酸馴化和紫外誘導提高微藻耐酸性

史飛飛 陳通 程蔚蘭 宋程飛 季春麗 李潤植

（山西農(nóng)業(yè)大學 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，太谷 030801）

酸馴化和紫外誘導提高微藻耐酸性

史飛飛 陳通 程蔚蘭 宋程飛 季春麗 李潤植

（山西農(nóng)業(yè)大學 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，太谷 030801）

應用微藻固定煙道氣CO2既可減排又能生產(chǎn)高值生物基產(chǎn)品，但是，煙道氣高濃度CO2和氮硫氧化物導致培養(yǎng)液過度酸化、抑制微藻生長。通過建立微藻抗性馴化簡易方法，以期提高微藻耐酸性和在低pH條件下的起始生長速率。經(jīng)過酸馴化和紫外誘導疊加處理后的柵藻（Scenedesmus），在酸性環(huán)境下生長初期的平均生長速率達到0.253 g/（d·L），明顯高于單因子處理的pH4.5酸馴化（0.132 g/（d·L））和紫外誘導5 min（0.092 g/（d·L））的生長速率。經(jīng)過馴化處理的種子藻在pH3的酸性環(huán)境中可以正常生長，而未馴化微藻生長近乎停滯。經(jīng)過馴化處理的種子藻接入低pH培養(yǎng)基后起始生長速率比未馴化微藻提高6.6倍。酸馴化和紫外誘導處理顯著提高了柵藻對低pH環(huán)境的耐受性。

柵藻；煙道氣；酸馴化；生物減排

煤基煙道氣CO2是引起溫室效應的主要因素。過度的CO2排放導致全球氣候的變化、霧霾等一系列的環(huán)境問題，對生態(tài)環(huán)境和人類的健康及經(jīng)濟利益造成損害。國內(nèi)外有關專家相繼提出和建立了一些物理化學減排路徑，如海洋深層儲存法和利用乙醇胺類吸收劑對CO2進行分離回收等，然而這些物理化學減排存在成本高、次生污染和不可再生等缺陷。生物減排近年來取得不少進展，特別是利用微藻減排深受關注。與陸生植物相比，微藻作為高效固碳的自養(yǎng)植物，具有生長周期短、繁殖快、適應環(huán)境性強等優(yōu)點。微藻可以直接利用煙道氣中的CO2、氮硫元素作為其生長的營養(yǎng)原料，其生物質(zhì)可以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生物柴油及高值化工產(chǎn)品等。諸多應用微藻固定煙道氣CO2的研究［1，2］已顯示微藻減排是一種環(huán)境友好的可行方案。

然而，利用微藻直接固定煙道氣CO2也存在一定的局限性。煙道氣中高濃度的CO2和氮硫氧化物直接通入培養(yǎng)液會導致pH急劇下降，進而抑制微藻的生長，導致微藻固碳體系持續(xù)性差。針對煙道氣直接導入引起的培養(yǎng)液酸化問題，人們建立了通過空氣稀釋煙道氣、向培養(yǎng)液中填加中和酸的堿性物質(zhì)和利用pH反饋控制調(diào)節(jié)等方法來降低煙道氣對微藻生長的不良影響［3，4］。但是這些方法的應用不僅增加了該固碳體系的成本，而且均不能從根本上解決煙道氣導入造成的酸性環(huán)境對微藻生長的損害。

培育高抗酸性的微藻藻株或通過調(diào)控技術提高藻種對酸性環(huán)境的適應能力，是一個有效措施。Yue等［5］在電廠附近的水體中分離出一株藻株，在 10% CO2的條件下，生長速率高達 1.17 g/（L·d），且可以在70%的CO2下生存，具有良好的耐酸性。Li 等［6］采用紫外誘變方法對柵藻進行處理，得到一株突變藻株，在12% CO2和0.1 L/（L·min）通氣比條件下，CO2去除率達 67%，顯現(xiàn)出該藻株具有較好的高濃度CO2耐受性。本研究通過對種子藻進行酸馴化和紫外誘導處理，旨在獲得高抗酸性的藻株，從而使得藻株可以在通入煙道氣的酸化條件下生存。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 微藻藻種 實驗用藻種為斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）株系SO-SX-01。該株系是本實驗室從山西一煤電廠附近水體采集的微藻樣品，經(jīng)分離、純化及鑒定所獲得的柵藻，由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 柵藻培養(yǎng)基BG11配方如下：NaNO31 500 mg/L，K2HPO4·3H20 52.5 mg/L，MgSO436.6 mg/L，C6H8O76.6 mg/L，F(xiàn)eC6H5O7NH4OH 6 mg/L，NaEDTA·2H2O 1.1 mg/L，CaCl236 mg/L，NaCO320 mg，H3BO32.86 mg，MnCl2·4H2O 1.81 mg，ZnSO4·7H2O 0.22 mg/L，CuSO4·5H2O 0.08 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.39 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 標準培養(yǎng)條件 將在錐形瓶BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)的200 mL處于對數(shù)生長期的柵藻種子液（1 g/L）接種在裝有700 mL BG11培養(yǎng)基的柱狀玻璃管生物反應器中，接種后藻液濃度為0.2 g/L，培養(yǎng)箱內(nèi)光照強度為8 000 lux，溫度25℃，通氣速率為2 L/min，二氧化碳濃度為2%。

1.2.2 模擬煙道氣酸化條件 實驗采用模擬煙道氣的組分來替代工廠排放的煙道氣。模擬煙道氣中氣體組分及比例：在一個100 L的鋼瓶中裝有15% CO2、300 ppm SO2、100 ppm NO和一定體積的N2（通過N2填充平衡壓力并保證其它氣體濃度）。把模擬的煙道氣通入柱狀玻璃管生物反應器培養(yǎng)基中，測定其pH的變化。

1.2.3 抗性誘導處理 （1）酸馴化處理：分別用不同pH的培養(yǎng)基作為酸化脅迫條件對種子藻進行耐酸性馴化。取預先培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期濃度為1g/L種子藻200 mL 15份，放入250 mL錐形瓶中。用稀硫酸將瓶中培養(yǎng)基pH分別調(diào)至5、4.5、4和3等4個pH梯度，每個pH下培養(yǎng)10 h，每2 h調(diào)節(jié)一次pH。同時設置不進行酸馴化的作為對照，5個組每組設置3個重復。（2）紫外誘導處理：本實驗應用低劑量紫外線處理種子藻，以誘導微藻抗性表達，提高其耐酸性。取對數(shù)生長期的種子藻放在250 mL錐形瓶中，分別放在紫外誘變箱（18 w）紫外處理0、1、5、10、15 min，每組設置3個重復。（3）酸馴化和紫外誘導復合處理：將在pH4.5酸馴化10 h的種子藻，置于紫外誘變箱內(nèi)誘導5 min，同時設置一組未經(jīng)處理的作為對照，每組設置3個重復。將處理后的種子藻接種到裝有培養(yǎng)基的柱狀玻璃管生物反應器中，通入模擬煙道氣進行微藻培養(yǎng)2 d后停止通入煙道氣，用2%濃度的CO2供氣，每天取樣測試培養(yǎng)液pH和微藻生物量。

1.2.4 微藻生物量的測定 精確抽取5 mL藻液在預先稱好的混合纖維素微孔濾膜（使用前用沸水煮3次烘干）過濾洗滌抽干，放在干燥箱中烘干后稱重。

2 結果

2.1 模擬煙道氣導致培養(yǎng)基pH降低及不同初始pH對柵藻生長的影響

將模擬煙道氣通入不含藻的BG11培養(yǎng)基中，檢測培養(yǎng)液pH的變化。如圖1所示，在通入煙道氣后3 h，培養(yǎng)基的pH急劇下降到4.5左右，至15 h時，培養(yǎng)基pH下降穩(wěn)定在3左右。培養(yǎng)液過低的pH嚴重影響微藻生長。造成pH下降的原因正是煙道氣中高濃度的CO2和氮硫氧化物引起的。

圖1 通入模擬煙道氣導致培養(yǎng)液pH變化的曲線

為了研究低pH環(huán)境對于微藻生長的影響，實驗分別把種子藻接種在不同初始pH值的培養(yǎng)基中，測試微藻生長曲線和培養(yǎng)基pH變化曲線。如圖2-A所示，在初始pH4、5和7時，微藻生長在開始培養(yǎng)3 d內(nèi)有差異，但差異未達顯著水平（P＜0.05），生長趨勢基本一致。當 pH值降低為3和3.5時，在開始培養(yǎng)初期，微藻生長就嚴重受阻，與對照差異極顯著（P＜0.01），尤其在培養(yǎng)基起始pH值為3時，微藻在生長的初期（1-4 d）就出現(xiàn)顯著的生長停滯。

圖2-B顯示用不同初始pH培養(yǎng)基培養(yǎng)微藻過程中的pH的變化曲線。在接入種子藻開始培養(yǎng)的4 d內(nèi)，除初始pH3外，其他微藻培養(yǎng)液pH均上升，培養(yǎng)5 d后，培養(yǎng)液pH趨于穩(wěn)定。初始pH3的培養(yǎng)液在培養(yǎng)前4 d內(nèi)，pH基本不變，在第5、6天時，培養(yǎng)液pH迅速提高，而后呈輕微上升趨勢。

2.2 酸馴化提高微藻耐酸性和在低pH條件下起始生長速率

圖3-A顯示，與沒有經(jīng)過酸馴化的柵藻對照相比，經(jīng)酸馴化的柵藻在起始階段能較好適應酸環(huán)境，生長較快，生長延滯期顯著縮短。特別是經(jīng)pH4.5條件酸馴化的柵藻耐酸性和起始生長率最好（表1），生長延滯期僅有1 d，而對照生長延滯期為4-5 d。

圖2 不同初始pH值下柵藻生長曲線（A）和pH變化曲線（B）

進一步檢測經(jīng)不同酸馴化的柵藻在模擬煙道氣（2 d）和2% CO2（9 d）氣體培養(yǎng)條件下，藻液pH值。結果（圖3-B）顯示，與對照微藻培養(yǎng)液pH值相比，酸馴化的柵藻連續(xù)培養(yǎng)可使培養(yǎng)液pH值在培養(yǎng)初期迅速升高；尤其是經(jīng)pH4.5酸馴化的柵藻在培養(yǎng)第4天時，其藻液的pH就提高到6。

酸馴化提高了微藻的耐酸性和在低pH條件下起始生長速率，尤其是經(jīng)過pH 4.5酸馴化的柵藻，生長表型最好（表1），藻液pH回升快，進而促使微藻生物量增加。

2.3 紫外處理誘導微藻耐酸性

圖4顯示不同時間紫外誘導柵藻在設定的培養(yǎng)條件（模擬煙道氣2 d，2% CO2通氣9 d）下的pH變化曲線及生長曲線。經(jīng)過紫外誘導5 min和10 min的柵藻比沒有經(jīng)過紫外誘導的微藻在低pH下生長快（圖4-A），且藻液pH回升也迅速（圖4-B）。表2所示經(jīng)過紫外誘導5 min和10 min的柵藻在生長初期的生長速率高于沒有經(jīng)過紫外誘導的微藻生長速率。經(jīng)過1 min紫外誘導的柵藻的生長情況與對照沒有顯著差異，而經(jīng)過紫外誘導15 min的柵藻沒有生長，可能是由于長時間紫外照射殺死藻細胞。經(jīng)過紫外誘導5 min的柵藻在生長初期平均生長速率最大，對初始低pH環(huán)境適應能力最強。

圖3 不同pH酸馴化下柵藻的生長曲線（A）和培養(yǎng)液pH變化曲線（B）

表1 不同pH酸馴化下柵藻生長初期的平均生長速率

圖4 不同時間紫外誘導下柵藻的生長曲線（A）和pH變化曲線（B）

表2 不同時間紫外誘導的柵藻在設定培養(yǎng)條件下生長初期的平均生長速率

2.4 酸馴化和紫外誘導復合處理對微藻耐酸性影響

為了進一步提高柵藻的耐酸性，本實驗對柵藻進行酸馴化和紫外誘導疊加處理。如圖5所示，經(jīng)過酸馴化和紫外誘導復合處理的柵藻比對照組適應低pH，圖5-A。疊加處理的種子藻在初期培養(yǎng)3 d內(nèi)，就使藻液pH就回升到6（圖5-B）。復合處理的柵藻生長初期的平均生長速率達到0.253 g/（d·L），明顯高于單因子處理的pH4.5酸馴化（0.132 g/（d·L））和紫外誘導5 min（0.092 g/（d·L））的生長速率。表明酸馴化和紫外誘導相結合可以進一步增強柵藻耐低pH培養(yǎng)環(huán)境的能力。

3 討論

用微藻來固定煙道氣中的二氧化碳和氮硫氧化物是一個環(huán)境友好的解決方案。然而，煙道氣通入培養(yǎng)液時，高濃度的二氧化碳和氮硫氧化物會造成培養(yǎng)液的酸化、pH偏低，對微藻生長造成了很大影響。蔣銀莉［7］研究發(fā)現(xiàn)煙道氣通入培養(yǎng)液引起培養(yǎng)液pH下降（小于3.5）的主要原因是其中氮硫氧化物；劉琪［8］以柵藻為材料，接種在初始pH值為3.6的培養(yǎng)基中，接種2-4 d后細胞密度下降60.6%，大部分柵藻細胞褪色；張虎等［9］以小球藻為材料，培養(yǎng)基的pH值在低于7.0，高于9.0，其光合放氧、生長速率、生物質(zhì)產(chǎn)率、總脂含量和產(chǎn)率都顯著降低；吳運東等［10］研究證實胞外碳酸酐酶活性隨著pH的下降而下降，同時PSⅡ光合效率和葉綠素a 合成下降。這些報道與本研究顯示低pH值培養(yǎng)液嚴重阻滯接入微藻起始生長的結果一致。

已有研究顯示，培養(yǎng)液pH的變化與接入微藻的生長快慢存在一定的關系。微藻本身光合作用及其生長可調(diào)節(jié)藻液pH，藻液pH的改變反過來也影響微藻的光合和生長過程。高文濤等［11］發(fā)現(xiàn)微藻光合作用中碳酸酐酶起催化作用，并會產(chǎn)生OH-，產(chǎn)生的OH-被輸送到細胞外，導致藻液pH 升高。本研究也發(fā)現(xiàn)在接入柵藻后，隨著微藻的生長，培養(yǎng)液的pH很快開始上調(diào)，起始pH 3.5的培養(yǎng)基在第3天就上升到pH7左右。如果能提高種子藻的耐酸性和在接入低pH培養(yǎng)基后的起始生長速率，由于微藻的快速生長就可使培養(yǎng)液pH迅速升高至中性pH。反過來中性pH更有利于微藻生長，進一步使微藻培養(yǎng)系統(tǒng)pH調(diào)控能力得以提高和實現(xiàn)高生物量微藻的生產(chǎn)。因此，培育高耐酸性藻種或者通過抗性馴化提高用于規(guī)模化養(yǎng)殖的種子藻耐酸性則是解決培養(yǎng)液酸化的根本有效的途徑［12，13］。

本研究則是通過對種子藻進行抗性馴化處理（酸馴化和紫外誘導）以提高用于規(guī)?；B(yǎng)殖的種子藻耐酸性和在低pH環(huán)境下的起始生長率。供試柵藻藻株本身最適生長pH為7，在pH3.5及以下時，生長嚴重受阻，即耐酸性差。過低的pH（＜pH 3.5）是制約微藻起始生長的主要因素。如果在低pH時，微藻能夠快速生長，培養(yǎng)液pH就可較快地上升至正常生長pH。顯然，提高種子藻耐酸性和在低pH條件下起始生長速率，將有助于克服煙道氣酸化條件對微藻起始生長的嚴重抑制，提高微藻生物量和固碳水平。經(jīng)馴化后，該柵藻藻株的種子藻在接入低pH培養(yǎng)基初期（5 d以內(nèi)）不僅存活率高，而且生長迅速并大量吸收通入培養(yǎng)液中的CO2，進而使藻液pH迅速上調(diào)至正常范圍使微藻生長處于適宜狀態(tài)。經(jīng)過pH 4.5酸馴化后和紫外誘導5 min處理后，供試柵藻適應低pH的能力和起始生長速率顯著提高，在低pH環(huán)境下的生長延滯期大幅縮短。紫外誘導和酸馴化相結合則會進一步提高柵藻的耐酸性平均起始生長速率達0.253g/（L·d），高于單因子pH 4.5酸馴化和紫外誘導5 min 的柵藻平均起始生長速率（0.1322 g/（L·d）和0.092 g/（L·d））。

圖5 酸馴化和紫外誘導疊加下柵藻的生長曲線（A）和pH變化曲線（B）

諸多研究顯示，在抗逆性馴化/鍛煉過程中，植物抗性相關基因被誘導激活表達，相應地細胞生理生化發(fā)生適應性改變。例如，對植物進行脅迫處理，常導致參與抗性反應的DREB轉錄因子的上調(diào)表達，細胞抗氧化酶系統(tǒng)活性增強和一些抗性化合物的積累，楊瑾等［14］氮脅迫下提高了雨生紅球藻細胞內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的含量。因此推測酸馴化和紫外誘導提高微藻耐酸性和起始生長率的分子機理可能源于微藻抗逆性相關基因表達的彈性以及細胞生理生化的適應性變化。經(jīng)過馴化的植物抵御脅迫能力顯著提高，盡管這種獲得的抗性不能遺傳，但也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用的提高農(nóng)業(yè)植物抗逆性的一個有效措施，如董愛玲等［15］通過低溫馴化比未經(jīng)馴化的茄子提高了在低溫脅迫下脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等含量。微藻經(jīng)脅迫馴化處理后，也可提高其抗逆性。例如，饒本強等［16］通過低溫馴化提高了偽枝藻在低溫脅迫下的生物量和生物活性。未來培育高效固碳、高耐酸性、高耐氮硫氧化物以及高生長率的工業(yè)微藻藻株依然是利用微藻直接固定轉化煙道CO2的重要研究領域。

4 結論

本研究從生產(chǎn)應用出發(fā)，以提高種子藻在接入低pH培養(yǎng)基初期（5 d左右）的耐酸性和起始生長率為目標，建立了酸馴化和紫外誘導處理提高種子藻耐酸性和起始生長速率的簡便方法。酸馴化和紫外誘導處理能顯著增強種子藻在接入培養(yǎng)基初期抵御酸性環(huán)境的能力、促使藻液pH迅速上調(diào)至中性和有利于應用煙道氣培養(yǎng)微藻體系正常運轉。

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（責任編輯 朱琳峰）

Acid Domestication and UV Induction Increase Microalgae Tolerance to Acid Stress

SHI Fei-fei CHEN Tong CHENG Wei-lan SONG Cheng-Fei JI Chun-li LI Run-zhi
（Institute of Molecular Agriculture & Bioenergy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801）

Utilization of microalgae for direct fixation of carbon from coal-based flue gas may reduce CO2emissions，and also produce bio-based products with multiple values. However，CO2，NOx and SO2at high concentration in the flue gas always cause excessive acidification of culture medium，leading to severe inhibition of microalgae growth. The present study was conducted to establish a simple and effective method of microalgae domestication for enhancing the microalgae resistance against acid stress and increasing their initial growth rate when inoculated in low-pH medium. The initial growth rate of the acid-domesticated and the UV-treated Scenedesmus reached 0.253 g/（d·L），which was significantly higher than that（0.132 g/（d·L））by only acid domestication at pH4.5 and that（0.092 g/（d·L））of 5-min induction at low-dose of UV radiation in low-pH environment. The more remarkable effects were achieved by combining such acid domestication and UV induction. The domesticated seed algae grew normally in the acidic environment of pH3，but the non-domesticated microalgae growth stopped. The initial growth rate of the domesticated seed algae was 6.6 times higher than that of the non-domesticated microalgae in low-pH environment. The above results revealed that acid domestication and UV induction significantly improved Scenedesmus tolerance against low-pH environment.

Scenedesmus；flue gas；acid domestication；biological carbon reduction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0446

2017-05-30

國家“948”項目（2014-Z39），山西省煤基重點科技攻關項目（FT-2014-01），山西省重點研發(fā)計劃重點項目（201603D312005）

史飛飛，男，碩士研究生，研究方向：能源生物代謝工程；E-mail：805025173@qq.com

李潤植，教授，博士生導師，研究方向：能源生物代謝工程；E-mail：rli2001@126.com