四物合劑通過(guò)TGF-β3蛋白通路干預(yù)順鉑作用顆粒細(xì)胞E2分泌機(jī)制的研究＊

蔡欣悅，趙丕文，唐炳華，楊曉敏，武洪波，崔麗霞，孫麗萍

（北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院北京100029）

四物合劑通過(guò)TGF-β3蛋白通路干預(yù)順鉑作用顆粒細(xì)胞E2分泌機(jī)制的研究＊

蔡欣悅，趙丕文，唐炳華，楊曉敏，武洪波，崔麗霞，孫麗萍＊＊

（北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院北京100029）

目的：通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以順鉑（Cisplatin，CDDP）作為顆粒細(xì)胞損傷因素，觀察四物合劑對(duì)損傷后顆粒細(xì)胞分泌E2分泌水平及其合成關(guān)鍵酶CYP19a1基因表達(dá)水平的干預(yù)情況。方法：取SD大鼠卵巢顆粒細(xì)胞，經(jīng)順鉑作用后給予四物合劑藥理血清干預(yù)，對(duì)不同條件下上清液E2及E2合成關(guān)鍵酶CYP19a1表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：放免法檢測(cè)四物合劑藥理血清干預(yù)細(xì)胞組E2水平與順鉑組相比明顯提升，且加入TGF-β3蛋白通路阻斷劑后E2下降；免疫組化和蛋白印跡結(jié)果顯示四物合劑藥理血清組CYP19a1蛋白表達(dá)水平高于順鉑作用組，在蛋白印跡檢測(cè)中，阻斷劑組較未加阻斷劑組明顯降低。結(jié)論：四物合劑藥理血清能調(diào)節(jié)順鉑作用后的顆粒細(xì)胞E2分泌水平，其作用機(jī)制可能與通過(guò)TGF-β3蛋白通路增強(qiáng)CYP19a1表達(dá)有關(guān)。

四物合劑芳香化酶TGF-β3蛋白通路顆粒細(xì)胞雌激素

四物湯由熟地、當(dāng)歸、川白芍、川芎組成，原方用于治療外傷，腸內(nèi)有瘀血的病癥。后世醫(yī)家多用來(lái)治療血虛、血瘀及出血所致的各種婦科雜病，效果顯著[1]。現(xiàn)代關(guān)于四物湯的藥理學(xué)研究顯示，其組方成分在治療貧血、提高免疫力、子宮雙向調(diào)節(jié)上都有一定的作用[2]。孫海蕓等[3]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四物湯及其中成藥四物合劑對(duì)顆粒細(xì)胞的凋亡有調(diào)整作用，但不能證明有完全修復(fù)作用[4-7]。顆粒細(xì)胞是參與卵巢功能維持的重要生殖細(xì)胞，其數(shù)量及分泌雌激素和孕激素的作用與卵泡發(fā)育密切有關(guān)系，四物湯調(diào)控婦科疾病的機(jī)制可能與此有關(guān)。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，四物湯能夠促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖[8]。E2合成原料為膽固醇，經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體后再由一系列酶催化轉(zhuǎn)化為E2，在這一過(guò)程中P450芳香化酶（Aromatase，CYP19a1）是雌激素生成的限速酶。在卵巢顆粒細(xì)胞中，經(jīng)CYP19a1催化，雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素。TGF-β3受體主要依靠Smad蛋白進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，已有文獻(xiàn)提出TGF-β3-Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)顆粒細(xì)胞分泌E2的水平[9]。本文通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討四物合劑藥理血清通過(guò)TGF-β3信號(hào)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)順鉑作用顆粒細(xì)胞分泌E2分泌水平的效果，以及其可能的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康22-24天雌性SD大鼠，體重50±10 g，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)在23-25℃室內(nèi),自然光照，正常喂養(yǎng)。動(dòng)物飼料均購(gòu)于斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

四物合劑，100 mL/瓶（吉泰安藥業(yè)有限公司，批號(hào)：0703014）；順鉑注射液，10 mg/支（濟(jì)南齊魯制藥，批號(hào)：611048CF）；戊酸雌二醇片，1 mg/片（拜耳醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：195A5）。

1.3 主要試劑

澳洲胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：1300510）；DMEM/F12培養(yǎng)基（英國(guó)GE醫(yī)療生命科學(xué)公司，批號(hào)：AB216498）；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20160627、20160307、S1051、S1052）；蛋白相對(duì)分子質(zhì)量Marker（美國(guó)Thermo公司，批號(hào)：00332484）；ECL超敏發(fā)光液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)：P1010）；芳香化酶兔源一抗（美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：sc30086）；二抗Anti-Rabbit（普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)：C1309）；DAB顯色劑（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20151016）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

MC0-18AIC型CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；LG16-WA型離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司），TS100型倒置顯微鏡（日本NIKON公司）；LX-800型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（日本Epson公司）；5500型凝膠成像分析儀（美國(guó)FLUORCHEM公司）。

2 方法

2.1 卵巢顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)[10]

22-24天雌性SD大鼠6只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1天后每只給予注射孕馬血清促性腺激素（Pregnant Mare Se?rum Gonadotropin，PMSG），48 h后斷頸處死，浸入75%酒精消毒3 min，超凈臺(tái)內(nèi)取雙側(cè)卵巢用預(yù)冷的hank?s液中清洗3次。放入2.7 mL不含血清的培養(yǎng)基中，生物放大鏡下用一次性1 mL注射器針頭刺破卵巢，每個(gè)卵巢穿刺5 min，釋放顆粒細(xì)胞。加入胰酶0.3 mL，吸管吹打懸液數(shù)次，培養(yǎng)箱中消化10 min，每隔3 min震蕩一次。用含血清培養(yǎng)液終止胰酶消化并靜置10 min，取懸液1 000 rpm，離心10 min，去掉上清液，hank? s液吹勻細(xì)胞，1 000 rpm，10 min再離心一次。棄上清，加入0.1 mL10%胎牛血清培養(yǎng)液，取10 uL置血球計(jì)數(shù)板在倒置顯微鏡下觀察顆粒細(xì)胞并計(jì)數(shù)。稀釋至5× 105，置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)或接種于96孔板。

2.2 藥理血清制備[11]

選用22-24天雌性SD大鼠，體重約50 g，隨機(jī)分為正常生理組，雌激素組，四物合劑組，適應(yīng)性喂養(yǎng)1天后分別給予生理鹽水、雌二醇（6μg/天）、四物合劑（0.63 mL/天）連續(xù)灌胃3天，于第4天灌胃后2 h取血清。

2.3 順鉑處理及藥物干預(yù)[12]

細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)11天后，將培養(yǎng)基吸出，加入順鉑培養(yǎng)基（使其終濃度為2.5 μg·mL-1）刺激細(xì)胞；順鉑刺激12 h后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入相應(yīng)的藥理血清（正常、雌激素、四物合劑），干預(yù)24 h，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

2.4 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)步驟

用預(yù)冷的緩沖液清洗細(xì)胞后，加入RIPA裂解液（每106個(gè)細(xì)胞加200 μL）待細(xì)胞完全裂解后，刮下細(xì)胞碎片收集至離心管，12 000 rpm 5 min離心，取上清。BCA試劑盒測(cè)定樣本的蛋白濃度后將蛋白質(zhì)樣品與4倍樣品緩沖液（15 μL＋5 μL），EP管中混合后100℃加熱5 min，蛋白變性后穩(wěn)壓200 V電泳45 min-1 h。PVDF轉(zhuǎn)膜后置于5%的脫脂奶粉制備的封閉液中，室溫下?lián)u床1.5 h封閉。5%脫脂奶粉稀釋一抗，一抗稀釋液封閉4℃孵育過(guò)夜。待第二天一抗孵育結(jié)束，PBST沖洗膜3次，按照說(shuō)明書濃度稀釋二抗，二抗稀釋液中室溫?fù)u床1 h。PBST清洗三次之后進(jìn)行顯影、定影、曝光和掃描，Image J分析條帶灰度值。

2.5 免疫組化

4%多聚甲醛固定，PBS清洗3次后80 μL0.5%tri?tox-100室溫孵育20 min，PBS清洗、3%H2O2去離子水孵育10 min，PBS清洗、滴加試劑A（封閉工作液）室溫孵育10-15 min，傾去，滴加CYP19a1一抗（1：100），37℃孵育3 h，PBS清洗、滴加試劑B（二抗工作液IgG/ Bio），室溫10-15 min，PBS清洗、滴加試劑C（辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液S-A/HRP）室溫孵育，PBS清洗后使用DAB顯色法顯色。每孔隨機(jī)選取6個(gè)視野，200倍和100倍放大拍照，利用Image J檢測(cè)細(xì)胞中陽(yáng)性反應(yīng)顆粒的平均光密度（AverageOptical Density，AOD）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS 9.4對(duì)各組間細(xì)胞上清液的E2水平、CYP19a1的表達(dá)含量作統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用one-way ANOVA和Dunnett?s t檢驗(yàn)兩兩比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以P<0.05作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 四物合劑藥理血清對(duì)順鉑作用顆粒細(xì)胞E2水平分泌的干預(yù)效果

放免法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中上清液E2水平，結(jié)果顯示雌激素藥理血清組水平最高，順鉑作用組最低，且低于四物合劑組和正常生理組（圖1），提示四物合劑藥理血清可以改善顆粒細(xì)胞E2分泌能力。

圖1 四物合劑藥理血清對(duì)CDDP損傷大鼠卵巢顆粒細(xì)胞E2分泌水平的影響

3.2 四物合劑藥理血清通過(guò)調(diào)節(jié)CYP19a1表達(dá)干預(yù)順鉑作用顆粒細(xì)胞E2水平分泌

免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，各組顆粒細(xì)胞中CYP19a1蛋白在胞質(zhì)中均有表達(dá)。由圖2（A）可見(jiàn)生理對(duì)照組中棕黃色陽(yáng)性染色最多，且顏色較深；其次為雌激素組，四物合劑組表達(dá)程度略低于陽(yáng)性組，順鉑作用組蛋白表達(dá)最低，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量最少。利用Image J對(duì)各組圖片進(jìn)行分析，圖2（B）結(jié)果顯示順鉑作用組較生理組相比，陽(yáng)性反應(yīng)顆粒的AOD明顯降低，經(jīng)四物合劑藥理血清干預(yù)后有所上升。Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示順鉑作用顆粒細(xì)胞與生理對(duì)照組相比CYP19a1蛋白表達(dá)水平顯下降，四物合劑藥理血清干預(yù)后上升圖2（C），與之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)相同。

圖2 四物合劑藥理血清對(duì)CDDP損傷大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP19a1蛋白表達(dá)水平的影響

3.3 四物合劑藥理血清通過(guò)TGF-β3調(diào)節(jié)CYP19a1表達(dá)

放免檢測(cè)（圖3）、Western Blot檢測(cè)（圖4）結(jié)果分別顯示，加Smad蛋白通路阻斷劑SB431542后，四物合劑藥理血清干預(yù)順鉑作用的顆粒細(xì)胞E2分泌水平下降、CYP19a1蛋白表達(dá)降低，提示四物合劑藥理血清可能通過(guò)TGF-β3蛋白通路調(diào)節(jié)CYP19a1表達(dá)而影響E2分泌。

圖3 TGF-β3蛋白通路對(duì)四物合劑藥理血清干預(yù)順鉑作用顆粒細(xì)胞E2分泌的影響

圖4 TGF-β3蛋白通路對(duì)四物合劑藥理血清干預(yù)順鉑作用顆粒細(xì)胞顆粒細(xì)胞CYP19a1表達(dá)的影響

4 討論

E2合成原料為膽固醇，在類固醇激素快速合成調(diào)節(jié)蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，StAR）作用下轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，經(jīng)一系列酶催化轉(zhuǎn)化為E2，此過(guò)程中CYP19a1是E2生成的限速酶。TGF-β3超因子家族[13]包括多種結(jié)構(gòu)保守但是功能多樣的因子，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程主要依靠Smad蛋白進(jìn)行[14]。迄今為止，總共發(fā)現(xiàn)的TGF-β3異構(gòu)體在哺乳動(dòng)物卵巢中存在，但其功能不完全相同。已有研究表示，TGF-β3主要定位于顆粒細(xì)胞上，其mRNA含量隨著卵泡直徑的增大而升高[15]，表明其在腔前卵泡和早期有腔卵泡中起重要作用，其中之一就是各種類固醇激素的產(chǎn)生和分泌，如E2。順鉑對(duì)卵巢性激素的分泌和顆粒細(xì)胞、卵泡膜內(nèi)層細(xì)胞的功能均有損傷，通過(guò)改變卵巢組織的穩(wěn)態(tài)內(nèi)環(huán)境，使其產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化損傷。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，順鉑作用于大鼠建立的卵巢早衰模型，其大鼠血清E2降低,卵泡數(shù)減少，閉鎖卵泡增加[16]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察四物合劑藥理血清干預(yù)順鉑作用的卵巢顆粒細(xì)胞E2水平與順鉑模型組相比明顯上升。值得注意的是，TGF-β3能夠在小鼠顆粒細(xì)胞中以劑量依賴的方式顯著的促進(jìn)E2的分泌，此效應(yīng)通過(guò)增強(qiáng)E2合成中的關(guān)鍵限速酶CYP19a1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)[17-19]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中加入外源性TGF-β3細(xì)胞因子和（或）Smad蛋白的阻斷劑SB431542，觀察四物合劑藥理血清干預(yù)順鉑作用顆粒細(xì)胞E2分泌水平的變化，結(jié)果顯示加入阻斷劑組明顯低于未加入阻斷劑組。這一結(jié)果說(shuō)明，在四物合劑藥理血清干預(yù)順鉑作用顆粒細(xì)胞E2分泌過(guò)程中，很有可能通過(guò)TGF-β3-Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起作用。

CYP19a1是E2生成的限速酶，已有研究證實(shí)，TGF-β3能夠通過(guò)Smad途徑促進(jìn)CYP19a1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)E2分泌，而這一過(guò)程是通過(guò)增強(qiáng)CYP19a1的轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)的[20]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四物合劑藥理血清通過(guò)TGF-β3干預(yù)順鉑作用顆粒細(xì)胞E2分泌。免疫組化和Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示順鉑作用顆粒細(xì)胞與生理對(duì)照組相比CYP19a1蛋白表達(dá)水平顯下降，四物合劑藥理血清干預(yù)后上升，同時(shí)在Western Blot檢測(cè)結(jié)果中加入阻斷劑SB431542后，四物合劑藥理血清干預(yù)CYP19a1的蛋白表達(dá)水平與未加入阻斷劑組有明顯差異。

綜上所訴，四物合劑藥理血清能調(diào)節(jié)順鉑作用顆粒細(xì)胞E2分泌水平，其作用機(jī)制可能與通過(guò)TGF-β3蛋白通路增強(qiáng)CYP19a1表達(dá)有關(guān)。該結(jié)果為四物合劑應(yīng)用治療卵巢功能相關(guān)疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，我們將進(jìn)一步探索四物合劑通過(guò)TGF-β3-Smad蛋白通路調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞功能的機(jī)制，為中醫(yī)藥改善卵巢功能，特別是治療卵巢早衰提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of Si-Wu Mixture on Ovarian Granulose Cell Treated with Cisplatin through TGF-β3 Protein Pathway

Cai Xinyue,Zhao Piwen,Tang Binghua,Yang Xiaomin,Wu Hongbo,Cui Lixia,Sun Liping
(School of Life Sciences,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

This study was aimed to investigate the effects of Si-Wu mixture on the secretion of E2and the expression of CYP19a1 gene in granulosa cells after cell injury.Ovarian granulosa cells of SD rats were treated with cisplatin(CDDP). And the expression levels of E2and CYP19a1 were determined by different testing methods.The results showed that the level of E2induced by radioimmunoassay of the Si-Wu group was significantly higher than that of the CDDP group. Meanwhile,the group which added TGF-β3 protein pathway blocker was lower than others.The results of immunohistochemistry and western blotting showed that the expression level of CYP19a1 of the Si-Wu group was higher than that of the CDDP group.In the western blotting,the group which added blocker was significantly lower than the non-blocking group.It was concluded that the pharmacological serum of Si-Wu mixture can enhance the level of E2in CDDP cells through TGF-β3 protein pathway.And the effect is accomplished by the intervention of CYP19a1.

Si-Wu mixture,CYP19a1,TGF-β3 protein pathway,granulosa cells,estrogen

10.11842/wst.2017.04.017

R285.5

A

（責(zé)任編輯：陳寧，責(zé)任譯審：王晶）

2017-02-20

修回日期：2017-03-19

＊國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81673764）基于ERαERβGPER介導(dǎo)分子通路探究四物湯補(bǔ)血調(diào)經(jīng)的最佳配比規(guī)律及分子機(jī)制負(fù)責(zé)人：趙丕

文；北京中醫(yī)藥大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2015 JYB JSMS016）SF-1介導(dǎo)的四物合劑干預(yù)順鉑作用顆粒細(xì)胞E2分泌水平的研究，負(fù)責(zé)人：孫麗萍。

＊＊通訊作者：孫麗萍，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：分子生物學(xué)與中醫(yī)藥防治女性生殖疾病研究。