甲狀腺激素受體與Drosha蛋白互作鑒定分析

尚攀 付元帥 施志儀 喻杰 劉素萍

（上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306）

甲狀腺激素受體與Drosha蛋白互作鑒定分析

尚攀 付元帥 施志儀 喻杰 劉素萍

（上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306）

為了證明甲狀腺激素受體（THR）與Drosha蛋白之間的相互作用，以HEK293細胞為材料，利用免疫共沉淀的方法獲得蛋白免疫復(fù)合物，再經(jīng)Western blot檢測和質(zhì)譜分析。結(jié)果表明，用THR抗體Western blot檢測出有THR蛋白的存在，反之Drosha抗體Western blot檢測有Drosha蛋白的存在；同時，THR抗體免疫沉淀后的質(zhì)譜鑒定存在Drosha蛋白，Drosha抗體免疫沉淀后的質(zhì)譜鑒定也存在THR蛋白，由此說明甲狀腺激素受體與Drosha蛋白之間確實存在相互作用。并且，初步篩選出與兩者共同作用的54個蛋白，經(jīng)Go 聚類分析揭示鑒定蛋白主要是細胞膜和細胞核中成分，參與細胞遷移、細胞凋亡、蛋白代謝、免疫應(yīng)答、信號通路調(diào)節(jié)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物途徑，具有核酸結(jié)合、細胞骨架結(jié)合等分子功能。

甲狀腺激素受體；Drosha蛋白；免疫共沉淀；質(zhì)譜分析；HEK293細胞

甲狀腺激素（Thyrodi hormone，TH）對生物生長、分化、發(fā)育和保持代謝平衡具有十分重要的作用［1-3］。TH的生理作用主要是通過甲狀腺激素受體（Thyrodi hormone receptor，THR）進行［4］。馮綺文等［5］表明甲狀腺激素受體（THR）是一種重要的核受體超家族的成員，THR分子可分成6個區(qū)，從氨基端到羧基端依次為A-F區(qū)，它們組成3個功能域。其中A區(qū)和B區(qū)合稱為A/B區(qū)，組成轉(zhuǎn)錄激活域，其內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄激活作用的區(qū)域稱為AF1區(qū)；C區(qū)形成DNA結(jié)合域（DBD），E區(qū)形成配體結(jié)合（LBD），而F區(qū)的功能則不很清楚［6，7］。甲狀腺激素受體作為一種核受體不僅可以直接作用于靶基因調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄［8，9］，也可與相關(guān)蛋白發(fā)生相互作用。近年來有相關(guān)研究表明甲狀腺激素對microRNA的表達有一定的影響［10-12］，但兩者之間的相互作用尚未清楚。microRNA是進化上保守的非編碼RNAs，長度約為22個堿基，通過參與動植物的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要的作用［13，14］。microRNA合成與加工成熟主要受核糖核酸內(nèi)切酶III Drosha酶和Dicer酶發(fā)揮作用［15］。其中Drosha酶主要負責(zé)細胞核內(nèi)將miRNA前前體pri-miRNA切割成前體premiRNA［16］，隨后Dicer將其加工成成熟的miRNA［17］。同時張紅梅等［18］研究發(fā)現(xiàn)，牙鲆變態(tài)期間甲狀腺激素對Drosha基因的表達有一定的影響。

因此，本實驗以HEK293細胞為材料，利用免疫共沉淀的方法獲得蛋白免疫復(fù)合物，再經(jīng)Western blot檢測和質(zhì)譜分析，從而驗證甲狀腺激素受體與Drosha之間是否存在相互關(guān)系，為探究甲狀腺激素調(diào)控microRNA的作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗以HEK293細胞為材料，由本實驗室保存；DMEM、胎牛血清購自Gibco公司；上樣緩沖、細胞裂解液（上海威奧）；蛋白酶抑制劑（Bio-Rad）；proteinA瓊脂糖珠購自上海翊圣生物；Thyroid Hormone Receptor Antibody（C3）多抗（編號MA1-215）和Drosha Antibody單克隆抗體（編號MA5-14783）購自Thermo公司；脫脂奶粉、蛋白Marker、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、HRP標記的鼠二抗和HRP標記的兔二抗購自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及總蛋白提取 將HEK293細胞用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2條件下在CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡觀察培養(yǎng)瓶中細胞生長處于對數(shù)期時，將培養(yǎng)瓶中的293細胞去除培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS清洗細胞2次，每次5 min，吸取PBS，加入0.5 mL蛋白酶（0.25%），搖勻使其與細胞充分接觸，顯微鏡觀察當多數(shù)細胞變?yōu)閳A形即將脫壁加入含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基終止消化，用移液器吹打使細胞脫壁，將細胞移至1.5 mL EP管中，1 000 r/min離心5min，收集細胞。加入預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑（裂解液∶PMSF=99∶1）的細胞裂解液，現(xiàn)配現(xiàn)用，混勻后在冰上輕微搖晃5-10 min；充分裂解后離心，條件13 000 r/min、4℃、5 min，取上清置干凈的離心管中，分裝使用或者凍存（-80℃），用于后續(xù)試驗。

1.2.2 BCA法測定蛋白濃度 將蛋白樣品按0、1、2、4、8、12、16和20 μL分別加入到96孔酶標板中，并相應(yīng)加入dH2O緩沖液至每個樣品反應(yīng)液體積為20 μL，再各加入200 μL BCA工作液并充分混勻；將板放置37℃恒溫箱反應(yīng)30 min；酶標板冷卻至室溫后放入酶標儀，562 nm波長下讀數(shù)；根據(jù)繪制的標準曲線結(jié)果計算蛋白濃度；將蛋白按測定濃度比例加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸5 min，-80℃保存。

1.2.3 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） 將上述提取的含1mg總蛋白細胞裂解液中分別加入1 μg甲狀腺激素受體抗體和Drosha抗體中，兩者分別都以1∶50的比例稀釋；用錫紙包住上述混合液，4℃緩慢搖晃過夜；Protein A瓊脂糖珠準備，取30 μL Protein A瓊脂糖珠，用適量細胞裂解清洗3次，3 000 r/min，3 min，吸取Protein A瓊脂糖珠時將tip減掉一部分，避免破壞珠子；將預(yù)處理過的Protein A瓊脂糖珠加入到與抗體孵育過夜的細胞裂解液中4℃ 2-4 h，使Protein A 瓊脂糖珠來捕獲抗原抗體復(fù)合物；免疫沉淀反應(yīng)后，4℃以3 000 r/min離心5 min，將上清吸去，收集珠子抗原抗體復(fù)合物，用細胞裂解液清洗珠子4次，加入15 μL 2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，使抗原、抗體、瓊脂糖珠分離，離心吸取上清進行電泳。用于Western blot和質(zhì)譜分析。

1.2.4 Western Blot檢測分析 將上述免疫沉淀復(fù)合物產(chǎn)物分別進行SDS-PAGE電泳檢測，半干法轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用TBST洗膜兩次，每次10min，加入適量的新鮮配制的脫脂奶粉封閉液，在搖床上緩慢搖晃封閉2 h；封閉完后，按照一抗抗體（1∶1 000）說明書用TBST緩沖液書稀釋Thyroid Hormone Receptor Antibody（C3）混合抗體和Drosha Antibody單克隆抗體抗體，4℃孵育過夜；TBST洗膜兩次，每次10min，按照二抗說明書（1∶2 000）要求用TBST稀釋HRP標記的鼠抗羊IgG和HRP標記的羊抗兔，將PVDF膜與稀釋液充分接觸室溫孵育2 h；ECL曝光、顯色，拍照。

1.2.5 質(zhì)譜檢測分析 將免疫沉淀復(fù)合物進行SDSPAGE電泳后，切取含蛋白質(zhì)Marker和目標蛋白的凝膠進行染色及脫色，脫色完成后切割所要的目的條帶，將樣品凍干，加入40 μL Trypsin buffer，37℃16-18 h。進行毛細管高效液相色譜分離，液相A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%），色譜柱Thermo scientific EASY column（2 cm×100 μm 5 μm-C18）以95%的A液平衡。每份樣品經(jīng)毛細管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀（Thermo Sceientific）進行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜鑒定原始文件使用Mascot軟件版本為Mascot 2.2搜庫，最后得到鑒定蛋白結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Western Blot檢測免疫沉淀復(fù)合物

通過對HEK293細胞總蛋白提取，采用購自于Thermo公司THR（C3）THR多抗與其進行免疫沉淀，獲得免疫復(fù)合物。將免疫復(fù)合物進行電泳轉(zhuǎn)膜后，再用Drosha抗體進行免疫印跡分析，檢測HEK293細胞總蛋白免疫復(fù)合物中是否存在Drosha蛋白。結(jié)果（圖1）顯示，免疫復(fù)合物中含有Drosha蛋白，并且蛋白位置與HEK293細胞總蛋白中經(jīng)Western blot檢測到的Drosha蛋白位置一致；同時，進行反向免疫沉淀，采用購自于Thermo公司單抗Drosha抗體與HEK293細胞總蛋白反應(yīng)，獲得免疫復(fù)合物。將免疫復(fù)合物電泳轉(zhuǎn)膜后，用THR抗體進行免疫印跡，檢測HEK293細胞總蛋白免疫復(fù)合物中是否存在THR。結(jié)果（圖2）顯示，免疫印跡檢測到THR蛋白，并且該位置與HEK293細胞總蛋白中經(jīng)Western blot檢測到的THR位置一致。揭示THR與Drosha蛋白之間存在相互作用。

圖1 Western blot檢測免疫復(fù)合物中Drosha蛋白

圖2 Western Blot檢測免疫復(fù)合物中THR

2.2 質(zhì)譜檢測結(jié)果分析

2.2.1 Drosha抗體Ip質(zhì)譜鑒定 實驗通過Drosha抗體與HEK293細胞總蛋白進行免疫沉淀。將免疫復(fù)合物SDS電泳后，獲得含有目的蛋白的膠條泳道，經(jīng)MS鑒定分析，結(jié)果（表1）顯示：免疫復(fù)合物中含有甲狀腺激素受體α、β氨基酸肽段序列，分子量分別為14.02 kD和91.72 kD，理論等電點（pI）分別為6.21和6.64，均與報道相符合，并且具有可信的Score。結(jié)果證明Drosha蛋白與甲狀腺激素受體有作用。

2.2.2 甲狀腺激素受體抗體IP質(zhì)譜鑒定 利用THR抗體進行免疫沉淀后，將免疫復(fù)合物經(jīng)SDS電泳，割取含目標蛋白膠條泳道，MS分析顯示，免疫復(fù)合物中含有Drosha肽段序列，其分子量為159.31 kD，pI為8，與報道相符合，并且具有可信的Score。結(jié)果證明甲狀腺激素受體與Drosha有作用。

表1 Drosha抗體免疫共沉淀質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.3 共同作用蛋白系統(tǒng)分析結(jié)果

利用上述質(zhì)譜鑒定結(jié)果，篩選出兩者共同作用蛋白分子54個，應(yīng)用Go系統(tǒng)聚類分析（圖3-A）發(fā)現(xiàn)其不僅參與甲狀腺激素受體及Drosa蛋白的生物學(xué)作用，而且也參與了細胞遷移、細胞生物合成途徑、細胞凋亡、細胞周期、蛋白代謝途徑、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、信號通路調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、視覺神經(jīng)調(diào)節(jié)和真菌細菌的防御體系等多種生物途徑。細胞內(nèi)組成成分分析（圖3-B）顯示，檢測出的蛋白主要是細胞膜和細胞核中成分，分子功能分析結(jié)果（圖3-C）顯示，檢測出的蛋白涵蓋了核酸結(jié)合、蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、細胞骨架結(jié)合、酶活性修飾等。

3 討論

Drosha在microRNA合成與加工成熟機制中發(fā)揮著重要作用。有相關(guān)研究證明在細胞核內(nèi)Drosha將前前體pri-miRNA切割為前體pre-miRNA［19］，然后經(jīng)Dicer 加工為成熟的miRNA。Drosha作為microRNA上游關(guān)鍵調(diào)控因子，其表達量異常理論上可以引起下游一系列microRNA的改變。有研究報道將Drosha基因沉默后前前體pri-miRNA表達量幾乎不變而成熟的microRNA表達顯著降低，同時沉默后細胞凋亡現(xiàn)象加?。?8］。

近年來研究表明，甲狀腺激素對microRNA的表達具有作用［10-12］，但其作用機制尚不清楚。由于Drosha在microRNA加工成熟方面起著關(guān)鍵作用，因此本實驗從Drosha酶入手，研究甲狀腺激素受體與Drosha酶之間的相互關(guān)系，進而初步探究其作用機制。實驗通過從HEK293細胞中提取總蛋白利用Co-IP的方法來檢測細胞內(nèi)蛋白之間的相互作用，該技術(shù)是一種經(jīng)典而成熟的方法［20］。在細胞內(nèi)自然狀態(tài)下利用特異性抗體去捕獲抗原及與之相互作用的蛋白復(fù)合物，然后用免疫印跡和MS的方法確定蛋白相互作用，該方法能真實反應(yīng)生理條件下蛋白相互作用。我們先用TR抗體捕獲相互作用蛋白，經(jīng)Western Blot檢測存在Drosha酶，再用Drosha抗體捕獲相互作用蛋白，經(jīng)Western Blot也檢測到TR的存在，由此初步驗證兩者之間有相互作用。為了更進一步加以驗證，我們將上述免疫共沉淀復(fù)合物進行質(zhì)譜鑒定分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TR抗體免疫復(fù)合物中質(zhì)譜鑒定到Drosha蛋白，Drosha抗體免疫復(fù)合物中也鑒定到TR存在，這進一步證實兩者之間確實存在相互作用?；谏鲜鼋Y(jié)論可知甲狀腺激素對microRNA的影響可能是作用于Drosha進而對microRNA起調(diào)控作用。

同時，質(zhì)譜分析結(jié)果顯示與兩者共同作用的蛋白有54個，經(jīng)GO功能聚類分析這些蛋白主要是細胞膜和細胞核中成分，這與研究證明的甲狀腺激素受體膜蛋白及Drosha酶的細胞核內(nèi)剪切的細胞內(nèi)分布有一定聯(lián)系，這些蛋白不僅參與甲狀腺激素受體及Drosa蛋白的生物學(xué)作用，也參與細胞遷移、細胞生物合成、細胞凋亡、細胞周期、蛋白代謝、炎癥反應(yīng)、信號通路調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、視覺神經(jīng)調(diào)節(jié)和真菌細菌的防御體系，并且具有鈣離子結(jié)合、核酸結(jié)合、蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、核糖體構(gòu)成、細胞骨架結(jié)合、酶活性修飾等分子功能。有研究報道Drosha基因在血管平滑肌信號通路上起著關(guān)鍵作用，敲除后會降低血管平滑肌細胞中信號蛋白的表達，引起信號通路的改變，導(dǎo)致小鼠早期胚胎死亡［21］。在研究對蝦中發(fā)現(xiàn)將Drosha基因敲降后出現(xiàn)更多的病毒感染［22］，說明Drosha參與了免疫應(yīng)答反應(yīng)。又有相關(guān)研究表明甲狀腺激素受體影響細胞的周期及直接的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或調(diào)節(jié)其他途徑的活性［23］。這些研究與本實驗質(zhì)譜鑒定出的互作蛋白功能分析結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

本研究成功鑒定甲狀腺激素受體與Drosha蛋白之間存在相互關(guān)系，初步探討甲狀腺激素受體與microRNA之間作用的信號通路。

圖3 GO聚類分析結(jié)果

［1］Kogai T, Brent GA. Thyroid Hormones（T4, T3）［J］. Endocrinology, 2005：267-281.

［2］Zhang Z, Boelen A, Bisschop PH, et al. Hypothalamic effects of thyroid hormone, 2017. doi. org/10. 1016/j. mce. 2017. 01. 018

［3］Oetting A, Yen PM. New insights into thyroid hormone action［J］. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism, 2017, 21（2）：193-208.

［4］Power DM, Llewellyn L, Faustino M, et al. Thyroid hormones in growth and development of fish［J］. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp, 2002, 130（4）：447-59.

［5］馮綺文, 蘇青, 羅敏. 甲狀腺激素受體研究進展［J］. 國際內(nèi)分泌代謝雜志, 2003, 23（1）：44-46.

［6］Puzianowskakuznicka M, Krystyniak A, Madej A, et al. Functionally impaired TR mutants are present in thyroid papillary cancer［J］. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2002, 87（3）：1120-1128.

［7］Yen PM. Physiological and molecular basis of thyroid hormone action［J］. Physiological Reviews, 2001, 81（3）：1097-1142.

［8］Satoh T, Katano-Toki A, Tomaru T, et al. Coordinated regulation of transcription and alternative splicing by the thyroid hormone receptor and its associating coregulators［J］. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2014, 451（1）：24-29.

［9］Tata JR. The road to nuclear receptors of thyroid hormone［J］. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）- General Subjects, 2013, 1830（7）：3860-3866.

［10］Lin YH, Wu MH, Liao CJ, et al. Repression of microRNA-130b by thyroid hormone enhances cell motility［J］. Journal of Hepatology, 2015, 62（6）：1328-1340.

［11］Diniz GP, Takano AP, Barreto-Chaves ML. MiRNA-208a and miRNA-208b are triggered in thyroid hormone-induced cardiac hypertrophy - role of type 1 Angiotensin II receptor（AT1R）on miRNA-208a/α-MHC modulation［J］. Molecular & Cellular Endocrinology, 2013, 374（1-2）：117-124.

［12］Boguslawska J, Piekielko-Witkowska A, Wojcicka A, et al. Regulatory feedback loop between T3 and microRNAs in renal cancer［J］. Molecular & Cellular Endocrinology, 2014, 384（1-2）：61-70.

［13］ Ameres SL, Zamore PD. Diversifying microRNA sequence and function［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2013, 14（8）：475-488.

［14］Ha M, Kim VN. Regulation of microRNA biogenesis［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2014, 15（8）：509.

［15］Kwon SC, Nguyen TA, Choi YG, et al. Structure of Human DROSHA［J］. Cell, 2015, 164（1-2）：81.

［16］Lee Y, Ahn C, Han J, et al. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing［J］. Nature, 2003, 425（6956）：415.

［17］Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference［J］. Nature, 2001, 409（6818）：363.

［18］張紅梅. 牙鲆變態(tài)發(fā)育中Drosha蛋白與甲狀腺激素受體的相互作用及其對microRNA的調(diào)控［D］. 上海：上海海洋大學(xué), 2015.

［19］Yamagata K, Fujiyama S, Ito S, et al. RETRACTED：Maturation of MicroRNA is hormonally regulated by a nuclear receptor［J］. Molecular Cell, 2014, 54（3）：536.

［20］郭純. 免疫共沉淀技術(shù)的研究進展［J］. 中醫(yī)藥導(dǎo)報, 2007, 13（12）：86-89.

［21］Fan P, Chen Z, Tian P, et al. miRNA biogenesis enzyme Drosha is required for vascular smooth muscle cell survival［J］. PLoS One, 2013, 8（4）：e60888.

［22］Huang T, Xu D, Zhang X. Characterization of shrimp Drosha in virus infection［J］. Fish & Shellfish Immunology, 2012, 33（3）：575-581.

［23］Pascual A, Aranda A. Thyroid hormone receptors, cell growth and differentiation［J］. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-General Subjects, 2013, 1830（7）：3908-3916.

（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Interaction Analysis of Thyroid Hormone Receptor with Drosha Protein

SHANG Pan FU Yuan-shuai SHI Zhi-yi YU Jie LIU Su-ping
（Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources，Ministry of Agriculture，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

This study isto demonstrate the interaction between the thyroid hormone receptor（THR）and the Drosha protein. Selecting HEK293 cells as materials，the protein immune complexes were acquired by co-immunoprecipitation method，and then detected by Western blot and analyzed by mass spectrometry. The results showed that there was THR protein detected by THR antibody Western blot，and Drosha protein was detected by Drosha antibody Western blot. Concurrently，the Drosha protein was identified by mass spectrometry after immunoprecipitation with THR antibody，and the mass spectrometry after Drosha antibody immunoprecipitation confirmed that therewas also a THR protein，suggesting that there was interaction between the THR and the Drosha protein. Moreover，the Go cluster analysis for the primarily screened 54 proteins interacting with both THR and Drosha protein revealed that the identified proteins were mainly composed of cell membrane and nucleus，and they were involved in varied biological pathways such as cell migration，cell apoptosis，protein metabolism，immune responses，signal pathways and transcription regulations，etc.，also had molecular functions of binding with nucleic acid and cytoskeleton.

thyroidhormone receptor；Drosha protein；co-immunoprecipitation；mass spectrometry；HEK293 cell line

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0174

2017-03-09

國家自然科學(xué)基金項目（41676138，41506159），上海市自然科學(xué)基金項目（15ZR1420600），上海市教委科研創(chuàng)新項目（15ZZ083）

尚攀，男，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：shpan1017@126.com

施志儀，男，教授，研究方向：分子細胞生物學(xué)；E-mail：zyshi@shou.edu.cn