姬松茸多糖對急性單核細胞白血病THP-1細胞增殖和凋亡的影響

王蘇亮 張淑英 曲 影 霍 梅 周 虹

(齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

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姬松茸多糖對急性單核細胞白血病THP-1細胞增殖和凋亡的影響

王蘇亮 張淑英 曲 影 霍 梅 周 虹

(齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 觀察相對低分子量姬松茸多糖(LMPAB)對急性單核細胞白血病THP-1 細胞增殖和凋亡的影響。方法 采用4個濃度梯度的LMPAB分別對體外培養(yǎng)的THP-1細胞進行干預(yù)，然后應(yīng)用水溶性四唑鹽法(WST-1)檢測LMPAB對細胞增殖的影響，借助膜聯(lián)蛋白 V/7氨基放線菌素AnnexinV/7-AAD，雙標記法分析細胞凋亡情況，分別采用PCR與Western印跡檢測Bax和Caspase-3 信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的表達變化。結(jié)果 WST-1檢測結(jié)果顯示，LMPAB對THP-1 細胞的增殖具有抑制作用，且大體呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)；Annexin V/7-AAD檢測結(jié)果顯示，LMPAB具有促進THP-1 細胞凋亡的作用，且大體呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)；PCR與Western印跡檢測結(jié)果顯示，LMPAB各劑量組均可以增強Bax和Caspase-3的mRNA與蛋白表達且大體呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)。結(jié)論 LMPAB能夠調(diào)控白血病THP-1細胞時增殖和凋亡，其抗腫瘤效應(yīng)可能通過調(diào)控線粒體途徑實現(xiàn)。

姬松茸多糖；THP-1；凋亡

急性單核細胞白血病是一類血液系統(tǒng)的非實體性惡性腫瘤，屬于人急性髓系白血病的一種特殊亞型，臨床治療主要以藥物化療、骨髓移植治療和支持治療為主，但治療效果均不理想，緩解率低、預(yù)后較差、容易復(fù)發(fā)〔1,2〕。研究表明，姬松茸的抗腫瘤作用療效顯著，是抗腫瘤大型蕈菌的代表菌屬，姬松茸的抗腫瘤活性較強，目前認為其抗腫瘤的主要活性成分是多糖〔3〕。THP-1細胞株源于1歲急性單核白血病患兒，是經(jīng)典的急性單核白血病細胞株也是研發(fā)新藥物和制定治療新方案的重要媒介〔4〕。本文旨在探討LMPAB 對急性單核細胞白血病THP-1細胞增殖和凋亡的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 LMPAB 由齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)藥科學研究所分離提取，分子量約48 000 kD，實驗時用無血清DMEM培養(yǎng)基配成相應(yīng)濃度，經(jīng)過濾除菌后 4℃保存?zhèn)溆茫籖PMI1640 培養(yǎng)基與胎牛血清購于Hyclone公司(Lot:NY00834，NWC0389)，WST-1購于Millipore公司(Lot:2092649)；TRIzon Reagent 總RNA提取試劑盒和Prime Script RT reagent Kit均為TaKaRa公司產(chǎn)品(Lot:RR370A)，SYBR Premix Ex Taq購于TaKaRa公司(Lot:RR420A)。人急性單核細胞白血病細胞系THP-1 細胞由院本部細胞庫保存。

1.2 細胞增殖檢測 取對數(shù)生長期的THP-1細胞，經(jīng)過計數(shù)后，將其以密度2×104/ml接種于96孔板，每孔注入培養(yǎng)液100 μl(90%RPMI1640 培養(yǎng)基與10%胎牛血清)，培養(yǎng)24 h后加入WST-1 10 μl/孔，進行吸光度檢測。分為：空白對照組、溶媒組及LMPAB 40、20、10、5 μmol/L 4個藥物劑量組。

1.3 細胞凋亡檢測 應(yīng)用Annexin V/7-AAD檢測空白對照組、溶媒組和4個藥物劑量組細胞凋亡情況。取對數(shù)生長期THP-1細胞制成單細胞懸液接種于6孔板，加入Annexin V孵育，沖洗后重懸細胞，加入7-AAD，反應(yīng)10 min，應(yīng)用流式細胞儀檢測。

1.4 PCR檢測Bax和Caspase-3的mRNA表達 收集培養(yǎng)24 h的空白對照組、溶媒組和4個藥物劑量組的細胞，首先進行RNA的純度、濃度和完整性檢測，然后借助Prime ScriptTMRT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)引物由TaKaRa 公司設(shè)計合成，Bax上游引物:5'-TGGCAGCTGACATGTTTTCTGAC-3'，下游引物:5'-TCACCCAACCACCCTGGTCTT-3'；Caspase-3上游引物:5'-CATGGAAGCGAATCAATGGACT-3'，下游引物:5'-CTGTACCAGACCGAGATGTCA-3'；GAPDH上游引物:5'-TCCAGTATGACTCTACCCACG-3'，下游引物:5'-CACGACATACTCAGCACCAG-3'。采用GAPDH作為內(nèi)參基因，分別擴增Bax、Caspase-3和GAPDH 基因，得到閾循環(huán)值(Ct) 平均值，Bax和Caspase-3基因的熒光定量PCR檢測結(jié)果以2-ΔΔCt值反應(yīng)基因mRNA的相對表達量。

1.5 Western印跡檢測Bax和Caspase-3的蛋白表達 收集各組細胞提取Bax和Caspase-3蛋白，進行測定和蛋白定量，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加抗，曝光，采集圖像，應(yīng)用 ImageJ2x 分析軟件分析條帶灰度，以目的基因條帶與內(nèi)參基因 GAPDH 的比值來表示Bax和Caspase-3蛋白的表達水平。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行組單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 LMPAB對THP-1細胞增殖活性的影響 空白對照組增殖抑制率〔(0.708±0.017)%〕與溶媒組〔(0.695±0.010)%〕無明顯差異(P>0.05)，LMPAB各劑量組的細胞活力明顯降低，大體上呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)(P<0.05)，但LMPAB 20 μmol/L和40 μmol/L組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 LMPAB對THP-1細胞凋亡的影響 AnnexinV/7-AAD檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，溶媒組細胞凋亡率無明顯降低(P>0.05)，LMPAB各劑量組細胞凋亡率明顯升高，大體上呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)(P<0.05)，LMPAB 20 μmol/L和40 μmol/L組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3 LMPAB對THP-1細胞Bax和Caspase-3 mRNA表達的影響 PCR檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，溶媒組Bax和Caspase-3 mRNA的表達無明顯差異(P>0.05)，LMPAB各劑量組均明顯升高，大體呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)(P<0.05)，LMPAB 20 μmol/L和40 μmol/L組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。2.4 LMPAB對THP-1細胞Bax和Caspase-3蛋白表達的影響 Western印跡檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，溶媒組Bax和Caspase-3蛋白表達無明顯差異(P>0.05)，LMPAB各劑量組均明顯升高，大體上呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)(P<0.05)，而LMPAB 20 μmol/L和40 μmol/L組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1，圖1。

表1 LMPAB對THP-1細胞凋亡、Bax和caspase-3 mRNA及蛋白的影響

與空白對照組比較：1)P<0.05

A：空白對照組；B：溶媒組；C～F：LMPAB 5、10、20、40 μmol/L組圖1 各組THP-1細胞Bax和Caspase-3蛋白表達

3 討 論

白血病是一種惡性克隆性血液系統(tǒng)疾病。我國以急性髓細胞白血病(AML)為主，其中急性單核細胞白血病FAB發(fā)病率高居AML的首位〔5〕。急性單核細胞白血病M5型具有治療難度大，化療效果差，耐藥性高和易復(fù)發(fā)等特點〔6〕。

多糖是一種天然的高分子聚合物，具有顯著的抗腫瘤活性且毒副作用較小，是一種潛在價值較高的新型抗腫瘤藥物〔7〕。研究表明，LMPAB對腫瘤細胞的凋亡具有一定的調(diào)控作用〔8〕。細胞的凋亡調(diào)控途徑分為“外在”和“內(nèi)在” 兩條調(diào)控途徑?！巴庠凇钡蛲鐾緩接址Q死亡受體途徑，“內(nèi)在”凋亡途徑又稱線粒體途徑〔9〕。線粒體途徑主要由Bcl-2 家族基因和Caspase家族共同參與。Bcl-2 家族基因表達的不同蛋白是調(diào)節(jié)凋亡的關(guān)鍵因子，該家族可分為抗凋亡因子和促細胞死亡因子，抗凋亡因子主要包括Bcl-2、W、XL和Mcl-1等，而促細胞死亡因子主要包括Bax、Bak和Bad等。Bax可從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，增加線粒體膜的通透性，釋放細胞色素C入細胞質(zhì)，激活Caspase-3并水解目標蛋白，從而導致細胞基質(zhì)蛋白分解，引起細胞器膜破裂和細胞核分解，進而導致細胞凋亡〔10〕。

本研究結(jié)果說明LMPAB具有較顯著的抑瘤效應(yīng)且有較明顯的劑量依賴效應(yīng)，20 μmol/L和40 μmol/L組無明顯差異，其原因可能是高劑量的LMPAB對細胞本身產(chǎn)生了抑制作用，其最佳劑量為20 μmol/L。另外本研究結(jié)果提示LMPAB的抑瘤

作用可能是通過增強Bax和Caspase-3的表達，增加線粒體膜的通透性，釋放細胞色素C入細胞質(zhì)，激活、水解目標蛋白，從而引起THP-1細胞器膜破裂和細胞核分解，進而導致THP-1細胞凋亡。說明LMPAB的抗癌作用可能是通過調(diào)控細胞凋亡的“內(nèi)在”途徑來實現(xiàn)。

1 吳碧濤，馬婷婷，林 艷，等.IL-12誘導急性單核細胞白血病細胞分化及凋亡的機制研究〔J〕.中國細胞生物學學報,2015;37(5)：677-82.

2 Siegel R,Ma J,Zou Z,etal.Cancer statistics,2014〔J〕.CA Cancer J Clin,2014;64(1):9-29.

3 董海影，張 春，韓翠翠，等.低分子量姬松茸多糖對樹突細胞Th1 型免疫反應(yīng)的影響〔J〕.中國老年學雜志,2014;34(3)：685-6.

4 Maryanovich M,Frenette PS.A time bomb for leukemia〔J〕.Cell,2016;165(2):262-3.

5 陳萬青，單保恩，鄭榮壽，等.2003～2007年中國腫瘤登記地區(qū)白血病發(fā)病與死亡分析〔J〕.腫瘤,2012;32(4)：251-5.

6 Benderra Z,Faussat AM,Sayada L,etal.MRP3,BCRP and P-glycoprotein activities are prognostic factors in adult acute myeioid leukemia〔J〕.Clin Cancer Res,2005;11(21):7764-72.

7 林 俊，李 萍，陳靠山.近5 年多糖抗腫瘤活性研究進展〔J〕.中國中藥雜志,2013;38(8)：1116.

8 董海影，高志影，榮 華，等.姬松茸多糖對樹突狀細胞Dectin-1、Syk 及CARD9基因表達和T 淋巴細胞增殖的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志,2014;20(10)：180-3.

9 Matthews GM,Newbold A,Johnstone RW,etal.Intrinsic and extrinsic apoptotic pathway signaling as determinants of histone deacetylase inhibitor antitumor activity〔J〕.Adv Cancer Res,2012;116:165-97.

10 Kulikov AV,Shilov ES,Mufazalov IA,etal.Cytochrome c:the Achilles′heel in apoptosis〔J〕.Cell Mol Life Sci,2012;69(11):1786-97.

〔2016-07-19修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

齊齊哈爾市科技局社會發(fā)展項目(SFCG-201319)

周 虹(1966-)，女，碩士，主任醫(yī)師，主要從事臨床藥物抗腫瘤研究。

王蘇亮(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事臨床藥物抗腫瘤研究。

R285

A

1005-9202(2017)14-3413-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.014