健脾補(bǔ)腎方增加β-catenin、Runx2表達(dá)而促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合的療效觀察

笪巍偉 趙永見 蘭儒賢 王騰騰 唐德志* 舒冰 馬俊明 施杞 王擁軍

1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032 2. 揚(yáng)州市中醫(yī)院骨傷科，江蘇 揚(yáng)州 225000 3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032

骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture)，是骨質(zhì)疏松癥的嚴(yán)重并發(fā)癥，常在輕微外力作用下即可造成全身各部位骨折，多發(fā)于脊柱、髖部和橈尺骨遠(yuǎn)端，其他部位也易發(fā)生骨折，?？梢鸸钦鄄课惶弁础⒒?、功能障礙，脊柱骨折還可引起身高變矮、駝背等[1]。

骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生率不斷上升，以絕經(jīng)后婦女及中老年患者居多[2]，而骨折后的長(zhǎng)期臥床及制動(dòng)，將引起骨量的快速丟失，進(jìn)一步加重骨質(zhì)疏松癥，導(dǎo)致骨折愈合過程緩慢，恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)，易發(fā)生骨折延遲愈合甚至不愈合，其他部位發(fā)生再骨折等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，給此類患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、軀體痛苦[3]。中醫(yī)藥內(nèi)治法具有局部治療、整體調(diào)節(jié)的效果。上海中醫(yī)藥大學(xué)施杞教授傳承、創(chuàng)新了石氏傷科的學(xué)術(shù)思想和理論特色，將“以氣為主、以血為先”、“肝脾腎同治”充分運(yùn)用于骨科疾患的診治中，健脾補(bǔ)腎方是其數(shù)十年來用于治療骨質(zhì)疏松性骨折的臨床經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)方，具有較好臨床療效。本實(shí)驗(yàn)旨在探討該方治療骨質(zhì)疏松性骨折的療效機(jī)制，為指導(dǎo)臨床運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房訂購2月齡C57BL/6雌鼠46只，SPF級(jí)飼養(yǎng)至3月齡。所有動(dòng)物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均自由飲水和進(jìn)食。許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

水合氯醛(批號(hào)：20081027，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；Ultra-Sensitive Estradiol RIA超敏雌二醇試劑盒(Beckman Coulter， DSL-4800，Immunotechs.r.o.，USA)；10%中性緩沖福爾馬林固定液(批號(hào)15090101，廣州維格斯生物科技有限公司)；uCT80 Micro-CT(SCANCOMedical，CHE)；5417R小型臺(tái)式冷凍型離心機(jī)(Eppendorf，DEU)；MDF-U53V -80℃超低溫冰箱(SANYO，JPN)；SN-697γ計(jì)數(shù)器(機(jī)號(hào)789655，上海核所日環(huán)光電儀器有限公司)；RNase-freeEP管(MCT-150-C，Axygen，USA)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建立骨質(zhì)疏松模型：在雌鼠3月齡時(shí)，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，剔除小鼠背部正中平兩側(cè)髂嵴水平處鼠毛，碘伏消毒，無菌條件下，俯臥位經(jīng)腰背側(cè)正中切開皮膚約2～3 cm切口進(jìn)入，移至一側(cè)肋弓下第3-4腰椎處，鈍性分開腰部筋膜、肌肉，切開腹膜，分離暴露卵巢，結(jié)扎輸卵管和周圍血管后，摘除卵巢。然后按相同的方法摘除對(duì)側(cè)卵巢。在確保摘除雙側(cè)卵巢后，逐層縫合腹膜至皮膚，金霉素眼膏涂抹傷口。隨機(jī)選取5只小鼠作為假手術(shù)組，不摘除卵巢，僅摘除雙側(cè)卵巢旁邊少許脂肪組織；其余41只小鼠均按上述方法行雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)，3個(gè)月后從中隨機(jī)選取5只摘除雙側(cè)卵巢小鼠作為去卵巢組，與假手術(shù)組同時(shí)處死，進(jìn)行觀察比較，以證實(shí)摘除雙側(cè)卵巢后小鼠骨質(zhì)疏松模型建立成功。并對(duì)剩余36只摘除卵巢(骨質(zhì)疏松)小鼠再進(jìn)行脛骨骨折造模。

1.3.2 隨機(jī)法分組：去卵巢后3月，對(duì)36只小鼠進(jìn)行編號(hào)，稱量、記錄體重，平均體重為(35.4±3.6)g，運(yùn)用SPASS 18軟件進(jìn)行隨機(jī)法分組，分為兩個(gè)組：生理鹽水組、健脾補(bǔ)腎組，每組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)7、14、28 d，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各6只小鼠。

1.3.3 藥物配制、煎煮：①健脾補(bǔ)腎方藥物配伍：黨參12 g，刺五加12 g，骨碎補(bǔ)9 g，仙靈脾9 g，獨(dú)活9 g，丹參12 g，藥材均購于上海熔仁堂中藥房。②小鼠與人用藥劑量換算公式：小鼠藥量=1/70×10×體重×數(shù)量×次數(shù)。小鼠每只每天0.2 mL灌胃。生理鹽水組給予等體積的生理鹽水灌胃。

1.3.4 建立骨質(zhì)疏松性骨折模型：骨質(zhì)疏松造模3月后，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，取仰臥位，左側(cè)脛骨，剔凈鼠毛，碘伏消毒，無菌操作經(jīng)脛骨前緣切開皮膚1.5 cm，鈍性分開脛骨中、上1/3處(脛骨脊上方)內(nèi)外側(cè)部分筋膜、肌肉，預(yù)先髓內(nèi)針頭由脛骨平臺(tái)處插入脛骨上1/3處(斷端上部)，手術(shù)剪在1/3處避開脛骨內(nèi)側(cè)深部肌肉，完全橫斷脛骨，針頭插入斷端下部骨腔中，插入約3/4長(zhǎng)度剪斷，再抵入脛骨平臺(tái)下方，逐層縫合筋膜、肌肉、皮膚。術(shù)后第2天進(jìn)行灌胃治療。分別于術(shù)后7、14和28d處死小鼠，取材，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.5 血清雌二醇(E2)檢測(cè)：通過摘眼球取血，分離血清，委托上海中醫(yī)藥大學(xué)核醫(yī)學(xué)放射免疫實(shí)驗(yàn)室采用放射免疫法完成血清E2檢測(cè)。

1.3.6 X-ray線檢測(cè)：剔除脛骨周圍多余軟組織，使用uCT80 Micro-CT，以55 kVp，71 μA條件對(duì)左側(cè)脛骨進(jìn)行X-ray掃描。

1.3.7 Micro-CT檢測(cè)：使用uCT80 Micro-CT統(tǒng)一定位左側(cè)脛骨骨折部位，分辨率為18 μm 逐層掃描成像及三維重建，形態(tài)計(jì)量學(xué)分析包括骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、連接密度(connectivity density，Conn.D.)、骨密度(BMD of TV、BMD of BV)。

1.3.8 組織病理學(xué)染色：①HE染色：石蠟切片60℃烤箱5 min，常規(guī)脫蠟至水→蘇木素染液2 min→蒸餾水沖洗1 min→鹽酸乙醇分化5 sec→氨水藍(lán)化15 sec→蒸餾水沖洗→伊紅染液 2 min→蒸餾水清洗→梯度乙醇分化→二甲苯透明→中性樹膠封片。Olympus VS120-SL 20倍目鏡下觀察。②ABH/OG染色：石蠟切片60℃烤箱5 min，常規(guī)脫蠟至水→鹽酸乙醇分化30sec→不沖洗→ABH 30 min→蒸餾水沖洗→鹽酸乙醇分化2 sec→蒸餾水沖洗→氨水藍(lán)化15sec→蒸餾水沖洗→95%乙醇1 min→Orange G/Eosin Y/Phloxin B溶液 90sec→95%乙醇(I、II、III)10 sec、10 sec、3 min→無水乙醇1 min→二甲苯透明→中性樹膠封片。Olympus VS120-SL 20倍目鏡下觀察。③β-catenin、Runx2染色：石蠟切片60℃烤箱5 min，常規(guī)脫蠟至水→蒸餾水沖洗1 min→甲醇∶H2O2(1∶9)15 min→蒸餾水沖洗→抗原修復(fù)液:蒸餾水(1∶50)，高溫高壓至(105℃，0.025 kPa)→自然冷卻至室溫→PBS 洗片 2 min×3次→5%BSA 封閉 20 min，37℃→不洗片，滴加一抗(β-catenin:1%BSA 1∶200、Runx2∶1%BSA 1∶200)，4℃過夜→PBS洗片 2 min×3次→滴加羊抗兔IgG-Biotin，37℃孵育 15 min→PBS洗片 2 min×3次→滴加SABC，室溫15 min→PBS洗片 2 min×3次→DAB顯色液(蒸餾水1 mL+D1 50 μL+D2 100 μL+D3 50 μL)，室溫孵育3～10 min→梯度乙醇分化→二甲苯透明→中性樹膠封片。Olympus VS120-SL 20倍目鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松小鼠模型建立

(1) 去卵巢組與假手術(shù)組血清雌二醇(E2)含量比較，見表1。去卵巢后3月，小鼠血清雌二醇含量明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)，說明去卵巢后小鼠可模擬絕經(jīng)后婦女雌激素水平降低。

表1 去卵巢模型組與假手術(shù)組E2含量±s)Table 1 The E2 level in the ovariectomized ±s)

注：去卵巢組與假手術(shù)組比較，*P<0.05(下同)

(2)Micro-CT定量分析結(jié)果顯示，去卵巢后3月，可導(dǎo)致小鼠脛骨BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、BMD of TV均明顯降低(P<0.05)。根據(jù)脛骨Micro-CT以及血清雌二醇結(jié)果，說明骨質(zhì)疏松性骨折小鼠模型建立成功，見表2。

2.2 兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)骨折斷端影像學(xué)觀察

骨折斷端X-ray線可見7 d各組脛骨骨折線均較為清晰，兩組間差異不明顯；14 d生理鹽水組骨折線較明顯，斷端無明顯骨痂影連接，健脾補(bǔ)腎組骨折線模糊，均可見骨折斷端大量骨痂影形成，跨過骨折線；28 d生理鹽水組仍可見模糊的骨折線，健脾補(bǔ)腎組骨折線均消失，斷端皮質(zhì)連續(xù)性完整，見圖1。骨痂三維重建圖可直觀看出，與生理鹽水組相比，健脾補(bǔ)腎組7、14、28 d時(shí)均可促進(jìn)骨痂的生成和發(fā)展，見圖2。

表2 去卵巢模型組與假手術(shù)組脛骨Micro-CT定量分析結(jié)果±s)Table 2 The results of quantitative micro-CT analysis in the tibia of the ovariectomized group and sham group(±s)

表3 藥物干預(yù)7d脛骨骨痂Micro-±s)Table 3 Micro-CT result of the tibia callus in 7 days of the drug intervention(±s)

注：與生理鹽水組相比，**P<0.01，*P<0.05(下同)

表4 藥物干預(yù)14 d脛骨骨痂Micro-±s)Table 4 Micro-CT result of the tibia callus in 14 days of the drug intervention(±s)

表5 藥物干預(yù)28 d脛骨骨痂Micro-±s)Table 5 Micro-CT result of the tibia callus in 28 days of the drug intervention(±s)

圖1 骨折斷端X-ray線Fig.1 X-ray image of the fracture point

圖2 骨痂三維重建Fig.2 The 3D reconstruction of the callus

2.3 兩組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)脛骨骨痂Micro-CT定量分析

兩組均在灌胃干預(yù)后7、14和28d期間，不同時(shí)間點(diǎn)各死亡2只小鼠。與生理鹽水組相比，健脾補(bǔ)腎組干預(yù)7、14d時(shí)，可促進(jìn)骨痂中骨小梁體積比(P<0.05)，提高骨痂骨密度(P<0.01)。28d時(shí)，兩組無明顯差異(P>0.05)，說明健脾補(bǔ)腎中藥早中期可促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折骨痂的形成和發(fā)展，見表3，表4，表5。

2.4 兩組小鼠28 d時(shí)骨折部位生物力學(xué)強(qiáng)度分析

生物力學(xué)分析時(shí)，生理鹽水組一組數(shù)據(jù)無法通過有限元軟件正確讀取分析，因此，該組僅有3組數(shù)據(jù)。通過有限元分析軟件，對(duì)藥物干預(yù)28d后小鼠脛骨骨折部位生物力學(xué)進(jìn)行計(jì)量分析，數(shù)據(jù)顯示在剛度方面，健脾補(bǔ)腎組與生理鹽水組有明顯差異(P<0.05)；在彈性模量方面，兩組有顯著性差異(P<0.01)，見表6。圖3為三維重建受力分析圖，紅色代表最大受力強(qiáng)度，綠色代表最小受力強(qiáng)度，從而說明健脾補(bǔ)腎組能夠提高骨折愈合部位生物力學(xué)強(qiáng)度，不僅可以加速骨質(zhì)疏松性骨折的愈合，還可提高預(yù)后質(zhì)量，預(yù)防二次骨折的發(fā)生。

表6 藥物干預(yù)28d脛骨骨折部位生物力學(xué)±s)Table 6 Biomechanical result of the tibia fracture site in 28 days of the drug intervention(±s)

2.5 病理組織學(xué)觀察

圖4 兩組干預(yù)7、14、28 d脛骨骨折部位HE染色Fig.4 HE staining of the tibia fracture site at 7, 14, and 28 days of the drug intervention in two groups

圖5 兩組干預(yù)7、14、28 d脛骨骨折部位ABH/OG染色Fig.5 ABH/OG staining of the tibia fracture site at 7, 14, and 28 days of the drug intervention in two groups

2.5.1 HE染色：兩組干預(yù)7、14、28 d后，小鼠脛骨骨折部位HE染色，可見健脾補(bǔ)腎組7 d時(shí)促進(jìn)骨折斷端軟骨痂的形成，而生理鹽水組無明顯骨痂的形成；14 d天時(shí)，健脾補(bǔ)腎組骨折斷端骨痂開始重塑，成骨細(xì)胞增加，多余骨痂組織被破骨細(xì)胞大量吸收，而生理鹽水組此時(shí)軟骨痂剛開始形成；28 d時(shí)，健脾補(bǔ)腎組骨折斷端已基本愈合，骨皮質(zhì)連續(xù)，骨髓腔已通，而生理鹽水組斷端仍有較多硬骨痂存在，表明健脾補(bǔ)腎方可明顯加速骨質(zhì)疏松性骨折愈合，見圖4。

2.5.2 ABH/OG染色：兩組干預(yù)7、14、28 d后，小鼠脛骨骨折部位ABH/OG染色，可見健脾補(bǔ)腎組在7 d時(shí)促進(jìn)斷端軟骨細(xì)胞(軟骨痂)的形成，而生理鹽水組斷端無明顯軟骨細(xì)胞的形成；14 d時(shí)，健脾補(bǔ)腎組小鼠骨折斷端骨痂開始重塑，軟骨細(xì)胞大量凋亡，成骨細(xì)胞增加，多余骨痂組織被破骨細(xì)胞大量吸收，而生理鹽水組此時(shí)軟骨痂開始大量形成；28 d時(shí)，健脾補(bǔ)腎組骨折斷端已基本愈合，無明顯軟骨細(xì)胞的存在，見圖5。與HE染色，共同說明健脾補(bǔ)腎方可以促進(jìn)骨折部位早、中期膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨，加速骨折愈合。

2.5.3 β-catenin免疫組化染色：兩組干預(yù)7、14、28 d后，小鼠脛骨骨折部位β-catenin染色，可見健脾補(bǔ)腎組7 d時(shí)能夠明顯促進(jìn)骨痂內(nèi)軟骨細(xì)胞胞質(zhì)和核內(nèi)β-catenin的陽性表達(dá)量，多于生理鹽水組；14 d時(shí)，健脾補(bǔ)腎組促進(jìn)軟骨、成骨細(xì)胞胞質(zhì)和核內(nèi)β-catenin的陽性表達(dá)量，多于生理鹽水組；28 d時(shí)，兩組成骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)仍有部分陽性表達(dá)，見圖6。說明健脾補(bǔ)腎中藥能增加β-catenin的表達(dá)，調(diào)節(jié)軟骨、成骨細(xì)胞增殖及分化活性，促進(jìn)骨折愈合。

2.5.4 Runx2免疫組化染色：兩組藥物干預(yù)7、14、28 d后，小鼠脛骨骨折斷端Runx2染色，可見健脾補(bǔ)腎組7、14 d時(shí)，能夠促進(jìn)骨痂內(nèi)軟骨、成骨細(xì)胞胞質(zhì)和核內(nèi)Runx2的陽性表達(dá)量，明顯多于生理鹽水組；干預(yù)28 d時(shí)，健脾補(bǔ)腎組成骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)仍有部分陽性表達(dá)，多于生理鹽水組，見圖7。說明健脾補(bǔ)腎中藥能增加Runx2的表達(dá)，調(diào)控軟骨、成骨細(xì)胞活性，從而促進(jìn)骨折愈合。

圖6 兩組干預(yù)7、14、28 d脛骨骨折部位β-catenin染色Fig.6 β-catenin staining of the tibia fracture site at 7, 14, and 28 days of the drug intervention in two groups

圖7 兩組干預(yù)7、14、28 d脛骨骨折部位Runx2染色Fig.7 Runx2 staining of the tibia fracture site at 7, 14, and 28 days of the drug intervention in two groups

3 討論

在中醫(yī)古代文獻(xiàn)中，對(duì)于骨質(zhì)疏松性骨折的認(rèn)識(shí)及論治尚無明確的記載，因其是骨質(zhì)疏松最嚴(yán)重的并發(fā)癥，多歸屬于《黃帝內(nèi)經(jīng)》中 “骨痹”、“骨痿”等范疇。中老年人由于機(jī)體的自然退變及基礎(chǔ)疾病等因素影響，單純依靠補(bǔ)鈣或抗骨質(zhì)疏松等靶點(diǎn)干預(yù)骨質(zhì)疏松性骨折，顯得較為單薄，而中醫(yī)藥理論及治療方法在該病的預(yù)防、圍手術(shù)期治療中，凸顯特色優(yōu)勢(shì)。

中醫(yī)學(xué)及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)均認(rèn)識(shí)到肌肉與骨骼在生理、病理上的相關(guān)性?！峨y經(jīng)·二十四難》記載：“少陰者，冬脈也，伏行而溫于骨髓。故骨髓不溫，即肉不著骨，骨肉不相親，即肉濡而卻…發(fā)無潤(rùn)澤；無潤(rùn)澤者，骨先死。”肌肉作為人體最主要的動(dòng)力組織器官，其應(yīng)力刺激[4]和微循環(huán)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)[5]，均可影響骨代謝水平及骨質(zhì)量；同時(shí)，骨骼肌的力量與骨折風(fēng)險(xiǎn)有著密切聯(lián)系[6]，是評(píng)估和防治老年人因跌倒而骨折可能的一個(gè)重要因素[7,8]。由此可見，肌肉與骨的密切關(guān)系在骨質(zhì)疏松癥和骨質(zhì)疏松性骨折防治中具有重要的作用。

《傅青主女科》曰：“脾為后天，腎為先天，脾非先天之氣不能化，腎非后天之氣不能生?！逼⒛I之間為后天補(bǔ)養(yǎng)先天、先天溫養(yǎng)后天的辨證關(guān)系[9]，同時(shí)，“脾主肌肉”、“腎主骨”、“先、后天之本”等中醫(yī)理論說明通過調(diào)補(bǔ)脾腎可促進(jìn)肌肉、骨骼間的相互作用，從而達(dá)到防治疾病的功效。

骨質(zhì)疏松性骨折的病機(jī)類似于骨質(zhì)疏松癥，脾腎虧虛是主要病機(jī)、氣血瘀滯是促進(jìn)因素[10]，因此，本研究的治法以健脾補(bǔ)腎為主，輔以活血化瘀。方中黨參補(bǔ)中益氣、健脾益肺，骨碎補(bǔ)補(bǔ)腎強(qiáng)骨、續(xù)傷止痛，兩者共為君藥；輔以臣藥刺五加益氣健脾、補(bǔ)腎安神，仙靈脾補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨，兩者共為臣藥；佐藥丹參活血祛瘀，通經(jīng)止痛；使藥獨(dú)活，入腎經(jīng)，祛風(fēng)除濕，通痹止痛。

3.1 健脾

金元四大家之一李東垣提出：“內(nèi)傷脾胃，百病由生”、“善治病者，惟治在脾,治脾胃以安五臟”，說明了脾胃在疾病診治中的重要性。骨傷科的骨損筋傷等疾患，多從肝脾腎論治，肝主筋、腎主骨、脾主肌肉，然肝血、腎精，無不源于脾之運(yùn)化[11,12]。同時(shí)，骨折患者的治療多重用破血逐瘀、滋膩補(bǔ)益藥物，易致胃失納呆、脾失健運(yùn)?！渡鼾S遺書》云：“脾胃一傷，四臟皆無生氣”、“錯(cuò)病不愈，必傷及脾胃之中”。故顧護(hù)脾胃，則精血充盈；再者，脾土健運(yùn)，可充分吸收、攝取藥物的有效成分，發(fā)揮藥物的治療作用，濡養(yǎng)肌肉、骨骼，促進(jìn)骨折愈合[13]。

3.2 補(bǔ)腎

《素問·六節(jié)藏象論篇》所云：“腎主骨，生髓?！薄夺t(yī)經(jīng)精義》記載：“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之合也?！睂?duì)于“腎主骨”理論的研究理解，分為狹義“腎主骨”，主要強(qiáng)調(diào)腎臟中1α羥化酶的活性及對(duì)鈣磷代謝的調(diào)控，其重要作用在于對(duì)維生素D的羥化作用，促進(jìn)鈣的吸收[14]；廣義“腎主骨”，從“腎藏精，主生長(zhǎng)、發(fā)育與生殖，腎主骨生髓”等方面闡述，腎藏生殖之精是髓和骨骼生成的原始物質(zhì)，髓藏骨中以養(yǎng)骨，腎藏精促進(jìn)骨骼的發(fā)育等[15]。腎精虧虛則是導(dǎo)致機(jī)體退變的重要因素，可引起發(fā)育障礙、骨骼脆弱等表現(xiàn)[16]。

現(xiàn)代研究探析腎-骨-骨髓之間的生理關(guān)系，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎中藥可促進(jìn)骨髓間充干細(xì)胞(marrow stromal cells，MSCs)的成骨細(xì)胞分化，調(diào)控骨的生長(zhǎng)發(fā)育修復(fù)[17]。補(bǔ)腎中藥對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折具有較好的臨床療效[18-20]，可有效緩解疼痛、降低骨轉(zhuǎn)換率、預(yù)防骨折后骨量的丟失、提高骨密度、縮短住院時(shí)間及改善便秘等臨床癥狀。其可能機(jī)制[21,22]是通過調(diào)控β-catenin或Runx-2等信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及礦化、鈣磷代謝、鈣鹽沉積和骨形成，同時(shí)可抑制骨量丟失，從而明顯增加骨密度，改善骨顯微結(jié)構(gòu)，提高骨的生物力學(xué)強(qiáng)度，包括最大載荷、彈性模量和屈服強(qiáng)度，降低骨折發(fā)生率。

3.3 活血

瘀血是骨折發(fā)生時(shí)的必然病理產(chǎn)物，同時(shí)也是骨折愈合過程啟動(dòng)的初始因子。清·陳士鐸在《洞天奧旨》中提出骨折愈合是瘀去、新生、骨合的過程，“瘀不祛，則新不生”。活血化瘀中藥能夠改善損傷部位微循環(huán)，從而消除瘀血對(duì)于骨折愈合的不利影響。一方面可抑制較大血腫生成，而縮小軟骨內(nèi)成骨的范圍，另一方面通過加速血液循環(huán)，改變血管壁的通透性，利于鈣離子的交換和沉積[23]，同時(shí)，還可增加骨折斷端組織毛細(xì)血管開放量，改善循環(huán)，促進(jìn)瘀血消散，代謝產(chǎn)物清除也隨之加快[24]，消除腫脹、疼痛等癥狀，同時(shí)提供更多的氧和營(yíng)養(yǎng)，以加速損傷部位的修復(fù)[25]。

本研究發(fā)現(xiàn)健脾補(bǔ)腎方可促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折早中期骨痂的形成和發(fā)展，可能通過上調(diào)β-catenin和Runx2表達(dá)而促進(jìn)軟骨、成骨細(xì)胞活性；并通過健運(yùn)脾胃，提高機(jī)體對(duì)中藥有效成分的充分吸收，從而促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合，具有較好的臨床推廣價(jià)值。