NADPH依賴的甘露醇脫氫酶的重組表達(dá)及甘露醇的轉(zhuǎn)化條件

封志媚 趙雅童 劉業(yè)學(xué) 路福平 李玉

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

NADPH依賴的甘露醇脫氫酶的重組表達(dá)及甘露醇的轉(zhuǎn)化條件

封志媚 趙雅童 劉業(yè)學(xué) 路福平 李玉

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

對NADPH依賴的甘露醇脫氫酶的異源表達(dá)和對果糖的轉(zhuǎn)化情況進(jìn)行分析，為在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建甘露醇的合成途徑奠定基礎(chǔ)。構(gòu)建重組菌株BL21（DE3）/pET28a-mdh，對其進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵后，通過His標(biāo)簽對目的蛋白進(jìn)行純化，并利用HPLC分析純化后的甘露醇脫氫酶轉(zhuǎn)化果糖生成甘露醇的情況。成功構(gòu)建了NADPH依賴的甘露醇脫氫酶重組表達(dá)菌株BL21（DE3）/pET28amdh，并對表達(dá)后的甘露醇脫氫酶進(jìn)行了純化，測得純化后的甘露醇脫氫酶酶活力為270 U/mL。對酶法轉(zhuǎn)化果糖得到甘露醇的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的轉(zhuǎn)化條件為：當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00 g/L，反應(yīng)初始pH5.8，溫度40℃，NADPH終濃度為9 mmol/L時，甘露醇轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到97.4%。實(shí)現(xiàn)了NADPH依賴的甘露醇脫氫酶在大腸桿菌中的活性表達(dá)，為進(jìn)一步研究大腸桿菌合成甘露醇的代謝調(diào)控提供了依據(jù)。

甘露醇脫氫酶；NADPH；甘露醇；大腸桿菌；純化

甘露醇是一種被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域的功能糖醇［1］，目前主要的合成方法有天然提取法、化學(xué)催化法［2］、以及酶轉(zhuǎn)化法和微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化法。前兩種方法因產(chǎn)率低、副產(chǎn)物比例高、產(chǎn)物分離純化困難等因素限制了其在甘露醇生產(chǎn)上的應(yīng)用；而后兩種方法，因細(xì)胞內(nèi)或胞外起關(guān)鍵作用的酶的催化特異性強(qiáng)，使得底物轉(zhuǎn)化為甘露醇的轉(zhuǎn)化率高，且反應(yīng)條件溫和、無山梨醇等副產(chǎn)物產(chǎn)生，產(chǎn)品的收率高［3］。

合成甘露醇的關(guān)鍵酶是甘露醇脫氫酶（Mannitol dehydrogenase，EC：1.1.1.67），它可直接催化底物果糖生成甘露醇，同時需要輔酶NADH或NADPH［4］，無論是全細(xì)胞合成還是酶法合成，關(guān)鍵是甘露醇脫氫酶的表達(dá)活性和催化條件，除此之外，細(xì)胞對底物的消耗、輔酶和能量供應(yīng)的不平衡、產(chǎn)物的分解利用及轉(zhuǎn)運(yùn)等因素也都會對產(chǎn)量產(chǎn)生影響。因此，構(gòu)建代謝工程菌合成甘露醇是一個很好的選擇，如Gaspar［4］、王小芳［5］等通過對甘露醇脫氫酶過表達(dá)，以及對甘露醇分解途徑、果糖和輔酶消耗途徑的阻斷，來實(shí)現(xiàn)甘露醇的高效合成。但在構(gòu)建工程菌時，首先需要對關(guān)鍵酶的功能和催化活性進(jìn)行分析和評價，選擇酶分子量大小合適、在宿主細(xì)胞中表達(dá)活性高、作用條件溫和的酶作為工程菌構(gòu)建的基因來源。因此，本研究利用大腸桿菌表達(dá)來源于氧化葡萄糖酸桿菌的甘露醇脫氫酶，并對酶的活性和轉(zhuǎn)化果糖生成甘露醇的條件進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步在大腸桿菌中構(gòu)建產(chǎn)甘露醇代謝工程菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans），大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）BL21（DE3）、E. coli JM109、克隆表達(dá)載體pET-28a（+）、克隆載體pMD19-T simple均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 山梨醇液體培養(yǎng)基：山梨醇20 g/L；酵母提取物5 g/L；K2HPO43 g/L；MgSO4·7H2O 1 g/L；味精1 g/L；固體培養(yǎng)基添加2 g/L瓊脂，用于氧化葡萄糖酸桿菌培養(yǎng)，28℃、220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L；酵母提取物5 g/L；氯化鈉10 g/L；pH7.0，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂，用于大腸桿菌培養(yǎng)，37℃、220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。固體和液體培養(yǎng)基在需要時添加卡那霉素（Kanamycin）至終濃度50 mg/L。

1.1.3 試劑 異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），甲基乙二胺（TEMED）、卡那霉素、還原型輔酶Ⅱ二鈉鹽（NADPH）、咪唑、二硫蘇糖醇（DTT）購自Sigma公司，其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純；Taq DNA聚合酶、dNTPs、solutionⅠ連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ購自TaKaRa公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、純化DNA片段的瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒快速提取試劑盒和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)等均購自上海生物工程有限公司；PCR引物由北京華大基因技術(shù)有限公司合成。

1.1.4 主要儀器 凝膠成像儀、蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Agilent高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；超聲破碎儀（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）；TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；高速低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；HW SY21-K電熱恒溫水浴鍋（江蘇國華儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 重組菌株的構(gòu)建 按DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）操作步驟提取氧化葡萄糖酸桿菌總基因組DNA。質(zhì)粒的提取方法參考文獻(xiàn)［6］所述方法進(jìn)行。根據(jù)GenBank報道的Gluconobacter oxydans 621H中甘露醇脫氫酶基因（mdh）全序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，見表1。

表1 PCR反應(yīng)引物

PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min；94℃ 35 s，57℃35 s，72℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

用限制酶Eco R I和Hind Ⅲ雙酶切擴(kuò)增得到甘露醇脫氫酶基因片段，將得到的酶切片段mdh連接到雙酶切后的載體pET-28a（+）上生成表達(dá)質(zhì)粒pET28a-mdh，轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞大腸桿菌E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，通過卡那霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，然后對轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒分別用雙酶切法和PCR進(jìn)行鑒定。1.2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及SDS-PAGE分析 將重組質(zhì)粒pET28a-mdh轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌E.coli BL21（DE3）中，同時用載體質(zhì)粒pET-28a（+）轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌E.coli BL21（DE3）作為對照。分別挑取單菌落接種到5 mL LB 液體培養(yǎng)基中（終濃度50 μg/mL Kan），37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，按2%接種量轉(zhuǎn)接于裝有200 mL液體LB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8-1.0，加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.5 mmol /L，16℃、160 r/min誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)18 h 后，4℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體，將菌體懸浮于30mL Lysis bufer中超聲處理破碎細(xì)胞，破碎后12 000 r/min離心30 min，收集上清液。超聲條件：工作時間3 s；間歇4 s；共超聲30 min；裂解頻率55 Hz。將上清液與1 mL鎳硅膠4℃結(jié)合1-2 h后，加入層析柱中，收集下液，再倒回柱子中，重復(fù)3次，然后換收集管，向柱子中加入10 mL DNA Wash buffer洗脫硅膠，換收集管，再用5 mL Elution buffer過柱子，收集到的液體即為純化后的蛋白。SDS-PAGE分析重組蛋白的純化結(jié)果。分離膠的濃度為12%，濃縮膠的濃度為5%，考馬斯亮藍(lán)染色。

1.2.3 酶活的測定 甘露醇脫氫酶酶活的測定參見文獻(xiàn)［7］所述方法測定。酶活計(jì)算公式為：

1.2.4 酶轉(zhuǎn)化果糖生成甘露醇的反應(yīng)條件優(yōu)化

1.2.4.1 pH值對甘露醇脫氫酶轉(zhuǎn)化果糖生成甘露醇的影響 配制pH分別為4.3、4.8、5.3、5.8、6.3和6.8的醋酸鈉緩沖液，以20%的果糖為底物，溶解于不同pH的緩沖液，10 mL果糖溶液加酶量100 U，加入NADPH的終濃度為9 mmol/L，置于40℃，150 r/min的水浴搖床，轉(zhuǎn)化30 min，HPLC檢測甘露醇的生成量。

1.2.4.2 溫度對甘露醇脫氫酶轉(zhuǎn)化果糖生成甘露醇的影響 以20%的果糖為底物，加酶量為10 U/mL，加入NADPH的終濃度為 9 mmol/L，反應(yīng)初始pH為5.8，分別在20、30、40、50、60和70℃的水浴搖床150 r/min轉(zhuǎn)化30 min，HPLC檢測甘露醇的生成量。

1.2.4.3 底物濃度對甘露醇脫氫酶轉(zhuǎn)化果糖生成甘露醇的影響 分別以10%、20%、30%、40%和50%的果糖為底物，加酶量為10 U/mL，加入NADPH的終濃度為9 mmol/L，初始pH為5.8，于40℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的水浴搖床轉(zhuǎn)化30 min，HPLC檢測甘露醇的生成量。

1.2.4.4 NADPH對甘露醇脫氫酶轉(zhuǎn)化果糖生成甘露醇的影響 以20%的果糖為底物，加酶量為10 U/mL，分別在體系中加入終濃度為3、6、9、12和15 mmol/L的NADPH，反應(yīng)初始pH5.8，在40℃、150 r/min的水浴搖床轉(zhuǎn)化30 min，HPLC檢測甘露醇的生成量。

1.2.5 HPLC檢測含量 轉(zhuǎn)化后的樣品經(jīng)加熱滅活后，12 000 r/min 離心10 min，取上清備用。糖的利用率和產(chǎn)物測定使用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行分析［8］。糖和甘露醇的測定使用Prevail Carbohydrate ES色譜柱，柱溫維持在30℃，流動相為乙腈∶水=75∶25，以1 mL/min的流速進(jìn)行洗脫。使用蒸發(fā)光檢測器進(jìn)行分析，通過對比保留時間進(jìn)行定性和定量分析。

2 結(jié)果

2.1 甘露醇脫氫酶表達(dá)載體的構(gòu)建及重組質(zhì)粒的鑒定

將重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，如圖1-A，小片段為1 500 bp左右的目的基因，大片段為5 500 bp左右的pET-28a（+）載體，PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖1-B，片段為1 500 bp，大小正確，表明目的基因已插入到pET-28a（+）載體上。

圖1 重組質(zhì)粒pET28a-mdh雙酶切及PCR驗(yàn)證電泳圖

2.2 目的蛋白的表達(dá)、純化及酶活分析

將純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析后得到的結(jié)果（圖2）可知，蛋白的條帶單一，大小為54 kD，與預(yù)測一致，純化效果較好。同時對純化后的重組酶的酶活進(jìn)行測定，酶活達(dá)到270 U/mL。

圖2 蛋白純化的SDS-PAGE分析

2.3 重組甘露醇脫氫酶生產(chǎn)甘露醇轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

為了有效地選取轉(zhuǎn)化條件的范圍，對甘露醇脫氫酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。由圖3-A可知，當(dāng)溫度在20-60℃之間時，酶活力較穩(wěn)定且均較高；當(dāng)溫度低于20℃或高于60℃時，酶活力大幅下降。由圖3-B可知，當(dāng)pH值在4.3-6.8之間時，酶活力較高且變化趨勢較小，而當(dāng)pH值低于4.3或高于6.8時，酶活力明顯大幅下降。因此，得到甘露醇脫氫酶的酶學(xué)性質(zhì)為：溫度穩(wěn)定范圍為20℃-60℃，最適溫度為40℃；pH穩(wěn)定范圍為4.3-6.8，最適pH5.8。

2.3.1 初始pH對轉(zhuǎn)化的影響 通過不同初始pH條件下進(jìn)行的甘露醇脫氫酶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，得到的結(jié)果如圖4所示，在pH為5.8的時候，甘露醇轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到了93.5%。當(dāng)pH為4.3時，甘露醇的轉(zhuǎn)化率最低，僅為38.5%。pH在4.8-6.3時，甘露醇的轉(zhuǎn)化率均高于75%，pH為6.8時，轉(zhuǎn)化率下降到61.3%，說明了pH偏酸的條件適合酶的轉(zhuǎn)化，酸性和中性條件下都不利于甘露醇的生成。因此反應(yīng)最適pH選為5.8。

2.3.2 反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)化的影響 在不同溫度下進(jìn)行甘露醇脫氫酶轉(zhuǎn)化果糖合成甘露醇的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示，40℃時，甘露醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值96%，而隨著溫度的上升或下降，甘露醇的轉(zhuǎn)化率均下降。故40℃為最適反應(yīng)溫度。

圖3 甘露醇脫氫酶的溫度和pH穩(wěn)定性

圖4 初始pH對甘露醇脫氫酶轉(zhuǎn)化的影響

2.3.3 底物濃度對轉(zhuǎn)化的影響 在其他條件相同的情況下添加不同濃度的底物，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)果糖底物濃度為300 g/L時，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到96.7%。果糖濃度小于300 g/L時，甘露醇的轉(zhuǎn)化率隨著底物濃度增加而增加。而果糖濃度大于300 g/L時，轉(zhuǎn)化率隨底物濃度的增加下降，到500 g/L時下降為87.6%。因此，300 g/L濃度的果糖是最合適的。

圖5 反應(yīng)溫度對甘露醇脫氫酶轉(zhuǎn)化的影響

圖6 底物濃度對甘露醇脫氫酶轉(zhuǎn)化的影響

2.3.4 NADPH濃度對轉(zhuǎn)化的影響 NADPH是甘露醇脫氫酶轉(zhuǎn)化果糖生成甘露醇必需的輔酶因子，通過添加不同濃度的NADPH來檢測其濃度對轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果（圖7）顯示，隨著NADPH濃度的增加，甘露醇的轉(zhuǎn)化率也隨之提高，濃度達(dá)到9 mmol/L時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值為97.4%，之后，隨著NADPH濃度的增加轉(zhuǎn)化率基本不變。因此，最佳的NADPH濃度為9 mmol/L。

圖7 NADPH濃度對甘露醇脫氫酶轉(zhuǎn)化的影響

3 討論

大腸桿菌作為目前研究最透徹的模式生物，其遺傳背景、代謝機(jī)理清晰，遺傳操作方法和培養(yǎng)條件成熟、完善，被認(rèn)為是用來表達(dá)外源蛋白和合成目標(biāo)產(chǎn)物的最適底盤微生物。王芳［9］、陳艷［6］和程雅韻［10］等利用大腸桿菌分別表達(dá)了不同來源的甘露醇脫氫酶，其酶活力均小于20 U/mL，酶活力較低，但利用表達(dá)后的酶可以將底物果糖轉(zhuǎn)化為甘露醇。

另外，構(gòu)建合成甘露醇的大腸桿菌工程菌，除需對酶進(jìn)行過量表達(dá)外，還需考慮輔酶NADH或NADPH［11，12］的合成和消耗情況。選擇NADH依賴型的甘露醇脫氫酶，因細(xì)胞內(nèi)NADH含量低，需要通過額外的NADH再生系統(tǒng)提供輔酶，Reshamwala等［13］、Kaup等［14］通過構(gòu)建甲酸脫氫酶還原系統(tǒng)，磷酸鹽/亞磷酸鹽還原系統(tǒng)等來再生NADH；而選用NADPH依賴型的甘露醇脫氫酶，則可通過增強(qiáng)細(xì)胞本身的HMP途徑而增加NADPH的生成量，如Wasylenko［15］、Papagianni［16］等通過限制EMP途徑的碳流量，提高HMP途徑的碳流量，從而調(diào)控NADPH的生成量，為催化反應(yīng)提供足夠的NADPH。本研究對NADPH依賴型甘露醇脫氫酶進(jìn)行了表達(dá)、純化并優(yōu)化了其在體外轉(zhuǎn)化果糖生成甘露醇的轉(zhuǎn)化條件，為之后構(gòu)建產(chǎn)甘露醇的大腸桿菌代謝工程菌株奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過將來源于氧化葡萄糖桿菌的NADPH依賴型甘露醇脫氫酶基因克隆到表達(dá)載體pET28a（+）上，構(gòu)建了重組表達(dá)菌株BL21（DE3）/pET28amdh，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，將目的蛋白進(jìn)行純化，并通過聚丙烯酰氨凝膠電泳顯示純化蛋白大小為54 kD，與目的蛋白大小一致，并測得純化后的酶活為270 U/mL。用純化后的酶液對甘露醇脫氫酶酶法轉(zhuǎn)化果糖的條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最終的優(yōu)化條件為：最適轉(zhuǎn)化溫度為40℃，最適轉(zhuǎn)化pH為5.8，最適底物濃度為300 g/L，最適的NADPH終濃度為9 mmol/L。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Recombinant Expression of NADPH-Dependent Mannitol Dehydrogenase and Transformation Conditions of Mannitol

FENG Zhi-mei ZHAO Ya-tong LIU Ye-xue LU Fu-ping LI Yu
（Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457）

This work is to analyze the heterogeneous expression of NADPH-dependent mannitol dehydrogenase and the transformation of fructose for laying a foundation of constructing mannitol synthetic way. The recombinant strain BL21（DE3）/pET28a-mdh of expressing mannitol dehydrogenase was constructed and induced，and the target protein was purified with His-tag. Mannitol production from mannitol dehydrogenase transforming fructose was analyzed by HPLC. As results，the recombinant strain was constructed successfully and the mannitol dehydrogenase was purified. The activity of the purified mannitol dehydrogenase was 270 U/mL. The conditions of fructose transforming to mannitol by purified mannitol dehydrogenase were optimized，and the optimal conditions were as follows：300 g/L substrate fructose，pH5.8，9 mmol/L NADPH and incubation at 40℃. Under the optimized conditions，the transformation rate of mannitol reached 97.4%. In conclusion，the NADPH-dependent mannitol dehydrogenase was expressed successfully in Escherichia coli，providing the basis for studying the metabolism regulation of mannitol synthesis in E. coli.

mannitol dehydrogenase；NADPH；mannitol；Escherichia coli；purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0168

2017-03-06

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)項(xiàng)目（2016YFD0400803）

封志媚，女，碩士研究生，研究方向：功能糖醇的生物合成；E-mail：1241107309@qq.com

李玉，女，博士，教授，研究方向：應(yīng)用微生物與酶工程；E-mail：liyu@tust.edu.cn