在有氧運動的基礎(chǔ)上服用補腎壯骨顆粒對改善去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥病情的協(xié)同效果

劉蓉 商宇紅

1. 青海省西寧市第一人民醫(yī)院，青海 西寧 810000 2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，遼寧 大連 116011

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一類由于骨質(zhì)吸收增強導(dǎo)致單位體積內(nèi)骨組織量減少，繼而出現(xiàn)以骨微結(jié)構(gòu)破壞為特點的代謝性骨病變[1,2]。目前，OP已躍居世界常見疾病的第7位，由此引起的醫(yī)療和社會負擔(dān)已成為全球公共衛(wèi)生關(guān)注的熱點問題。其中，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)在原發(fā)性 OP 中占有很大比例，其發(fā)生與雌激素缺乏密切相關(guān)[3,4]。目前采用補充鈣劑、維生素D3、雌激素替代治療和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等藥物治療PMOP療效并不理想，普遍存在藥物價格昂貴、鈣吸收較差和骨脆性增加等弊端。因此，進一步探索抗骨吸收藥物的潛在靶標對于治療PMOP具有巨大潛力，其中骨保護素(osteoprotegerin，OPG)/核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)系統(tǒng)作為調(diào)節(jié)破骨細胞分化成熟和生物活性的最終因子，更是極具開發(fā)前景[5]。

PMOP在我國中醫(yī)學(xué)中屬“骨痿”范疇，中醫(yī)認為其發(fā)生與腎精不足有關(guān)，如《內(nèi)經(jīng)》曰“腎主骨”，婦女絕精后腎氣漸衰，久之腎陰虧虛，骨髓化生乏源，骨失所養(yǎng)，故而出現(xiàn)骨脆易折等癥狀[6]。因此，補腎填精壯骨是治療PMOP的根本大法。補腎壯骨顆粒是中醫(yī)治療PMOP的經(jīng)驗方，具有較好的療效?；诖?，本研究利用去卵巢大鼠模擬PMOP模型，觀察在適當規(guī)律有氧運動的基礎(chǔ)上服用補腎壯骨顆粒對改善骨質(zhì)疏松癥病情的效果，同時采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測OPG/RANKL是否發(fā)生變化，為防治PMOP開辟新的選擇方向。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、藥物、試劑及儀器

健康SD雌性大鼠購自本地動物實驗中心，體質(zhì)量(200±20)g。補腎壯骨顆粒由青海省西寧市第一人民醫(yī)院提供(主要成分：淫羊藿、鹿角膠、龜板膠、生地、骨碎補、肉桂、山藥、茯苓、三棱、水蛭)，鹽酸雷洛昔芬片購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，注射用青霉素鈉購于開封豫港制藥有限公司。TRIzol?試劑、cDNA第一鏈合成試劑盒和micro RNA SYRB Green實時熒光定量試劑盒購于北京全是金生物技術(shù)有限公司，三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，DEPC試劑購自Sigma公司，Rotor-Gene 3000 Real-time PCR儀器購自QIAGEN公司，5417R小型臺式高速冷凍離心機購自Eppendorf公司，小動物骨骼強度儀購自北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司。

1.2 動物模型建立和分組

60只大鼠中選出10只作為假手術(shù)組，其余大鼠施行去勢手術(shù)，具體操作如下[7]：大鼠經(jīng)常規(guī)腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后，仰臥固定，在無菌操作下以第13肋遠端脊柱旁縱行切開，逐層分離，找到卵巢，將卵巢完整摘除(確保無殘留)，然后逐層縫合。傷口用碘酒外擦，并于術(shù)后第2d起每只大鼠肌注青霉素，連續(xù)3d，3萬U/d，以預(yù)防術(shù)后感染。假手術(shù)組除了保留卵巢并且只對包裹卵巢的脂肪進行一小塊切除外，其余操作與去勢手術(shù)組相同。正常喂養(yǎng)2 w后，施行去勢手術(shù)的大鼠隨機分為模型組(n=10)、陽性組(n=10)、有氧運動組(n=10)、補腎壯骨顆粒組(n=10)和聯(lián)合組(n=10)。

1.3 給藥方法

分組后，各組大鼠每天上午灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥12w，具體給藥方案為：①陽性組以劑量為6.25 mg/kg灌胃雷洛昔芬片(相當于臨床等效劑量)；②補腎壯骨顆粒組以劑量為1.66 g/kg灌胃補腎壯骨顆粒(相當于臨床等效劑量)；③有氧運動組每日灌胃等量蒸餾水，并參考文獻方案[8]和結(jié)合預(yù)實驗的實際情況，采用遞增負荷進行跑步訓(xùn)練。 設(shè)計的運動負荷為適應(yīng)性跑步3 d，跑臺傾斜度為0°，起始運動時間由20 min/d開始逐漸遞增10 min，一直增加到60 min/d，運動強度為12 m/min。正式跑步每周訓(xùn)練6 d，跑臺傾斜度調(diào)整為5°，運動強度為18 m/min，運動時間為60 min，持續(xù)運動12 w；④聯(lián)合組每日灌胃與補腎壯骨顆粒組相同劑量的藥物并進行與有氧運動組相同運動量的跑步訓(xùn)練；⑤假手術(shù)組、模型組每日灌胃等量蒸餾水。每周稱量1次各組大鼠體重，并根據(jù)體重結(jié)果調(diào)整給藥劑量。

1.4 末次給藥后動物處理

最后一次大鼠進行各種干預(yù)后，將所有大鼠斷頭處死，迅速取下大鼠兩側(cè)股骨，剝除其附著在骨上的肌肉和軟組織。左側(cè)用生理鹽水浸泡的濕紗布包裹置于-20℃保存，用于骨組織生物力學(xué)檢測；右側(cè)用生理鹽水沖洗骨髓，用錫箔紙包裹后放入液氮罐過夜，行qRT-PCR檢測。

1.5 骨組織生物力學(xué)檢測

從-20℃冰箱中取出股骨，室溫自然解凍，將修剪后股骨組織塊放置于YLS-16小動物骨骼強度測定儀的模具之間，參照說明測定骨組織最大負荷、骨結(jié)構(gòu)強度。

1.6 Real-time PCR

①RNA的提?。悍Q取大鼠右側(cè)股骨200 mg，敲碎并研磨成粉末，按照TRIzol?試劑(Invitrogen life technologies)說明書的步驟，加入3倍體積的TRIzol試劑與粉末混合，置于冰沙中，依法提取出標本中的總RNA，通過紫外分光光度計法測定總RNA的純度和濃度，以及凝膠電泳法鑒定RNA的完整性。②逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR(qPCR)：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)需參照試劑盒說明書進行，反應(yīng)條件為：16℃，30 min；42℃，42 min；85℃，5 min。結(jié)束后立即1 μL cDNA產(chǎn)物進行PCR反應(yīng)。目的基因的引物設(shè)計是根據(jù)GeneBank提供的mRNA序列由上海生工合成，見表1所示。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性14 s，61℃退火延伸58 s，共42個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，進行PCR定量時制作標準曲線等。為減小因RNA濃度定量誤差和RNA逆轉(zhuǎn)錄效率誤差等的影響，將三次獨立實驗后所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt公式進行分析[7]，計算公式為：ΔCt值=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，ΔΔCt=ΔCt實驗-ΔCt對照。用計算得到的值判定標本中目的miRNA的表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

表1 目的基因的引物設(shè)計Table 1 Primer design of the target genes

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

在整個實驗過程中，各組大鼠體重均有所增加，實驗結(jié)束時，各組體重為：假手術(shù)組(418.32±36.84)g、模型組(436.73±29.65)g、陽性組(426.15±32.40)g、補腎壯骨顆粒組(422.51±21.04)g、有氧運動組(412.37±18.62)g、聯(lián)合干預(yù)組(435.09±31.43)g，各組大鼠平均體重?zé)o明顯差異(P>0.05)。

2.2 大鼠股骨生物力學(xué)指標變化

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的左股骨最大負荷、左脛骨最大負荷和第四腰椎結(jié)構(gòu)強度均顯著降低(P<0.05)，表明大鼠去勢骨質(zhì)疏松模型建造成功。與模型組相比，陽性組、有氧運動組、補腎壯骨顆粒組和聯(lián)合組的左股骨最大負荷、左脛骨最大負荷和第四腰椎結(jié)構(gòu)強度均顯著提高(P<0.05)。與陽性組相比，聯(lián)合干預(yù)組的左股骨最大負荷和第四腰椎結(jié)構(gòu)強度均顯著提高(P<0.05)。與有氧運動組相比，陽性組、補腎壯骨顆粒組和聯(lián)合干預(yù)組的左股骨最大負荷、左脛骨最大負荷和第四腰椎結(jié)構(gòu)強度均顯著提高(P<0.05)。見表2所示。

表2 各組大鼠股骨生物力學(xué)指標變化情況(kg,±s)Table 2 The changes of biomechanical indexes of the femur in each group (kg, ±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與陽性組比較，&P<0.05；與有氧運動組比較，△P<0.05

Note: Compared with the sham-operated group,*P<0.05; compared with the model group,#P<0.05 compared with the positive group; compared with the aerobic exercise group,△P<0.05

2.3 PCR 產(chǎn)物鑒定

各產(chǎn)物的熔解曲線僅有1個峰，說明為產(chǎn)物較純，見圖1所示。

圖1 qRT-PCR擴增曲線及溶解曲線Fig.1 The amplification curve and melting curve of genes

2.4 骨代謝相關(guān)基因表達情況

熒光定量PCR對骨代謝相關(guān)基因RANKL、OPG mRNA表達進行定量分析，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的RANKL和RANKL/OPG均顯著提高(P<0.05)，而OPG則顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，陽性組、有氧運動組、補腎壯骨顆粒組和聯(lián)合組的RANKL和OPG均顯著提高(P<0.05)，而RANKL/OPG顯著降低(P<0.05)。與陽性組相比，聯(lián)合干預(yù)組的RANKL和OPG均顯著提高(P<0.05)，而RANKL/OPG顯著降低(P<0.05)。見表3所示。

表3 各組骨代謝相關(guān)基因表達情況Table 3 The expression of bone metabolism related genes in each group

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與陽性組比較，&P<0.05；與有氧運動組比較，△P<0.05

Note: Compared with the sham-operated group,*P<0.05; compared with the model group,#P<0.05 compared with the positive group; compared with the aerobic exercise group,△P<0.05

3 討論

PMOP作為一種全球性的慢性疾病正悄無聲息在中老年女性人群中蔓延，被稱為中老年人的隱性殺手，調(diào)查顯示50歲及以上女性O(shè)P的患病率約為男性的2.5～3.5倍，尤其絕經(jīng)后激素水平急劇下降，PMOP發(fā)病率顯著升高，并且胸腰椎、髖骨、四肢等骨折患病率約為男性的1.5倍，骨折的發(fā)生極大降低中老年人的生活質(zhì)量，并且長期臥床可能誘發(fā)其他疾病給患者生命安全造成嚴重威脅[8,9]。目前，PMOP的治療策略與其他原因所致OP大致相同，然而采用補充雌激素、骨吸收抑制劑、鈣劑和維生素D3等針對發(fā)病的病理環(huán)節(jié)的傳統(tǒng)治療策略，雖然具有一定的治療效果，但并不能滿足大多數(shù)患者[10]。因此，進一步篩選開發(fā)出安全高效的抗PMOP新藥物是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要課題。

傳統(tǒng)中藥治療PMOP著重調(diào)動內(nèi)因、辨證論治，具有標本兼治、整體觀念等優(yōu)點，最終達到糾正機體激素失衡和負鈣平衡的功效。中醫(yī)認為，腎為先天之本，主藏精，其盛衰與骨髓的生長發(fā)育和強勁衰弱密切相關(guān)[11]。絕經(jīng)后婦女血海無盈，骨髓生源不足，不能濡養(yǎng)骨骼，發(fā)為“骨痿”。正如《素問·痿論篇第四十四》曰：“腎主身之骨髓，腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”。因此，補腎填精壯骨是中醫(yī)治療PMOP的根本大法。補腎壯骨顆粒是根據(jù)鄧偉民教授創(chuàng)意的經(jīng)驗方采用現(xiàn)代提取工藝手段分別從淫羊藿、鹿角膠、龜板膠、生地、骨碎補、肉桂、山藥、茯苓、三棱、水蛭等10味中藥提取有效成分組合構(gòu)成，方中淫羊藿、鹿角膠、龜板膠溫腎壯陽、強筋骨、益精養(yǎng)血、溫通經(jīng)脈；肉桂、生地、骨碎補散寒止痛、強骨溫筋、益陰生津；茯苓、山藥健脾和胃益腎；三棱、水蛭專治血瘀經(jīng)閉、血脈不調(diào)。諸藥合用共奏補腎壯骨、活血祛瘀功效，由于其療效顯著，目前臨床上已被廣泛應(yīng)用于OP治療，如陳東等[12]臨床觀察證實補腎壯骨方長期服用能明顯提高及穩(wěn)定老年性骨質(zhì)疏松癥患者骨礦含量、骨密度水平，降低新骨折率；又如鄧偉民等[13]通過5年觀察發(fā)現(xiàn)補腎壯骨沖劑長期服用能明顯提高及穩(wěn)定老年性骨質(zhì)疏松癥患者骨礦含量、骨密度水平，降低新骨折率。

適當?shù)囊?guī)律運動是目前治療骨質(zhì)疏松癥的重要方法,對于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥而言，運動所產(chǎn)生的力學(xué)刺激能引起細胞骨架形態(tài)的改變進而活化或抑制細胞內(nèi)的生物信號改變，可以發(fā)揮等同于補充雌激素的作用,有助于提高骨密度，減少鈣質(zhì)流失[14]。基于此，本研究中我們觀察了在有氧運動的基礎(chǔ)上服用補腎壯骨顆粒對改善去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥病情的協(xié)同效果，結(jié)果顯示聯(lián)合干預(yù)組的左股骨最大負荷和第四腰椎結(jié)構(gòu)強度均顯著高于陽性組、有氧運動組、補腎壯骨顆粒組，提示結(jié)合補腎壯骨顆粒和有氧運動的綜合性治療策略對于改善去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥病情更明顯，二者聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的協(xié)同作用，可能由于二者作用機制不完全相同，將二者聯(lián)合治療PMOP具有互補功效。

正常情況下，骨吸收和骨形成之間維持動態(tài)平衡，其平衡打破與眾多骨疾病發(fā)病密切相關(guān)。其中，由成骨細胞分泌的OPG、RANKL是調(diào)節(jié)破骨細胞分化成熟和生物活性的最終調(diào)節(jié)因子，在維持骨吸收和骨形成之間平衡中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠OPG基因可使小鼠出現(xiàn)嚴重的骨質(zhì)疏松，而敲除RANKL基因可使骨密度提高[15]。因此，OPG/RANKL比值常被用來評價破骨細胞的活性。本研究采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測有氧運動聯(lián)合補腎壯骨顆粒的治療策略是否對OPG、RANKL產(chǎn)生影響，結(jié)果顯示聯(lián)合干預(yù)組的RANKL/OPG顯著低于陽性組、有氧運動組、補腎壯骨顆粒組，提示二者聯(lián)合干預(yù)可發(fā)揮明顯的協(xié)同作用可能與抑制破骨細胞的活性作用有關(guān)，從而有效改善去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥狀，促進骨形成。然而，關(guān)于有氧運動聯(lián)合補腎壯骨顆粒如何調(diào)節(jié)OPG、RANKL的表達水平仍有待繼續(xù)深入研究。

本實驗結(jié)果表明，補腎壯骨顆粒結(jié)合有氧運動的綜合性治療策略對于改善去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥病情更明顯，二者聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的協(xié)同作用，可能主要通過降低骨組織中OPG/RANKL比值，從而抑制破骨細胞的活性實現(xiàn)。本研究為臨床上治療PMOP選擇治療策略提供了一定理論依據(jù)。