膈下逐瘀湯對大鼠纖維化肝臟組織硫氧還蛋白系統(tǒng)的影響＊

楊婧，賈彥＊＊，王蔚，戚基萍，劉宏，代巧妹

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室哈爾濱150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院哈爾濱150001）

膈下逐瘀湯對大鼠纖維化肝臟組織硫氧還蛋白系統(tǒng)的影響＊

楊婧1，賈彥1＊＊，王蔚1，戚基萍2，劉宏1，代巧妹1

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室哈爾濱150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院哈爾濱150001）

目的：驗(yàn)證“膈下逐瘀湯抑制大鼠纖維化肝臟組織氧化應(yīng)激的作用是通過增強(qiáng)硫氧還蛋白系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)”這一假說。方法：SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組，正常大鼠+膈下逐瘀湯組、模型大鼠+膈下逐瘀湯組。大鼠免疫性肝纖維化模型通過每周2次每只大鼠腹腔注射豬血清0.5 mL的方法制備。同時(shí)按含生藥每天7.37 g·kg-1的劑量給予膈下逐瘀湯灌胃給藥干預(yù)。采用分光光度法檢測肝臟組織中脂質(zhì)過氧化物（Lipid Peroxidation，LPO）含量、硫氧還蛋白還原酶（Thioredoxin Reductase，TrxR）活性、PCR檢測編碼核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nuclear Factor Erythroid 2-related Factor 2，Nrf2）基因Nfe2l2的表達(dá)，利用Western blot檢測硫氧還蛋白-1（Thioredoxin-1，Trx1）蛋白表達(dá)和Akt磷酸化水平。結(jié)果：與模型對照組大鼠比較，膈下逐瘀湯組大鼠纖維化肝臟組織LPO含量顯著降低，Trx1蛋白表達(dá)和TrxR活性顯著提高，Akt磷酸化水平顯著增加，Nfe2l2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（均P<0.05）。結(jié)論：膈下逐瘀湯增強(qiáng)機(jī)體肝臟硫氧還蛋白系統(tǒng)與其活化Akt-Nrf2信號通路有關(guān)，從而預(yù)防大鼠纖維化肝臟組織氧化應(yīng)激狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為支持假說提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

肝纖維化膈下逐瘀湯氧化應(yīng)激硫氧還蛋白系統(tǒng)核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2

肝纖維化是由病毒性和自身免疫性肝炎、鐵沉積、酒精性肝病和膽汁淤積等病因引起的慢性肝病進(jìn)展至肝硬化的必經(jīng)階段[1]。迄今為止，臨床上尚缺乏特異性針對肝纖維化的有效逆轉(zhuǎn)或阻止其進(jìn)展的藥物[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典方膈下逐瘀湯可以改善實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化，抑制肝星狀細(xì)胞活化和細(xì)胞外基質(zhì)形成[3-5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是肝纖維化形成和肝星狀細(xì)胞活化的重要機(jī)制，抗氧化已成為防治肝纖維化治療的策略之一[6]。為了探究膈下逐瘀湯抗肝纖維化的機(jī)制是否與其抗氧化特性有關(guān)，本研究提出膈下逐瘀湯保護(hù)大鼠纖維化肝臟組織氧化應(yīng)激損傷的作用是通過增強(qiáng)硫氧還蛋白系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)的這一假說。為了驗(yàn)證這一假說，本研究采用豬血清腹腔注射誘導(dǎo)大鼠免疫性肝纖維化模型，觀察了氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，為明確膈下逐瘀湯抗肝纖維化的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購買，為同一批次7周大小雄性60只大鼠，許可證編號：SCXK京2002-0003。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為20℃-23℃；相對濕度45%-55%，按每籠5只飼養(yǎng)，自然光照，正常攝食飲水，環(huán)境安靜，通風(fēng)良好。飼料由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 主要儀器與試藥

Smart Chemi?圖像分析系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）；JY-ZY5和JY-SCZ2電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；Stratagene Mx3005P Real-time PCR儀（Agilent公司）；S1000?Thermal Cycler（美國BIORAD公司生產(chǎn)）；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），XPE504分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

SYBRExScriptTMRT-PCR Kit、總RNA提取試劑RNAiso Reagent（大連寶生物工程有限公司，Cat號分別是：DRR031A、B13031）。Nfe2l2（NM_031789）和GAPDH（NM_017008）基因序列通過美國國立生物技術(shù)中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）庫獲得，用Primer Primier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)Nfe2l2和GAPDH引物。Nfe2l2上游引物5′-CCC AGC ACA TCC AGA CAG AC-3′，下游引物5′-TAT CCA GGG CAA GCG ACT C-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為195 bp；GAPDH上游引物5′-GAC AAC TTT GGC ATC GTG GA-3′，下游引物5′-ATG CAG GGA TGA TGT TCT GG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為143 bp。引物均由生物工程（上海）股份有限公司合成。脂質(zhì)過氧化物檢測試劑盒（Cayman公司，Cat：705002）。硫氧還蛋白還原酶活性分光光度分析試劑盒（BioVision公司，Cat：K763-100）。p-Akt抗體（Santa Cruz公司，Cat：sc-16646-R）；GAPDH抗體、Akt抗體、Trx1抗體（Cell Signaling公司，Cat號分別是：#2118、#4685、#2429）。細(xì)胞漿蛋白與核蛋白抽提試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Cat：P0028）；Super Signal?West Pico Chemiluminescent Substrate（美國Thermo公司，Cat：PH203837）。

豬血清（上海緯群生物技術(shù)有限公司，批號：20081214）；膈下逐瘀湯由五靈脂∶當(dāng)歸∶丹皮∶桃仁∶川芎∶烏藥∶赤芍∶玄胡索∶甘草∶香附∶紅花∶枳殼比例為4∶6∶4∶6∶4∶4∶4∶2∶6∶3∶6∶3組成。各味中藥從齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院購買，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院牛英才研究員鑒定均為正品。按中醫(yī)傳統(tǒng)方法煎煮2次，水煎液濃縮成含生藥1.5 g·mL-1，分裝置于冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥

60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，即正常對照組、模型組、正常大鼠+膈下逐瘀湯組、模型大鼠+膈下逐瘀湯組。以每周2次，每次每只大鼠腹腔注射0.5 mL的NaCl注射液或豬血清，正常對照組、正常大鼠+膈下逐瘀湯組大鼠腹腔注射NaCl注射液，模型組和模型大鼠+膈下逐瘀湯組大鼠腹腔注射豬血清。膈下逐瘀湯按體重給藥，給藥劑量根據(jù)人臨床使用劑量通過每公斤體重占有體表面積相對比值計(jì)算所得。在造模的同時(shí)，正常對照組和模型組大鼠每天連續(xù)灌胃給予生理鹽水，而正常大鼠+膈下逐瘀湯組和模型大鼠+膈下逐瘀湯組大鼠每天連續(xù)灌胃給予膈下逐瘀湯（每天劑量為生藥7.37 g·kg-1），共12周。

1.2.2 分光光度法檢測LPO含量

肝臟組織勻漿取上清，按照Cayman公司LPO檢測試劑盒說明書檢測。

1.2.3 分光光度法檢測TrxR活性

肝臟組織勻漿取上清，按照硫氧還蛋白還原酶活性分光光度分析試劑盒說明書檢測。

1.2.4 Real-time PCR檢測大鼠Nfe2l2 mRNA表達(dá)

采用RNAiso Reagent試劑盒提取肝臟組織總RNA，cDNA合成采用PrimeScript?RT Reagent kit。采用SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒檢測Ct值，Nfe2l2 mRNA表達(dá)的相對定量采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。

1.2.5 Western blot法檢測大鼠肝臟組織Trx1蛋白表達(dá)和Akt磷酸化

蛋白提取試劑盒抽提肝臟組織蛋白。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離肝臟組織蛋白，電泳結(jié)束后再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉/ TBST室溫封閉120 min后，加入一抗4℃孵育過夜，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)、顯影、定影和印跡條帶的積分光密度分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 膈下逐瘀湯預(yù)防了豬血清誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激（圖1）

與空白對照組比較，豬血清組大鼠肝臟組織中LPO含量顯著增加（P<0.05）。與豬血清組比較，豬血清+膈下逐瘀湯組大鼠肝臟組織LPO含量顯著降低（P<0.05）。

2.2 膈下逐瘀湯增強(qiáng)了肝臟組織硫氧還蛋白系統(tǒng)（圖2）

與空白對照組比較，正常大鼠+膈下逐瘀湯組和豬血清+膈下逐瘀湯組大鼠肝臟組織Trx1蛋白表達(dá)和TrxR活性顯著增加（均P<0.05）。豬血清組與空白對照組大鼠肝臟組織Trx1蛋白表達(dá)和TrxR活性無顯著性差異。

2.3 膈下逐瘀湯活化了肝臟組織Akt-核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2信號通路（圖3）

與空白對照組比較，正常大鼠+膈下逐瘀湯組和豬血清+膈下逐瘀湯組大鼠肝臟組織Akt磷酸化水平和Nfe2l2 mRNA表達(dá)顯著增加（均P<0.05）。豬血清組與空白對照組大鼠肝臟組織中Akt磷酸化和Nfe2l2 mRNA表達(dá)無顯著性差異。

3 討論

膈下逐瘀湯是王清任在《醫(yī)林改錯(cuò)》中獨(dú)創(chuàng)的經(jīng)典方劑，具有活血行氣、祛瘀止痛的功效。由桃仁、丹皮、當(dāng)歸、川芎、紅花、赤芍、烏藥、延胡索、五靈脂、枳殼、香附和甘草等12味藥物組成。中醫(yī)理論認(rèn)為，肝纖維化具有瘀血的特征[7]，歸屬于脅痛和癥瘕等病的范疇。越來越多的證臨床研究表明，氣滯血瘀是肝纖維化最主要的證型，貫穿肝纖維化發(fā)病的過程，是肝纖維化最重要的病因之一[8]，血瘀是乙型肝炎病毒等濕熱邪毒引起的重要病理產(chǎn)物[9]。本研究結(jié)果支持了我們的假說，顯示膈下逐瘀湯預(yù)防了豬血清腹腔注射誘導(dǎo)的肝臟組織氧化應(yīng)激，雖然豬血清對硫氧還蛋白系統(tǒng)和Akt-Nrf2信號通路有輕微的影響，但是這種影響沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。膈下逐瘀湯對病理和生理狀態(tài)下的硫氧還蛋白系統(tǒng)和Akt-Nrf2信號通路均具有顯著的增強(qiáng)/活化作用。

圖1 膈下逐瘀湯對大鼠纖維化肝臟組織LPO含量的影響。

本研究采用的豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化與人類肝纖維化的形成原因有一定相似之處，肝纖維化持久且致纖維化的過程中對肝細(xì)胞無損[10]，因此在評價(jià)藥物特別是中藥復(fù)方療效中較化學(xué)中毒性肝纖維化模型有顯著特色和優(yōu)勢[11]。Ge等研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體反復(fù)接受異體血清引起體內(nèi)產(chǎn)生大量的免疫復(fù)合物，進(jìn)而導(dǎo)致Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，誘導(dǎo)臟肝纖維化發(fā)生[12]。我們采用腹腔注射豬血清（每只0.5 mL，每周2次）成功的制備大鼠免疫性肝纖維化模型，VG染色[4]、HE染色[5]和Masson染色[3]；其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔注射豬血清誘導(dǎo)了大鼠肝臟組織大量的膠原沉積。郝瑞春等[13]研究發(fā)現(xiàn)，免疫性肝纖維化大鼠機(jī)體存在氧化應(yīng)激，這與我們的發(fā)現(xiàn)一致，但是腹腔注射豬血清誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的機(jī)制尚不明確，需要將來進(jìn)一步研究。

圖2 膈下逐瘀湯對大鼠纖維化肝臟組織中Trx1蛋白表達(dá)和TrxR活性的影響。

圖3 膈下逐瘀湯對大鼠纖維化肝臟組織中Akt磷酸化和Nfe2l2 mRNA表達(dá)的影響。

肝細(xì)胞比其他細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗氧化功能[14]。Mohammadalipour等[15]研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)致肝損傷的因素可引起活性氧的過量產(chǎn)生和抗氧化能力的減弱，導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)。氧化應(yīng)激參與了肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，肝臟纖維化與氧化應(yīng)激之間的因果關(guān)系受到廣泛的關(guān)注。肝炎病毒能夠誘導(dǎo)活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的產(chǎn)生，ROS能夠活化肝星狀細(xì)胞和導(dǎo)致肝纖維化形成[16]。由于氧化應(yīng)激是肝纖維化發(fā)病的主要機(jī)制之一，減輕氧化應(yīng)激以及增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防御能力的抗氧化治療策略，可能逆轉(zhuǎn)或阻止肝纖維化的發(fā)展。目前在臨床上一些常用保護(hù)肝細(xì)胞的藥物（如水飛薊賓）已經(jīng)在體外發(fā)現(xiàn)有較強(qiáng)的抗氧化活性，具有抗纖維化的潛質(zhì)[17,18]。由于膈下逐瘀湯和肝纖維化方證對應(yīng)，在臨床上治療肝纖維化療效確切[19]。前期研究也發(fā)現(xiàn)膈下逐瘀湯具有抗實(shí)驗(yàn)性肝纖維化作用[3]，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)膈下逐瘀湯的抗氧化活性可能使其預(yù)防肝纖維化的重要機(jī)制。

在研究抗氧化酶的過程中，非酶系統(tǒng)在抗氧化反應(yīng)中的重要作用已逐漸被許多學(xué)者認(rèn)識[20]。硫氧還蛋白是抗氧化非酶系統(tǒng)的重要成員之一，具有強(qiáng)大的抗氧化作用，發(fā)揮著維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，膈下逐瘀湯顯著提高了大鼠纖維化肝臟組織Trx1蛋白表達(dá)和TrxR活性。有趣的是，膈下逐瘀湯同時(shí)也增加了基礎(chǔ)水平的硫氧還蛋白系統(tǒng)，表明膈下逐瘀湯的抗氧化特性與豬血清誘導(dǎo)無顯著相關(guān)。

Nrf2是一種含有一高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，氧化應(yīng)激等外界因素刺激或抗氧化劑等誘導(dǎo)可增加Nrf2轉(zhuǎn)錄和核轉(zhuǎn)位，然后與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合[22，23]，誘導(dǎo)TrxR表達(dá)增高[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，膈下逐瘀湯顯著上調(diào)Nfe2l2 mRNA表達(dá)，從而提高了纖維化肝臟組織中硫氧還蛋白系統(tǒng)。

絲-蘇氨酸激酶Akt通過磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能[25]。多項(xiàng)研究證實(shí)Nrf2是Akt的靶蛋白之一，Akt抑制劑可抑制Nrf2活性[26]。激活的Akt通過調(diào)節(jié)HSC活化、增加Ⅰ型膠原的表達(dá)促進(jìn)肝纖維化的形成[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，膈下逐瘀湯顯著顯著的提高了Akt磷酸化水平。本研究雖然發(fā)現(xiàn)膈下逐瘀湯通過活化Akt-Nrf2信號通路增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，但膈下逐瘀湯調(diào)控Akt-Nrf2信號通路的專屬性需要將來采用基因敲除動(dòng)物模型進(jìn)一步明確，這是本研究的不足之處。

綜上所述，膈下逐瘀湯可能活化Akt-Nrf2信號通路增加硫氧還蛋白系統(tǒng)，抑制纖維化肝臟組織氧化應(yīng)激。

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Effects of Ge-Xia Zhu-Yu Decoction on Hepatic Thioredoxin System in Rats with Hepatic Fibrosis

Yang Jing1,Jia Yan1,Wang Wei1,Qi Jiping2,Liu Hong1,Dai Qiaomei1
(1.Department of Pathology,College of Basic Medicine,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040, China;2.The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China)

This study was aimed to verify the hypothesis that Ge-Xia Zhu-Yu(GXZY)decoction protects liver from porcine serum-induced oxidative stress through the thioredoxin system.SD rats were randomly divided into the blank control group,model group,normal rat+GXZY decoction group,model rat+GXZY group.The rat autoimmune hepatic fibrosis model was induced with porcine serum by intraperitoneal injection(0.5 mL/each rat)twice a week.And GXZY decoction(7.37 g raw material/kg·d)was simultaneously administered daily by gavage.Lipid peroxidation(LPO)levels and thioredoxin reductase(TrxR)activity in liver tissues were determined by the colorimetric method.Polymerase chain reaction(PCR)was used to analyze the transcription factor nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nfe2l2,previously known as Nrf2)mRNA expression.And the western blot was used to analyze the thioredoxin-1(Trx1)protein expression and Akt phosphorylation in the liver.The results showed that compared to the model control group,the GXZY decoction group attenuated porcine serum-induced oxidative stress,as indicated by the LPO level,in liver tissues.Furthermore, GXZY decoction significantly enhanced TrxR activity,Trx1 protein expression,Nfe2l2 mRNA expression,and Akt phosphorylation(all P<0.05).It was concluded that the strong antioxidant properties of GXZY decoction in the porcine serum rat model was due to the enhancement of the hepatic thioredoxin system via activating Akt-Nrf2 signaling pathway.The study results provided experimental evidences for the supporting of this hypothesis.

Hepatic fibrosis,Ge-Xia Zhu-Yu decoction,oxidative stress,thioredoxin ssystem,transcription factor nuclear factor erythroid 2-related factor 2

10.11842/wst.2017.04.025

R285

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：王晶）

2017-04-06

修回日期：2017-04-20

＊國家自然科學(xué)基金委青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81603418）：膈下逐瘀湯干預(yù)循環(huán)miRNA治療非酒精性脂肪性肝纖維化的機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：楊婧。

＊＊通訊作者：賈彥，教授，主要研究方向：中醫(yī)藥防治肝纖維化的基礎(chǔ)研究。