除ERP外，均未恢復到Sham組水平(均P<0.05)；而D-G組MAP20、MAP50、MAP90和ERP較對照組均未見改善(均P>0.05)，甚至MAP20、MAP90和ERP有惡化趨勢。對照組ERP和MAP90離散度均較Sham組延長(均P<0.05)，E-G組和D-G組ERP和MAP90離散度較對照組均明顯改善(均P<0.05)。

MI后3個月，對照組左心室MAP20、MAP50、MAP90和ERP均較Sham組明顯延長(均P<0.05)；E-G組MAP90和ERP均較對照組有明顯改善(均P<0.05)；D-G組MAP20、MAP50、MAP90和ERP較對照組均未見明顯改善(均P>0.05)。對照組右心室MAP20、MAP50、MAP90和ERP均較Sham組明顯延長(均P<0.05)；E-G組MAP20、MAP50、MAP90和ERP均較對照組有明顯改善(均P<0.05)，但除MAP90外，均未恢復到Sham組水平(均P<0.05)；D-G組MAP20、MAP50、MAP90和ERP較對照組均未見改善(均P>0.05)，甚至MAP90和ERP有惡化趨勢。對照組MAP90和ERP離散度均較Sham組延長(均P<0.05)，E-G組MAP90和ERP離散度均較對照組有明顯改善(均P<0.05)，D-G組MAP90離散度較對照組有明顯改善(P<0.05)。

2.2 各組大鼠SCL、VFT和VFD情況比較(圖3)

MI后7 d，對照組SCL較Sham組明顯縮短(P<0.05)，E-G組和D-G組SCL較對照組均明顯改善(均P<0.05)，但均未恢復到Sham組水平(均P<0.05)；對照組VFT較Sham組明顯減小(P<0.05)，E-G組較對照組VFT明顯升高(P<0.05)，但未恢復到Sham組水平(P<0.05)，D-G組VFT較對照組改善不明顯(P>0.05)；對照組VFD較Sham組明顯延長(P<0.05)，E-G組較對照組VFD明顯縮短(P<0.05)，并恢復到Sham組水平(P>0.05)；D-G組VFD較對照組改善不明顯(P>0.05)。

注：MAP，單相動作電位時程；ERP，有效不應期；MI，心肌梗死; E-G組，術后即刻給藥組; D-G組，延遲給藥組圖2 MAP、ERP和心室離散度各項指標比較 A：MI后7 d左心室MAP和ERP各項指標比較；B：MI后7 d右心室MAP和ERP各項指標比較；C：MI后3個月左心室MAP和ERP各項指標比較；D：MI后3個月右心室MAP和ERP各項指標比較；E：MI后7 d MAP90和ERP離散度比較；F：MI后3個月MAP90和ERP離散度比較。a，兩組間比較，P<0.05

注：SCL，竇性心動周期；VFT，心室顫動閾值；VFD，心室顫動時程; MI, 心肌梗死；E-G組，術后即刻給藥組; D-G組，延遲給藥組圖3 各組大鼠SCL、VFT和VFD比較 A：MI后7 d各組SCL比較；B：MI后3個月各組SCL比較；C：MI后7 d各組VFT比較；D：MI后3個月各組VFT比較；E：MI后7 d各組VFD比較；F：MI后3個月各組VFD比較；a，兩組間比較，P<0.05

MI后3個月，對照組SCL較Sham明顯縮短(P<0.05)，E-G組和D-G組SCL較對照組均明顯改善(均P<0.05)，D-G組SCL接近恢復到Sham組水平(P>0.05)；對照組VFT較Sham組明顯減小(P<0.05)，E-G組較對照組VFT明顯升高(P<0.05)，但未恢復到Sham組水平(P<0.05)，D-G組VFT較對照組改善不明顯(P>0.05)；對照組VFD較Sham組明顯延長(P<0.05)，E-G組和D-G組VFD較對照組改善不明顯(P>0.05)，但E-G組VFD改善趨勢更好(P>0.05)。

2.3 各組大鼠其它電生理參數(shù)(APA、Vmax和ERP/MAP90)比較(表2～5)

MI后7 d，對照組左心室APA較Sham組降低(P<0.05)，E-G組APA較對照組有明顯改善(P<0.05)，而D-G組APA較對照組無明顯改善(P>0.05)；各組左心室Vmax均無明顯改變(均P>0.05)；對照組和D-G組左心室ERP/MAP90均較Sham組降低(均P<0.05)，E-G組ERP/MAP90較對照組改善(P<0.05)，D-G組ERP/MAP90較對照組無明顯改善(P>0.05)。各組之間右心室APA和Vmax均無明顯改變(均P>0.05)；右心室對照組ERP/MAP90較Sham組降低(P<0.05)，E-G組ERP/MAP90較對照組有改善趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，D-G組ERP/MAP90較對照組無明顯改善(P>0.05)。

MI后3個月，對照組左心室APA較Sham組降低(P<0.05)，E-G組和D-G組APA較對照組均有明顯改善(均P<0.05)，但D-G組APA未恢復到Sham組水平(P>0.05)；對照組左心室Vmax較Sham組均明顯降低(均P<0.05)，E-G組和D-G組Vmax較對照組明顯改善(P<0.05)；對照組和D-G組左心室ERP/MAP90較Sham組均降低(均P<0.05)，E-G組ERP/MAP90較對照組改善(P<0.05)，D-G組ERP/MAP90較對照組無明顯改善(P>0.05)；對照組右心室APA較Sham組降低(P<0.05)，E-G組APA較對照組無明顯改善(P>0.05)，D-G組APA較對照組改善(P<0.05)，但D-G組APA未恢復到Sham組水平(P>0.05)；對照組右心室Vmax較Sham組明顯降低(P<0.05)，E-G組和D-G組Vmax均較對照組改善(均P<0.05)；對照組右心室ERP/MAP90較Sham組降低(P<0.05)，E-G組ERP/MAP90較對照組改善(P<0.05)，D-G組ERP/MAP90較對照組無明顯改善(P>0.05)。

表2 各組大鼠心肌梗死后7 d 左心室電生理參數(shù)比較±s)

注：E-G組，術后即刻給藥組; D-G組，延遲給藥組; APA，最大動作電位幅度；Vmax，零相上升最大速度；ERP，有效不應期；MAP90，單相動作電位90%；a，與Sham組比較，P<0.05；b，與對照組比較，P<0.05；c，與E-G組比較，P<0.05

表3 各組大鼠心肌梗死后7 d右心室電生理參數(shù)比較±s)

注：E-G組，術后即刻給藥組; D-G組，延遲給藥組; APA，最大動作電位幅度；Vmax，零相上升最大速度；ERP，有效不應期；MAP90，單相動作電位時程90%；a，與Sham組比較，P<0.05；b，與對照組比較，P>0.05

表4 各組大鼠心肌梗死后3個月左心室電生理參數(shù)比較±s)

注：E-G組，術后即刻給藥組; D-G組，延遲給藥組; APA，最大動作電位幅度；Vmax，零相上升最大速度；ERP，有效不應期；MAP90，單相動作電位時程復極化90%；a，與Sham組比較，P<0.05；b，與對照組比較，P<0.05；c，與E-G組比較，P<0.05

表5 各組大鼠心肌梗死后3個月右心室電生理參數(shù)比較±s)

注：E-G組，術后即刻給藥組; D-G組，延遲給藥組; APA，最大動作電位幅度；Vmax，零相上升最大速度；ERP，有效不應期；MAP90，單相動作電位90%；a，與Sham組比較，P<0.05；b，與對照組比較，P<0.05；c，與E-G組比較，P<0.05

3 討論

冠狀動脈閉塞后1周至數(shù)月，非梗死區(qū)出現(xiàn)心肌肥厚，梗死邊緣區(qū)動作電位時程(action potential duration, APD)延長，動作電位上升支幅度和速率均下降，具體機制為：(1)梗死區(qū)細胞內(nèi)鈉電流同正常比無明顯改變，但梗死邊緣區(qū)鈉鉀泵功能下降及細胞內(nèi)鈉漏引起細胞內(nèi)鈉通道活性降低，因此動作電位上升支Vmax下降。(3)2個月梗死周邊心肌細胞中L型鈣離子通道電流(ICa.L)峰值顯著減少，ICa.L峰值電流密度減小是梗死瘢痕周邊區(qū)心肌細胞膜電容增加的結(jié)果。而電流-電壓(I-V)關系、電壓依賴性穩(wěn)態(tài)失活曲線及恢復曲線并無明顯改變[9]。應用鋇作為電流離子通過鈣通道，仍持續(xù)存在鈣通道電流密度下降及電流衰減加速，表明功能性鈣通道數(shù)量減少。梗死心肌細胞鈣失活曲線發(fā)生改變，向超極化方向移位，引起少量ICa.L內(nèi)流。ICa.L通道動力學改變可部分解釋梗死區(qū)總ICa.L電流密度減少，并使梗死心肌動作電位2相電壓及時程減小。肥厚梗死心肌細胞中再度出現(xiàn)T型鈣電流(該電流通常在心臟發(fā)育成熟后心室肌中消失，只保留在竇房結(jié)或房室結(jié)等起搏細胞中)。上述鈣通道動力學及功能變化可能使肥厚心肌細胞APD延長。(3)臨近梗死區(qū)的心內(nèi)膜下心肌細胞延遲整流鉀通道電流(Ik)密度顯著降低，而幅度無明顯改變。遠離梗死區(qū)的心肌細胞Ik尾電流及I-V關系曲線并無明顯改變，尾電流密度在正電位時減少，同時伴典型的強內(nèi)向整流；Ik尾電流的電壓依賴性激活移位到更正電位水平，但失活及激活曲線的斜率并無改變[10]。瞬時外向鉀通道電流(Ito)及Ik不同的密度比例能夠解釋心外膜及心內(nèi)膜心肌細胞APD的不同，容易因動作電位離散度增加而引起各向異質(zhì)性，進而導致折返性心律失常。(4)另有研究認為，梗死心肌邊緣區(qū)域心肌細胞復極化后不應態(tài)的離子機制同樣是鈉通道失活延遲恢復，但原因為梗死恢復過程中鈉離子通道電流(INa)的慢性改變而不是由于細胞外鉀水平的升高，這同急性MI期有差別[11]。因此，將治療靶點定位于梗死心肌邊緣區(qū)域心肌細胞復極化后不應態(tài)可能會減少梗死后心律失常的發(fā)生。最近有研究將KCNH2-G628S基因(延遲整流性鉀通道電流Ikr變異基因)轉(zhuǎn)染到已發(fā)生室性心動過速的豬梗死心肌邊緣區(qū)域，結(jié)果室性心動過速均消失，且無致心律失常性及其他不良反應，推測其機制可能為Ikr抑制平衡了INa的慢性改變，使復極化后不應態(tài)消失[12]。MI大鼠MAP20主要受Ito影響，MAP50主要為ICa.L和Ikr、延遲整流性鉀通道慢成分(Iks)綜合作用的結(jié)果，MAP90主要受內(nèi)向整流鉀通道電流(Ik1)的影響。本研究發(fā)現(xiàn)MI大鼠MAP時程延長，離散度增加，容易誘發(fā)室速和室顫，而即刻G-CSF干預較延遲G-CSF干預能顯著降低MI大鼠MAP90和ERP離散度、VFT和VFD，推測可能的機制為G-CSF可能通過影響相關離子電流而有效改善APD、早期后除極和延遲后除極。

目前，G-CSF應用于心肌缺血后治療已經(jīng)進入Ⅲ期臨床試驗階段[13-14]，但效果仍充滿爭議。有學者推測，實驗條件的不均一性可能是造成實驗結(jié)果分歧的重要原因，如G-CSF開始治療的時間窗、給藥劑量、觀察時間的差異和穩(wěn)定的梗死范圍均會影響到觀察的結(jié)果。因此，本研究通過建立大鼠MI模型，產(chǎn)生了穩(wěn)定的梗死范圍，觀察了G-CSF不同給藥方案對MI后心室肌整體電生理特性的影響，并將觀察時限延續(xù)到MI后3個月，系統(tǒng)評價了G-CSF的遠期效應。Harada等[15]指出G-CSF的作用具有時效性，隨著開始給藥時間的延遲，G-CSF對心臟的改善作用逐漸減弱。另外的研究也顯示，在MI后3個月G-CSF的這種療效已經(jīng)不存在，甚至心臟功能更加惡化[16]。本研究結(jié)果也證實上述觀點，即延遲干預組部分電生理指標較缺血狀態(tài)下未明顯改善，甚至有惡化趨勢，推測可能的機制為：(1)G-CSF在MI早期主要通過與G-CSFR結(jié)合激活下游信號通路發(fā)揮其急性心臟保護作用；(2)MI慢性恢復期，梗死周邊區(qū)交感神經(jīng)過度再分布促心律失常發(fā)生。Kuhlmann等[17]研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF與干細胞因子( stem cell factor，SCF) 聯(lián)合應用可以增加梗死心肌邊緣區(qū)域心肌細胞直徑、動脈生成及Cx43的表達，通過減少緩慢傳導導致的折返使室性心動過速發(fā)生率下降。Kuwabara等[18]研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF可以直接作用于心肌細胞表面的G-CSFR進而激活Wnt和Jak2信號通路，上調(diào)Cx43及磷酸化水平，通過募集β-catenin和cadherin蛋白保護心肌細胞之間縫隙連接功能。本研究組前期研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)G-CSF干預能夠減少室性心律失常發(fā)生率，但心功能惡化[19]。Kanlop等[20]研究發(fā)現(xiàn)與我們類似實驗結(jié)果，即G-CSF能夠改善缺血/再灌注梗死心肌電生理參數(shù)。但Lee等[21]發(fā)現(xiàn)G-CSF可以通過影響心臟交感神經(jīng)再分布促進心律失常發(fā)生。而Baldo等[22]發(fā)現(xiàn)G-CSF對缺血心肌電生理效應具有兩面性，一方面可以減少室性心律失常發(fā)生率，另一面不利于室顫的自主復律。綜合上述研究結(jié)果，G-CSF在對心肌缺血后心律失常的發(fā)生有利有弊，可能通過不同的機制影響心肌電生理參數(shù)。

本研究較為全面地驗證了G-CSF對離體MI大鼠心臟整體電生理特性的作用，表明G-CSF能夠改善離體梗死心室肌整體電生理參數(shù)，減少MI后室性心律失常的發(fā)生。目前自主神經(jīng)系統(tǒng)與免疫炎癥系統(tǒng)相互影響在心血管疾病中越來越受到重視，因此G-CSF通過“神經(jīng)-炎癥軸”調(diào)控室性心律失常發(fā)生的具體機制是將來研究的重點。

[1] Liu YW, Su CT, Yen CY, et al.Arrhythmogenesis: a roadblock to cardiac stem cell therapy. Curr Treat Options Cardiovasc Med, 2016, 18(10): 61.

[2] Goedel A, My I, Sinnecker D, et al. Perspectives and challenges of pluripotent stem cells in cardiac arrhythmia research. Curr Cardiol Rep, 2017, 19(3): 23.

[3] D′Amario D, Leone AM, Borovac JA, et al. Granulocyte colony-stimulating factor for the treatment of cardiovascular diseases: An update with a critical appraisal. Pharmacol Res, 2017，[Epub ahead of print].

[4] Zhou X, Li YM, Ji WJ, et al. Phenytoin can accelerate the healing process after experimental myocardial infarction? Int J Cardiol, 2006, 107(1): 21-29.

[5] Fabritz L, Kirchhof P, Franz MR, et al. Prolonged action potential durations, increased dispersion of repolarization, and polymorphic ventricular tachycardia in a mouse model of proarrhythmia. Basic Res Cardiol, 2003, 98(1): 25-32.

[6] 邢雁偉，王碩仁，王潤桃. 心梗大鼠離體心臟的動作電位和不應期電生理研究. 中國實驗動物學報，2005, 13(2)：101-105.

[7] Nguyen T, El Salibi E, Rouleau JL. Postinfarction survival and inducibility of ventricular arrhythmias in the spontaneously hypertensive rat: effects of ramipril and hydralazine. Circulation, 1998, 98(19): 2074-2080.

[8] Yumoto A, Fukushima Kusano K, Nakamura K, et al. Hepatocyte growth factor gene therapy reduces ventricular arrhythmia in animal models of myocardial ischemia. Acta Med Okayama, 2005, 59(3): 73-78.

[9] Litwin SE, BridgeJH. Enhanced Na(+)-Ca2+exchange in the infarcted heart. Implications for excitation-contraction coupling. Circ Res, 1997, 81(6): 1083-1093.

[10] Yuan F,PintoJM,Li Q, et al. Characteristics of I(K) and its response to quinidine in experimental healed myocardial infarction. J Cardiovasc Electrophysiol, 1999, 10(6): 844-854.

[11] Pu J, Boyden PA, Alterations of Na+ currents in myocytes from epicardial border zone of the infarcted heart. A possible ionic mechanism for reduced excitability and postrepolarization refractoriness. Circ Res, 1997, 81(1): 110-119.

[12] Sasano T,McDonald AD, Kikuchi K, et al. Molecular ablation of ventricular tachycardia after myocardial infarction. Nat Med, 2006, 12(11): 1256-1258.

[13] Achilli F, Malafronte C, Cesana F, et al. Granulocyte-colony stimulating factor for large anterior ST-elevation myocardial infarction: rationale and design of the prospective randomized phase III STEM-AMI OUTCOME trial. Am Heart J, 2015, 170(4): 652-658.

[14] Steppich B, Hadamitzky M, Ibrahim T, et al. Stem cell mobilisation by granulocyte-colony stimulating factor in patients with acute myocardial infarction. Long-term results of the REVIVAL-2 trial. Thromb Haemost, 2016, 115(4): 864-868.

[15] Harada M, Qin Y, Takano H, et al. G-CSF prevents cardiac remodeling after myocardial infarction by activating the Jak-Stat pathway in cardiomyocytes. Nat Med, 2005, 11(3): 305-311.

[16] Cheng Z, Ou L, Liu Y, et al. Granulocyte colony-stimulating factor exacerbates cardiac fibrosis after myocardial infarction in a rat model of permanent occlusion. Cardiovasc Res, 2008, 80(3): 425-434.

[17] Kuhlmann MT, Kirchhof P, Klocke R, et al. G-CSF/SCF reduces inducible arrhythmias in the infarcted heart potentially via increased connexin43 expression and arteriogenesis. J Exp Med, 2006, 203(1): 87-97.

[18] Kuwabara M, Kakinuma Y, Katare RG, et al. Granulocyte colony-stimulating factor activates Wnt signal to sustain gap junction function through recruitment of beta-catenin and cadherin. FEBS Lett, 2007, 581(25): 4821-4830.

[19] Liu HM, Luo T, Zhou X, et al. Disassociation between left ventricular mechanical and electrical properties in ischemic rat heart after G-CSF treatment. Cardiovasc Drugs Ther, 2011, 25(3): 203-214.

[20] Kanlop N, Thommasorn S, Palee S, et al. Granulocyte colony-stimulating factor stabilizes cardiac electrophysiology and decreases infarct size during cardiac ischaemic/reperfusion in swine. Acta Physiol (Oxf), 2011, 202(1): 11-20.

[21] Lee TM, Chen CC, Chang NC. Granulocyte colony-stimulating factor increases sympathetic reinnervation and the arrhythmogenic response to programmed electrical stimulation after myocardial infarction in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2009, 297(2): H512-H522.

[22] Baldo MP, Rodrigues SL, Mill JG. Acute effects of granulocyte colony-stimulating factor on early ventricular arrhythmias after coronary occlusion in rats. J Pharmacol Pharmacother, 2012, 3(1): 39-42.

Effects of granulocyte colony-stimulating factor on electrophysiological properties of post-infarct ventricles in ex vivo rat hearts

LUOTao,WANGYong-zhi,DENGXu-bo,SHICheng-long,SHIWen-ju,PUKui．

DepartmentofCardiology,DepartmentofMedicalServices,ChinesePLANo.254hospital,Tianjin300142,China

Correspondingauthor:PUKui,Email:tluo.cardiolab@live.com

Objective To observe the effects of granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) on electrophysiological properties of post-infarct ventricles. Methods Sixty-seven survival Wistar rats were divided into 4 groups: Sham group, Control group, MI early G-CSF group (E-G) and MI delay G-CSF group (D-G) after ligation of the left coronary artery as myocardial infarction model. Monophasic action potential(MAP) was recorded by absorption electrode in ex vivo perfused rat hearts.Effective refractive period( ERP),sinus cardiac length( SCL), action potential amplitude( APA), maximal depolariged(Vmax), ventricular fibrillation threshold(VFT) and ventricular fibrillation duration(VFD) were measured. Results The electrophysiological parameters (SCL,VFT,VFD,APA,ERP/MAP90,dispersion of ERP and MAP90) of the E-G group were improved significantly (allP<0.05) at day 7 post MI.Improvement in SCL,dispersion of ERP and MAP 90 were found in the D-G group as well at day 7 post MI(allP<0.05). Substained improvement in electrophysiological parameters were found in the E-G group at 3 months after MI(P<0.05). Besides SCL, APA, Vmax and dispersion of MAP90,all other parameters in the D-G group were similar to that of the control group with no statistical significance and even had a tendency of deterioration in ERP and MAP90 3 months after MI.Conclusion G-CSF intervention could improve electrophysiological properties of ischemic ventricles. Early G-CSF intervention showed better outcomes compared to delay G-CSF intervention on electrical remodeling ischemia myocardiumwhich may have effect on reducing the development of ventricular arrhythmia.

Granulocyte colony stimulating factor； Myocardial infarction； Monophasic action potential duration； Dispersion

10.3969/j.issn.1004-8812.2017.07.006

300142 天津，解放軍第254醫(yī)院心血管內(nèi)科(羅濤、王永智、鄧旭波、史成龍、浦奎)，醫(yī)務處(史文舉)

浦奎，Email：tluo.cardiolab@live.com

R542.22

2017-05-03)