雒志恒 祁珊珊 馮自立 吳婕 王永吉
陜西理工大學(xué)維生素D生理與應(yīng)用研究所,陜西 漢中 723001
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP),通常因女性絕經(jīng)后卵巢功能衰退,體內(nèi)雌激素水平急劇下降,導(dǎo)致破骨細(xì)胞活動度增加、骨轉(zhuǎn)化率升高而表現(xiàn)出全身骨量減少、骨密度降低、骨脆性增加的一種骨代謝疾病[1]。在維甲酸誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松癥模型中,維甲酸造成生殖系統(tǒng)損傷引起體內(nèi)雌激素水平降低導(dǎo)致骨質(zhì)疏松,與人類PMOP具有良好的相似性[2,3]。由于雌激素降低引起骨質(zhì)疏松的同時也對生殖系統(tǒng)引起生理改變而造成一定損傷[4],通過傳統(tǒng)的雌激素治療會導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生,卵巢增生甚至引發(fā)生殖系統(tǒng)癌變,存在一定風(fēng)險性,因此使用植物雌激素治療PMOP便得到廣大研究者的青睞。本研究使用葛根素與丹參酮ⅡA在對骨質(zhì)疏松癥進(jìn)行治療的同時觀察其是否對生殖系統(tǒng)存在修復(fù)作用,并對葛根素與丹參酮ⅡA這兩種植物雌激素對生殖系統(tǒng)的修復(fù)作用進(jìn)行比較,為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的生殖系統(tǒng)修復(fù)與治療提供參考。
1.1.1 實驗動物:50只健康雌性SD大鼠(SPF級,由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號:SCXK-(軍)2012-0007)12周齡,體重200~220 g。
1.1.2 主要試劑:維甲酸,含量99.4%,購于北京貝麗萊斯生物化學(xué)有限公司。葛根素98%、丹參酮ⅡA 10%,購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司。苯甲酸雌二醇注射液4 mg/2 mL 購于赤峰博恩藥業(yè)公司。大鼠雌二醇Elisa(96T)試劑盒,購于上海西唐生物科技有限公司。
1.1.3 主要儀器:尼康倒置熒光顯微鏡(Nikon Ti-S)、酶標(biāo)儀(BioTek)、分析天平(TB-214北京賽托利斯儀器有限公司)、小動物麻醉機(美國MATRX)。
50只雌性大鼠隨機分為正常組、模型組、葛根素組、丹參酮ⅡA組、苯甲酸雌二醇陽性對照組,每組10只,分籠飼養(yǎng),自由飲水、攝食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后開始骨質(zhì)疏松建模。除正常組外,其余各組每日給予維甲酸80 mg/(kg·d)灌胃,建模21 d[5,6],正常組每日給予等量蒸餾水灌胃。建模21 d后開始給藥,葛根素組每日按50 mg/(kg· d)、丹參酮ⅡA組每日按200 mg/(kg·d)灌胃,雌二醇組每日按40 μg/(kg·d)腹腔注射,連續(xù)給藥70 d。
1.3.1 血清樣品采集:給藥結(jié)束后分別記錄各組大鼠體重,每只使用小動物麻醉機調(diào)節(jié)麻醉氣體(異氟烷)流量500~700 mL/min麻醉后稱重、眼眶靜脈采血5 mL,3000 r/min 4℃離心6 min,取上清置于- 80 ℃冰箱凍存,以備后用。
1.3.2 生殖系統(tǒng)(子宮、陰道、卵巢)采集及臟器指數(shù)測定:CO2窒息法處死大鼠后用手術(shù)剪從大鼠腹腔正中剪開,迅速找到子宮及卵巢并分離周圍脂肪組織,連陰道一并迅速取出,剔除周圍結(jié)締組織后,PBS沖洗2次,用無塵無菌紙將PBS吸干,置于分析天平上稱重,記錄數(shù)據(jù)計算臟器指數(shù)[7]。記錄后將組織置于4%多聚甲醛中固定24h,備用。
1.3.3 血清雌二醇含量測定:使用大鼠ELISA試劑盒(96T),采用競爭結(jié)合法,每只大鼠血清做2個復(fù)孔,其余操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。反應(yīng)完畢后使用BioTek酶標(biāo)儀進(jìn)行OD值讀數(shù),檢測采用終點動力學(xué)法,450 nm光波長測定。將所得OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程由Elisa計算軟件計算出E2含量。
1.3.4 組織形態(tài)學(xué)觀察:取已固定好的各組子宮、陰道組織經(jīng)酒精梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,5~7 μm切片,HE染色。置于尼康倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行40、100、200倍觀察,每張切片分別取3~5個視野拍照。
1.3.5 形態(tài)計量學(xué)測定:將 HE 染色切片置于 10倍鏡下,隨機選擇6個視野,應(yīng)用 Image-Pro Plus 顯微測量系統(tǒng),進(jìn)行子宮、陰道形態(tài)計量學(xué)相關(guān)參數(shù)的測定,分別測定子宮上皮厚度、子宮腔徑、子宮肌層厚度、管徑厚度,統(tǒng)計子宮腺體個數(shù),以及對陰道上皮厚度、陰道壁厚度進(jìn)行測量。
通過各組臟器指數(shù)比較發(fā)現(xiàn),模型組較正常組顯著降低(P<0.05),提示維甲酸在造成骨質(zhì)疏松癥的同時對生殖系統(tǒng)也有較大損傷作用。其中,丹參酮組較模型組臟器指數(shù)顯著升高(P<0.01)差異極顯著。葛根素組較模型組有所升高但差異不顯著(P>0.05)。此外,葛根素組與丹參酮組雖較模型組均有升高,但都低于陽性對照雌二醇組。雌二醇組與模型組相比差異極顯著(P<0.01)(見圖1)。
圖1 各組生殖系統(tǒng)臟器指數(shù)比較與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01Fig.1 Comparison of organ index of reproductive system between each group(*Compared with the Model group, P<0.05,** Compared with the Model group, P<0.01)
通過分析血清Elisa檢測結(jié)果,模型組較正常組顯著降低(P<0.05)。提示,維甲酸對大鼠生殖系統(tǒng)損傷較大,導(dǎo)致血清E2水平顯著降低。葛根素組較模型組有所升高,差異顯著(P<0.05),丹參酮組E2恢復(fù)水平較模型組顯著升高(P<0.05),植物雌激素兩組E2水平均低于雌二醇陽性藥物組。提示,兩種植物雌激素均能有效增加大鼠體內(nèi)雌二醇水平。丹參酮組與葛根素組相比,兩者差異不顯著(P>0.05)但丹參酮組E2水平稍高于葛根素組。提示,丹參酮藥效優(yōu)于葛根素。見圖2。
圖2 各組血清E2含量與模型組比較,*P<0.05Fig.2 Serum E2 levels in each group(*compared with the Model group, P<0.05)
2.3.1 子宮組織病理學(xué)分析:通過分析HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),正常組子宮斷面全層結(jié)構(gòu)正常,子宮上皮為單層柱狀上皮,排列均一較為致密,固有層較厚,血管較為豐富,視野中可見多個單管狀子宮腺體。模型組子宮出現(xiàn)萎縮形態(tài),4倍鏡視野下可見子宮斷面全貌,管徑厚度較正常組明顯減少,腔徑增加,子宮單層柱狀上皮較正常組明顯變薄,排列不規(guī)則、薄厚不均一。雌二醇組子宮出現(xiàn)向腔內(nèi)增生現(xiàn)象,上皮厚度明顯增加顏色較深,柱狀上皮細(xì)胞排列致密,管徑厚度明顯增加,腔內(nèi)有較多脫落細(xì)胞。葛根素組與丹參酮組子宮斷面全層形態(tài)較模型組有所改善,子宮管徑厚度有所增加,上皮厚度有所增加,但程度均小于雌二醇組(見圖3)。
2.3.2 陰道組織病理學(xué)分析:組織學(xué)觀察顯示,正常組陰道上皮為復(fù)層扁平上皮,上皮較厚,可見呈深紅色的完全角化細(xì)胞,固有層較厚,毛細(xì)血管豐富。模型組陰道復(fù)層扁平上皮及陰道壁厚度較正常組明顯減小。葛根素組及丹參酮組陰道上皮厚度、陰道壁厚度均較模型組有所增加,視野可見紅色角化上皮細(xì)胞。其中,丹參酮組陰道形態(tài)較葛根素組恢復(fù)良好,上皮及管壁生長較厚。雌二醇組陰道上皮厚度較各組均顯著增加,上皮細(xì)胞排列致密,形狀不規(guī)則。植物雌激素兩組雖較模型組上皮厚度及陰道壁厚度有所恢復(fù),上皮細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則,但整體水平均低于雌二醇組(見圖4)。
2.4.1 子宮形態(tài)計量結(jié)果:通過統(tǒng)計各組子宮形態(tài)計量值發(fā)現(xiàn),模型組子宮各項指標(biāo)均較正常組顯著減少,差異極顯著(P<0.01),子宮腔徑顯著擴大(P<0.01)。葛根素組子宮管徑較模型組顯著升高(P<0.01),子宮腔徑較模型組顯著減少(P<0.01),子宮肌層厚度、腺體數(shù)量較模型組顯著升高(P<0.05),子宮上皮厚度較模型組有所增加但差異不顯著(P>0.05)。丹參酮組子宮腺體數(shù)量較模型組有所改善但差異不顯著(P>0.05),其余各項指標(biāo)均較模型組差異極顯著(P<0.01)。通過丹參酮組與葛根素組對比發(fā)現(xiàn),丹參酮組子宮管徑、上皮厚度、肌層厚度、均大于葛根素組,其中子宮管徑差異顯著(P<0,05)(見表1)。
圖3 各組子宮組織結(jié)構(gòu)(HE染色)A:正常組子宮斷面全層40×;B:正常組子宮內(nèi)膜100×;C:模型組子宮斷面全層40×;D:模型組子宮內(nèi)膜100×;E:葛根素組子宮斷面全層40×;F:葛根素組子宮內(nèi)膜100×;G:雌二醇組子宮斷面全層40×;H:雌二醇組子宮內(nèi)膜100×;I:丹參酮組子宮斷面全層40×;J:丹參酮組子宮內(nèi)膜100×;EP:子宮上皮;LP:固有層;▲:子宮腺體Fig.3 The structure of the uterus of each group (H&E staining)A: The whole layer of the uterus in control group 40×; B: The endometrium in control group100×;C: The whole layer of the uterine in retinoic acid group 40×; D: The endometrium in retinoic acid group100×; E: The whole layer of the uterine in PUE group 40×; F: The endometrium in PUE group100×; G: The whole layer of the uterus in estradiol group 40×; H: The endometrium in estradiol group 100×; I: The whole layer of the uterus in tanshinone group 40×; J: The endometrium in tanshinone group 100×; EP: Epithelium; LP: lmin propri; ▲: Uterine gland.
圖4 各組陰道組織結(jié)構(gòu)(HE染色)A:正常組陰道40×;B:正常組陰道100×;C:模型組陰道40×;D:模型組陰道100×;E:葛根素組陰道40×;F:葛根素組陰道100×;G:雌二醇組陰道40×;H:雌二醇組陰道100×;I:丹參酮組陰道40×;J:丹參酮組陰道100×;EP:陰道上皮Fig.4 The structure of the vagina each group (H&E staining)A: The vagina in control group 40×; B: The vagina in control group 100×; C: The vagina in retinoic acid group 40×; D: The vagina in retinoic acid group 100×; E: The vagina in PUE group 40×; F: The vagina in PUE group 100×; G: The vagina in estradiol group 40×; H: The vagina in estradiol group 100×; I: The vagina in tanshinone group 40×; J: The vagina in tanshinone group 100×; EP: Epithelium
組別 子宮管徑(μm)子宮腔徑(μm)子宮上皮厚度(μm)子宮肌層厚度(μm)子宮腺體數(shù)量正常組991.8358±275.6278240.7124±198.807233.97659±5.623866158.5273±48.5328430.0001±3.858612模型組583.0727 ±201.8474**795.1664±514.8004**25.93363±9.365569**100.6479 ±22.34258**20.91667±8.295216**葛根素組856.1824 ±93.98819##252.0668±205.9611##29.3568±17.70335113.0565 ±28.75176#29.0010 ±5.577734#雌二醇組1041.806 ±145.5733##536.4675±206.4699#35.78157±5.080769##185.7924 ±42.59179##35.7000 ±9.569047##丹參酮組957.0978 ±196.0955##▲273.6201±260.7165##31.50211 ±8.348472##188.2642±31.57878## 28.33333 ±3.444803
注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與葛根素組比較,▲P<0.05
2.4.2 陰道形態(tài)計量結(jié)果:各組大鼠陰道形態(tài)計量值如表2所示,模型組陰道上皮厚度較正常組減少,差異極顯著(P<0.01),陰道壁厚度顯著減少(P<0.05)。葛根素組陰道上皮厚度較模型組顯著增加(P<0.01),陰道壁厚度有所恢復(fù)但差異不顯著(P>0.05)。丹參酮組陰道上皮厚度較模型組顯著升高(P<0.01),陰道壁厚度較模型組有所增加但差異不顯著(P>0.05)。兩種植物雌激素藥物組指標(biāo)均低于雌二醇陽性對照組。丹參酮組陰道上皮厚度恢復(fù)程度較葛根素組有明顯改善,差異極顯著(P<0.01),見表2。
表2 各組大鼠陰道形態(tài)計量值±s)Table 2 The measurement of vagina morphometry in±s)
注:與正常組比較,aP<0.05,aaP<0.01;與模型組比較,bP<0.05,bbP<0.01;與葛根素比較,ccP<0.01)
PMOP在45歲以上婦女中發(fā)病率為30%,在75歲以上婦女中發(fā)病率約為90%[8]。婦女絕經(jīng)后因卵巢功能衰退,體內(nèi)雌激素含量急劇下降引起骨代謝異常、骨鈣礦鹽丟失、骨密度下降,骨脆性增加,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、骨痛的同時也對生殖系統(tǒng)造成損傷,引起子宮上皮、內(nèi)膜萎縮,局部微循環(huán)受阻,子宮功能減退,免疫力下降而容易受外界病原體侵襲[9]。同樣,由于雌激素的丟失出現(xiàn)陰道上皮萎縮,上皮細(xì)胞糖原減少導(dǎo)致陰道pH值上升,抑菌能力減弱,易遭受病原微生物感染[10]。此類人群易患絕經(jīng)型或老年性陰道炎、宮頸炎,生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響。
在臨床治療中,通常使用雌二醇、孕激素等來治療骨質(zhì)疏松癥以及絕經(jīng)型陰道炎等,此類激素型藥物能夠直接提高體內(nèi)雌激素水平,刺激成骨細(xì)胞活性,糾正骨代謝異常,緩解生殖系統(tǒng)萎縮[11,12]。但長期使用化學(xué)合成類激素,引發(fā)宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等生殖系統(tǒng)癌變以及心血管血栓等的可能性較大,具有一定風(fēng)險性[13]。
在本試驗中,通過維甲酸誘導(dǎo)建立骨質(zhì)疏松大鼠模型,對維甲酸模型組臟器指數(shù)、血清E2水平、子宮陰道組織學(xué)觀察和形態(tài)計量發(fā)現(xiàn),其各項指標(biāo)均與正常組差異顯著,說明維甲酸在引起骨質(zhì)疏松癥的同時能夠引發(fā)生殖系統(tǒng)損傷,可以較為良好地模擬人類PMOP[14,15]。在本研究中,選用葛根素、丹參酮ⅡA兩種藥物,葛根素為黃酮類化合物,具有雌激素樣作用,能夠有效對骨質(zhì)疏松大鼠起到骨保護作用[16],丹參酮ⅡA屬于丹參中脂溶成分:丹參酮Ⅰ、ⅡB、Ⅴ、Ⅵ、隱丹參酮、異丹參酮多種成分中之一,具有良好的雌激素樣活性[17],二者均有抗骨質(zhì)疏松和促進(jìn)骨形成作用[18]。
通過檢測發(fā)現(xiàn),葛根素與丹參酮ⅡA均能發(fā)揮其類雌激素樣作用,能夠顯著提升大鼠血清E2水平。此外,兩種植物雌激素均能作用于生殖系統(tǒng),顯著增加子宮上皮厚度、管徑厚度,陰道上皮厚度。能夠提升子宮肌層厚度和腺體數(shù)量,增加生殖系統(tǒng)濕重。通過對比發(fā)現(xiàn),丹參酮ⅡA在提升血清E2水平、子宮管徑、上皮厚度、肌層厚度、陰道上皮厚度方面較模型組均有極顯著差異,程度均優(yōu)于葛根素組,恢復(fù)水平更接近于正常大鼠。但兩組藥物水平均低于陽性藥物苯甲酸雌二醇組,由此說明,植物雌激素作用強度較化學(xué)合成類激素弱、起效時間較長,提示這正是植物雌激素的安全性和長期使用性的優(yōu)勢所在[19,20]。
鑒于此,葛根素與丹參酮ⅡA在發(fā)揮雌激素樣作用治療骨質(zhì)疏松的同時均能有效改善PMOP所導(dǎo)致的生殖系統(tǒng)損傷,預(yù)測其對老年性陰道炎、宮頸炎、子宮萎縮等具有一定的治療和修復(fù)作用,為絕經(jīng)后生殖系統(tǒng)修復(fù)治療及藥物研發(fā)提供參考和依據(jù)。