丹皮酚、三七總皂苷聯(lián)合應用對心梗后心室重構(gòu)大鼠心肌組織N F-κB p 65、T N F-α表達的影響*

范彥芳，李前寬，周曉慧，曹 凱

（承德醫(yī)學院，河北 承德 067000）

基礎(chǔ)醫(yī)學

丹皮酚、三七總皂苷聯(lián)合應用對心梗后心室重構(gòu)大鼠心肌組織N F-κB p 65、T N F-α表達的影響*

范彥芳，李前寬，周曉慧，曹 凱△

（承德醫(yī)學院，河北 承德 067000）

目的:探討丹皮酚、三七總皂苷聯(lián)合應用對急性心肌梗死（AMI）后心室重構(gòu)大鼠心肌組織NF-κB p65、tNF-α表達的影響。方法：結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支制備AMI動物模型，丹皮酚組、三七總皂苷組、聯(lián)合用藥（丹皮酚+三七總皂苷）高、低劑量組、卡托普利組大鼠分別給予相應藥物腹腔注射28d。檢測各組大鼠的左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）及左心室內(nèi)壓力最大上升和下降速率（±dp/dtmax），Western blot法檢測心肌組織NF-κB p65、tNF-α蛋白的表達情況。結(jié)果：與模型組比較，用藥組各指標均明顯改善；并且，聯(lián)合用藥組各指標的改善情況明顯優(yōu)于單味藥組，聯(lián)合高劑量組明顯優(yōu)于聯(lián)合低劑量組。結(jié)論：丹皮酚、三七總皂苷聯(lián)合應用能明顯改善心梗后大鼠的心室重構(gòu)，其機制可能與抑制NF-κB p65、tNF-α蛋白表達有關(guān)，且聯(lián)合用藥優(yōu)于單獨用藥。

丹皮酚、三七總皂苷聯(lián)合用藥；心室重構(gòu)；NF-κ B p65；tNF-α

左室重構(gòu)是指急性心肌梗死（AMI）后整個左心室的形態(tài)和大小發(fā)生改變，包括心肌細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)，以及間質(zhì)形態(tài)、結(jié)構(gòu)的改變。AMI發(fā)生后，心肌舒縮能力下降，左心室不能有效排空血液，從而加大室內(nèi)壓力引起室壁擴張和心室形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，導致慢性心衰進而降低患者降低生存率[1]。因此，改善心室重構(gòu)可延緩心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展。丹皮酚（paeonol，Pae）和三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）分別是牡丹皮和三七的主要成分，有研究證實二者有抑制心肌纖維化、改善心室重構(gòu)、保護心血管的作用[2]。本研究旨在探討丹皮酚與三七總皂苷聯(lián)合應用在下調(diào)NF-κ Bp65、tNF-α表達抑制心梗后心室重構(gòu)中是否具有協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料 健康SPF級雄性SD大鼠63只，體重180-220g（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2012-0001）。丹皮酚注射液（寧波天真制藥有限公司，批號20110603），血塞通注射液（主要成分是三七總皂苷，昆明制藥有限公司，批號13CJ27），卡托普利片（開封制藥有限公司，批號H41022498）。兔抗NF-κ B p65、山羊抗tNF-α多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.2 模型制備和分組 采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法制備AMI模型，以心電圖顯示St段弓背向上抬高1/2以上作為AMI模型成功建立的標準[3]；假手術(shù)組10只大鼠僅穿線不結(jié)扎左冠狀動脈前降支。手術(shù)3d后，將成模大鼠隨機分為丹皮酚（Pae）組9只(8mg/kg/d)、三七總皂苷（PNS）組9只(40mg/kg/d)、聯(lián)合低劑量組9只(Pae 4mg/kg/d+ PNS 20mg/kg/d)、聯(lián)合高劑量組9只(Pae 8mg/kg/d+ PNS 40mg/kg/d)、卡托普利組9只（10mg/kg/d）和模型組8只。各用藥組大鼠腹腔注射給予相應的藥物28d，模型組和假手術(shù)組大鼠腹腔注射給予等量生理鹽水28d。

1.3 血流動力學檢測 4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，壓力傳感微導管經(jīng)頸總動脈插入左心室，連接BL-420生物機能實驗系統(tǒng)，穩(wěn)壓后測量左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室內(nèi)壓力最大上升和下降速率（±dp/dtmax）。

1.4 NF-κB p65、tNF-α蛋白表達的檢測 檢測血流動力學指標后注射10% KCl處死大鼠，使心臟停在舒張期，迅速開胸取心臟，-80℃冰箱保存。Western blot法檢測大鼠心肌組織NF-κB p65、tNF-α蛋白的表達：提取心臟總蛋白，BCA法蛋白定量。取50μg總蛋白上樣，12% SDS-PAGE凝膠穩(wěn)壓電泳，冰中130mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，一抗（1:800）室溫搖床孵育2h，二抗（1:5000）室溫搖床孵育2h，ECL發(fā)光液顯影、定影。Quantity One-v4.6.2軟件掃描目的蛋白和β-actin條帶的灰度值，用其比值表示目的蛋白的相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血流動力學指標檢測結(jié)果 模型組大鼠LVSP、±dp/dtmax明顯低于假手術(shù)組，LVEDP明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）。與模型組比較，各用藥組大鼠LVSP、±dp/dtmax明顯升高，LVEDP明顯降低（P＜0.01）；并且，聯(lián)合用藥組各指標的改善情況明顯優(yōu)于單味藥組，聯(lián)合高劑量組明顯優(yōu)于聯(lián)合低劑量組（P＜0.01P,＜0.05）。見附表。

2.2 大鼠心肌組織NF-κB p65、tNF-α蛋白的表達 模型組大鼠心肌組織NF-κB p65、tNF-α蛋白的表達明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）。與模型組相比，各用藥組NF-κB p65、tNF-α蛋白的表達均明顯降低（P＜0.01）；并且，聯(lián)合用藥組NF-κB p65、tNF-α蛋白的表達明顯低于單味藥組（P＜0.01），聯(lián)合高劑量組NF-κB p65、tNF-α蛋白的表達明顯低于聯(lián)合低劑量組（P＜0.05）。見附圖、附表：

附圖 各組大鼠心肌組織NF-κ B p65、TNF-α蛋白的表達

附表 血流動力學指標檢測結(jié)果和大鼠心肌組織NF-κB p65、TNF-α蛋白的表達（±s）

附表 血流動力學指標檢測結(jié)果和大鼠心肌組織NF-κB p65、TNF-α蛋白的表達（±s）

與模型組比較：1)P＜0.01；與Pae組比較：2)P＜0.01；與PNS組比較：3)P＜0.01；與聯(lián)合低劑量組比較：4)P＜0.05

組別nLVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/ms)-dp/dtmax(mmHg/ms)NF-κB p65tNF-α假手術(shù)組10154.85±4.681)4.36±0.351)3573.6±244.651)3096.31±147.151)0.24±0.021)0.93±0.031)模型組8100.78±3.6512.91±0.641328.33±76.93995.92±44.780.91±0.102.13±0.10卡托普利組9140.64±3.961)6.69±0.511)3022.2±75.521)2692.69±113.811)0.40±0.071)1.06±0.051)Pae組9110.23±3.31)10.28±0.631)1592.56±76.461)1342.04±87.991)0.79±0.071)1.79±0.021)PNS組9111.56±1.061)9.88±0.501)1718.07±91.751)1449.81±98.931)0.75±0.061)1.67±0.041)聯(lián)合高劑量組9139.00±3.281)2)3)4)6.01±0.161)2)3)4)2927.75±99.511)2)3)4)2505.43±85.251)2)3)4)0.54±0.051)2)3)4)1.20±0.051)2)3)4)聯(lián)合低劑量組9125.52±2.981)2)3)6.30±0.341)2)3)2403.07±123.311)2)3)2258.6±45.261)2)3)0.65±0.061)2)3)1.57±0.041)2)3)

3 討論

心室重構(gòu)是AMI后心臟為修復已發(fā)生的病理變化改建心室壁的過程，持續(xù)的心室重構(gòu)可使心室壁進行性擴張，從而導致心室功能逐漸衰退，最終發(fā)生心力衰竭而致死亡[4]。核因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)是細胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，以p65二聚體的形式較多見[5]，激活狀態(tài)下誘導炎癥細胞因子tNF-α過表達引發(fā)的炎性反應是心室重構(gòu)發(fā)生發(fā)展的重要機制，tNF-α的過量表達又可以進一步促進NF-кB的活化，進而形成惡性循環(huán)，加速心室重構(gòu)[6-7]。有研究證實，抑制NF-κB的激活降低NF-κB p65、tNF-α的表達，能減輕心肌炎癥損傷引起的心室重構(gòu)，減緩慢性心衰的發(fā)生，提高患者生存質(zhì)量[8]。

本研究顯示，與假手術(shù)組比，模型組大鼠LVEDP、NF -κB p65、tNF-α蛋白的表達顯著升高，LVSP、±dp/dtmax明顯降低，表明大鼠AMI后可能因發(fā)生心室重構(gòu)導致了心功能的下降。用藥組各指標均有不同程度的改善，說明丹皮酚和三七總皂苷均能改善AMI后的心室重構(gòu)，且與單味藥組比較，聯(lián)合用藥組的效果更顯著，聯(lián)合用藥高劑量組比聯(lián)合用藥低劑量組更有優(yōu)勢。

總之，本研究提示，丹皮酚與三七總皂苷聯(lián)合應用改善大鼠心肌梗死后心室重構(gòu)的分子機制可能與抑制NF-κB p65、tNF-α蛋白的表達有關(guān)，且兩藥合用后呈現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。

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[2]聶丹，孫紅丹，時召平，等.丹皮酚、三七總皂苷組方對心肌梗死后心室重構(gòu)大鼠tGF-β/Smads信號通路的影響[J].天津醫(yī)藥，2016，44(4)：449-452.

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EFFECTS OF PAEONOL COMBINED PNS ON NF-ΚB P65 AND TNF-Α EXPRESSION IN CARDIAC MUSCLE OF VENTRICULAR REMODELING RATS AFTER MYOCARDIAL INFARCTION

FAN Yan-fang, LI Qian-kuan, ZHOU Xiao-hui, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the effects of paeonol (Pae) combined Panax Notoginseng Saponins (PNS) on NF-κB p65 and TNF-α expression in cardiac muscle of ventricular remodeling rats after acute myocardial infarction (AMI). Methods: The AMI rats’ model was made by ligating the anterior descending branch of left coronary artery; And then the rats in Pae group, PNS group, Pae+PNS combination low dose group, Pae+PNS combination high dose group and captopril group were intraperitoneally injected with corresponding drug for 28 days. The left ventricular systolic pressure, left ventricular end diastolic pressure, and maximum rise and fall rate of left ventricular pressure of rats in each group were detected; And Western blot was used to detect the NF-κB p65 and TNF-α expression in cardiac muscle of rats. Results: Compared with rats in model group, the indexes of rats in each drug group improved obviously. Moreover, the improvement of indexes of rats in combination group were signifcantly better than single medicine group; especially the combination high dose group. Conclusions: Pae combined with PNS can obviously improve ventricular remodeling of rats after myocardial infarction, the mechanisms maybe relate to inhibit NF-κB p65 and TNF-α expression in cardiac muscle; Moreover, the effects of drug combination is better than single medicine.

Pae combined with PNS; Ventricular remodeling; NF-κB p65; TNF-α

R285.5

A

1004-6879（2017）04-0271-03

2016-10-25）

*河北省自然科學基金項目（C2011406009），河北省教育廳重點項目（ZD20131068）

△ 通訊作者