參附注射液對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用

易 凡 尚玉強 李 炳 程 龍 夏家紅

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院心臟大血管外科，湖北 武漢 430014)

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參附注射液對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用

易 凡 尚玉強 李 炳 程 龍 夏家紅

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院心臟大血管外科，湖北 武漢 430014)

目的 探討參附注射液(SFI)對心肌缺血再灌注損傷(MIRI)模型大鼠的保護作用。方法 60只健康SD大鼠隨機均分為假手術(shù)組，缺血再灌注模型組以及SFI處理低、中、高劑量組(分別5、10、20 ml/kg)。建立大鼠MIRI模型，記錄心電圖中T波及S-T段電壓變化，測定各組肌酸激酶(CK)、CK同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9的活性和腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6的濃度，并觀察心肌組織病理學(xué)改變，分析SFI對MIRI的保護作用。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組心電圖中的ST段和T波均出現(xiàn)了不同程度的偏移，且心室臟器系數(shù)、心肌梗死區(qū)重量以及梗死百分比增大(P<0.05)；SFI處理后，心電圖中的ST段和T波偏移較小，心室臟器系數(shù)、心肌梗死區(qū)的重量和百分比明顯降低，且高劑量組改善最明顯(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌酶譜CK-MB、CK、LDH、MMP-9活性及TNF-α、IL-6濃度明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，給藥后SFI處理組以上指標均明顯下降，且隨著劑量增加下降越明顯(P<0.05)。結(jié)論 SFI對大鼠MIRI有明顯的保護作用，可能與改善CK-MB、CK、LDH、MMP-9活性及TNF-α、IL-6濃度有關(guān)，且使用高劑量的SFI對大鼠MIRI保護作用更顯著。

參附注射液；心肌缺血再灌注損傷

目前認為，炎性因子的作用、自由基大量產(chǎn)生、微血管內(nèi)皮損傷等原因為心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的主要產(chǎn)生機制〔1〕。在MIRI的病理生理過程中，血漿中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1、IL-6的濃度會升高，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9活性增加并會導(dǎo)致缺血再灌注損傷。研究表明，藥物處理可明顯減輕心臟、肝臟等缺血再灌注損傷，而中藥對缺血再灌注損傷有良好的治療效果，應(yīng)用前景好〔2〕。參附注射液(SFI)由紅參、黑附片的提取物組成，主要活性物質(zhì)是人參皂苷和烏頭堿，并有氨基酸、糖類和無機離子，其中人參皂苷已被證實是SFI減輕MIRI癥狀的活性物質(zhì)〔3〕。本研究旨在探究SFI對MIRI的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康SD大鼠60只，雌雄各半，體重245～350 g，由武漢大學(xué)動物實驗中心提供〔合格號：SYXK(鄂)2015-0058〕。按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組，缺血再灌注模型組以及SFI處理低、中、高劑量實驗組，每組12只。

1.2 實驗藥物及試劑 SFI：四川雅安三九藥業(yè)有限公司，規(guī)格10 ml/支，批號：0064277。肌酸激酶(CK)、CK同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑：四川邁克試劑有限公司。TNF-α、IL-6試劑：美國R&D公司。MMP-9試劑：上?？道噬锟萍及l(fā)展有限公司(美國TSZ公司原裝進口)。

1.3 動物模型及實驗 經(jīng)腹腔注射20%烏拉坦5 ml/kg麻醉后行氣管切開術(shù)并行氣管插管、人工輔助呼吸。記錄正常Ⅱ?qū)?lián)心電圖(ECG)。在大鼠胸骨旁左側(cè)第四肋骨行開胸術(shù)，假手術(shù)組大鼠的左冠狀動脈前降支只穿線，而不結(jié)扎，結(jié)扎模型組、SFI處理組大鼠的左冠狀動脈前降支15 min結(jié)扎建模成功標志為心電圖ST段抬高0.1 mV或T波高聳，心肌呈暗紅色。建立MIRI模型后，由假手術(shù)組和模型組組成的對照組給予靜脈注射10 ml/kg生理鹽水，分別經(jīng)尾靜脈向SFI處理低、中、高劑量組推注SFI 5、10、20 ml/kg。

1.4 觀察指標

1.4.1 ST段和T波的偏移和變化 記錄給藥后0.5、1、2 h時間點的ECG，測定ECG之T波及S-T段電壓，并計算變化值。

1.4.2 血清指標檢測 灌注2 h后，用1%肝素抗凝試管經(jīng)右頸動脈采血9 ml，并分3份，經(jīng)2 500 r/min離心10 min分離血清，根據(jù)試劑盒說明對血清CK、CK-MB、LDH的活性進行測定。按試劑盒說明測定血清TNI-α、IL-6的濃度，用即酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定MMP-9的活性。

1.4.3 心肌梗死病理學(xué)參數(shù)變化 將大鼠處死后，取大鼠心臟，用生理鹽水洗凈，將大鼠的心房組織及脂肪去掉，再稱重、記錄大鼠的心室重量、梗死區(qū)重量，計算臟器系數(shù)。心肌連續(xù)切7～8片，每片厚2 mm，用2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色后，計算大鼠心肌梗死面積及梗死百分比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS14.0軟件進行重復(fù)測量與設(shè)計分析及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組MIRI大鼠ST段和T波的偏移和變化 與假手術(shù)組比較，結(jié)扎后模型組與SFI處理組ECG中的ST段和T波均有大幅的偏移(P<0.05)。SFI處理組給藥后，與模型組比較，ECG中的ST段和T波偏移相對較小，其中SFI處理高劑量組在給藥0.5、1、2 h后ECG ST段和T波的偏移幅度明顯減小，SFI處理中劑量組在給藥1 h后ECG ST段的偏移幅度減小(P<0.05)。見表1。

2.2 各組心肌梗死參數(shù)變化 與假手術(shù)組相比，模型組及SFI劑量組各項心肌梗參數(shù)變大(P<0.05)。與模型組相比，給藥后的SFI中、高劑量組各項心肌梗死參數(shù)減小(P<0.05)。見表2。

2.3 各組血清CK-MB、CK、LDH活性的變化 與假手術(shù)組相比，結(jié)扎后模型組與SFI處理組血清CK-MB、CK、 LDH活性升高(P<0.05)。與模型組相比，給藥后SFI處理組均有一定程度的降低，且隨著劑量的增加血清CK-MB、CK、LDH下降更明顯(P<0.05)，見表3。

2.4 各組血漿TNF-α、IL-6濃度及MMP-9活性的變化 與假手術(shù)組相比，模型組及SFI處理組TNI-α、IL-6濃度及MMP-9活性升高(P<0.05)。與模型組相比，SFI處理組均顯著降低，且隨著劑量增加下降越明顯(P<0.05)。見表3。

表1 各組MIRI大鼠ST段和T波的偏移和變化

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；表2同

表2 各組心肌梗死參數(shù)變化

表3 各組血清CK-MB、CK、LDH活性及血漿TNF-α、IL-6濃度、MMP-9活性的變化

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與SFI低劑量組比較：3)P<0.05；與SFI中劑量組比較：4)P<0.05

3 討 論

MIRI的結(jié)果常常表現(xiàn)為心律失常、血液黏滯度增加、心肌梗死面積增大或程度加深?？刂艵CG中ST段和T波的偏移、改善營養(yǎng)性心肌血流量等已成為保護MIRI的保護機制之一〔4〕。本研究結(jié)果說明MIRI會出現(xiàn)心律失常、心肌梗死等癥狀，也表明建模的成功。并且證明MIRI大鼠的心肌缺血狀態(tài)是能夠被SFI改善的。心肌酶譜中酶學(xué)指標水平常常被臨床醫(yī)師用來評估心肌細胞的損傷程度，能夠客觀地反映心肌壞死量，心肌酶譜活性的降低成為對心肌細胞起保護作用的指標之一。心肌酶譜被臨床廣泛應(yīng)用于檢驗心肌梗死、心肌損傷程度，在對MIRI的研究中，CK及CK-MB、LDH等心肌酶譜應(yīng)用最多〔5〕。血清中CK、CK-MB和LDH主要通過心肌細胞獲得。當心肌缺血再灌注時，心肌細胞損傷嚴重，甚至壞死、破裂〔6〕。大量的CK、CK-MB和LDH被心肌細胞釋放到血清中，活性會急劇增強，因此，通過觀察血清中CK、CK-MB和LDH的活性指標，可以反映心肌的損傷程度〔7〕。本研究表明，SFI能夠顯著降低MIRI大鼠血清中CK、CK-MB、LDH的活性，間接反映出SFI對于心肌有保護作用，且SFI處理高劑量組保護作用更為顯著。

MIRI的生理病理過程中，由于心肌細胞受損導(dǎo)致MMP-9活性增加會造成心肌細胞的繼發(fā)性損害，因此MMP-9活性的降低成為對心肌細胞起到保護作用的指標之一。MMP-9通過利用鋅離子可以降解細胞外基質(zhì)(ECM)，從而達到繼發(fā)損害心肌細胞的目的〔8〕。文獻證明MMP-9參與了多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展〔9〕。在心肌損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中，會有大量的ECM被心肌成纖維細胞合成、分泌。機體為了維持ECM代謝平衡，會增加MMP-9的活性，以促進ECM的降解，引起繼發(fā)性的基膜損害。在MIRI的生理病理過程中，MMP-9在缺血性損傷的慢性重構(gòu)中起主要作用，引起心肌細胞的繼發(fā)性損害〔10〕。因此，降低MMP-9的活性可以起到對心肌細胞的保護作用。本研究結(jié)果說明SFI對MIRI過程中的心肌細胞有保護作用，且高劑量的SFI保護作用強于低劑量。

炎性介質(zhì)能夠啟動、觸發(fā)炎性反應(yīng)，加重心肌損傷，減少炎性反應(yīng)是對心肌缺血再灌注的保護機制之一，降低促炎因子和炎性介質(zhì)濃度可以有效保護心肌〔11〕。TNF-α作為缺血再灌注損傷連鎖反應(yīng)中的關(guān)鍵性介質(zhì)，能夠誘導(dǎo)白細胞釋放IL-6。IL-6作為一種重要的促炎細胞因子，能夠誘發(fā)缺血再灌注損傷〔12〕。有效控制TNF-α、IL-6的濃度能夠減輕MIRI的損傷。本研究結(jié)果說明SFI可以在MIRI過程中起到有效保護心肌的作用，且劑量越高效果越明顯。

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〔2017-03-05修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

尚玉強(1967-)，男，主任醫(yī)師，主要從事心臟大血管外科研究。

易 凡(1977-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心臟大血管外科研究。

R541.4

A

1005-9202(2017)14-3417-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.016