外源褪黑素對鹽脅迫下獼猴桃幼苗酚類物質(zhì)含量和抗氧化能力的影響

高 帆，夏 惠，袁雪偵，黃守義，劉 繼，梁 東，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學 果蔬研究所，四川 成都 611130； 3.成都市農(nóng)林科學院，四川 成都 611130)

外源褪黑素對鹽脅迫下獼猴桃幼苗酚類物質(zhì)含量和抗氧化能力的影響

高 帆1，夏 惠2，袁雪偵1，黃守義1，劉 繼3，梁 東2，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學 果蔬研究所，四川 成都 611130； 3.成都市農(nóng)林科學院，四川 成都 611130)

以當年生野生美味獼猴桃為材料，采用根灌外源褪黑素(melatonin，MT)的方式處理獼猴桃幼苗，探究外源褪黑素對鹽脅迫下獼猴桃幼苗相對電導率、酚類物質(zhì)(總酚、總黃酮、總黃烷醇)含量以及抗氧化能力(DPPH、ABTS、FRAP)的影響。結(jié)果表明，外源MT預處理可有效緩解獼猴桃幼苗膜脂過氧化程度，降低相對膜透性水平，同時顯著增加總酚和總黃酮含量，提高抗氧化能力。說明MT預處理可以提高獼猴桃的抗鹽性，緩解獼猴桃幼苗在鹽脅迫下所受的部分傷害。

獼猴桃；外源褪黑素；鹽脅迫；酚類；抗氧化能力

土壤鹽漬化對于農(nóng)業(yè)發(fā)展的影響是一個全球性的熱點問題[1]，據(jù)估計目前全世界約有8億hm2的土地受到鹽漬化影響，其中中國約有3 690 萬hm2鹽漬土地，約占可利用土地面積的4.9%[2]。鹽脅迫引發(fā)滲透脅迫、離子脅迫和氧化脅迫，從而加速膜脂過氧化，積累有害物質(zhì)，引起代謝紊亂，嚴重影響植物的生長發(fā)育[3-4]。酚類物質(zhì)的合成途徑能夠響應環(huán)境脅迫，在植物抵抗非生物脅迫方面具有重要作用，通?？勺鳛槟婢诚碌牡诙婪谰€參與活性氧的清除[5-6]。

獼猴桃(Actinidia)屬獼猴桃科、獼猴桃屬，為多年生藤本植物，因其風味佳、營養(yǎng)高而廣受人們青睞，是一種重要的果樹資源[7]。大量資料表明，獼猴桃既不耐離子脅迫也不耐滲透脅迫[8]。因此，研究提高獼猴桃抗鹽性，培育耐鹽獼猴桃，對保證獼猴桃在鹽脅迫下能夠維持正常的生理水平并獲得較為理想的果實產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。

褪黑素(melatonin，MT)是一種由美國科學家Lerner[9]在1958年從牛松果體中提取出來的吲哚類激素，其化學成分為N-乙?；?5-甲氧基色胺。MT可以作為植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)[10-12]，同時還具有抵抗脅迫的生物刺激物質(zhì)的功能，對高溫、低溫、紫外及電離輻射、重金屬和化學污染、生物氧化等生物和非生物脅迫都有一定的抵抗作用[13]。研究表明，MT可緩解鹽脅迫對番茄幼苗的傷害[14]，提高蘋果砧木的耐鹽性[15]，促進鹽脅迫下黃瓜種子的萌發(fā)[16]。目前，有關(guān)獼猴桃耐鹽性的研究已有一些報道[17-18]，但關(guān)于外源MT對鹽脅迫下獼猴桃幼苗酚類物質(zhì)和抗氧化能力的研究還比較少。本試驗以野生美味獼猴桃幼苗為材料，測定外源褪黑素對鹽脅迫下葉片酚類物質(zhì)和抗氧化能力的變化，探明外源MT對獼猴桃酚類物質(zhì)和抗氧化能力的影響機制，為MT應用于獼猴桃在鹽脅迫土地上的生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)與處理

供試材料為2016年1月采于陜西秦嶺的野生美味獼猴桃種子。選取飽滿的種子在800 mg·L-1的赤霉素溶液中浸泡1 d，4 ℃層積60 d，25 ℃/4 ℃(8 h/16 h)變溫處理14 d，之后播入裝有基質(zhì)的穴盤中，放在(25±2)℃的人工氣候室中培養(yǎng)，光暗周期為12 h/12 h。當幼苗長到3葉1心時，選取長勢一致的幼苗移栽到裝有珍珠巖的花盆中，每盆3株。移苗后注意保濕遮陰，澆營養(yǎng)液。

當獼猴桃幼苗長至9～10片葉時，開始進行試驗處理，選擇整齊一致的壯苗分別用0和0.1 μmol·L-1外源MT灌根處理，連續(xù)澆灌5 d后將所有葉片擦拭干凈，進行鹽脅迫處理，共設(shè)置3個處理：(1)對照(清水)；(2)NaCl(100 mmol·L-1)；(3)NaCl(100 mmol·L-1)+MT(0.1 μmol·L-1)，每個處理10盆，重復3次。鹽脅迫處理濃度、MT濃度和試驗處理天數(shù)均根據(jù)預備試驗確定。在鹽處理后0、3、6、9、12 d分別采取根基向上第3～5片真葉，將葉片在液氮速凍后，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于生理指標測定。

1.2 測定項目及方法

相對膜透性參照陳建勛等[19]的方法測定。酚類物質(zhì)參考Zhang等[20]的方法進行提取，總酚含量(TPC)采用略作改動的Folin-Ciocalteu方法[21]進行測定；總黃酮含量(TFC)采用稍有改良的Jia等[22]的方法測定；總黃烷醇含量(TFAC)采用p-DMACA方法[23]進行測定。DPPH清除能力采用Brandwilliams等[24]方法測定；ABTS采用改良后的Re等[25]方法測定；FRAP采用改良后的Benzie等[26]方法測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差(SD)表示，使用SPSS20.0的單因素方差分析和Duncan方法進行顯著性分析，用Pearson 檢驗進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素對鹽脅迫下獼猴桃實生苗葉片相對膜透性的影響

逆境條件下，脅迫因子超過一定的時間或強度，植物就會受到傷害，生物膜是逆境傷害的最直接受害者。生物膜受到損傷后，膜的選擇透過性喪失，細胞內(nèi)電解質(zhì)大量擴散出細胞，測定細胞相對膜透性的變化，能夠反映出逆境脅迫對細胞膜造成的傷害程度。由圖1可知，在NaCl澆灌處理的當天(0 d)，三個處理的獼猴桃幼苗葉片中相對膜透性差異不顯著。隨著鹽脅迫處理時間的延長，對照處理的植株葉片相對膜透性變化不明顯，而NaCl和NaCl+MT處理的獼猴桃葉片中相對膜透性呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢，在鹽脅迫處理9 d時達到最大值。其中，經(jīng)過MT預處理的幼苗相對膜透性顯著低于僅NaCl脅迫處理的幼苗。在NaCl脅迫3～12 d，NaCl+MT處理的相對膜透性較NaCl處理分別降低10.57%、16.09%、11.86%和18.27%。由此可以看出，外源MT預處理能夠保護NaCl脅迫下植物細胞膜的完整性，降低質(zhì)膜的透性，提高植株的耐鹽能力。

圖中不同的字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Data with the different letters indicate the difference is significant (P<0.05). The same as below圖1 外源褪黑素對鹽脅迫下獼猴桃幼苗相對膜透性的影響Fig.1 Effects of exogenous melatonin on electrolyte leakage in kiwifruit seedlings under salt stress

2.2 外源褪黑素對鹽脅迫下獼猴桃葉片酚類物質(zhì)含量的影響

由圖2可知，獼猴桃幼苗未受鹽脅迫時，三個處理的總酚、總黃酮、總黃烷醇含量差異不顯著。隨著鹽脅迫時間的延長，對照組的總酚含量幾乎沒有變化，而NaCl和NaCl+MT處理組的含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，12 d達到最大值，分別增加155.22%和199.84%，且NaCl+MT處理的幼苗含量顯著高于僅NaCl處理的含量。由圖2-B、2-C可知，NaCl和NaCl+MT處理組的總黃酮、總黃烷醇含量變化模式相似。鹽脅迫0～6 d，NaCl和NaCl+MT處理的總黃酮、總黃烷醇含量逐漸下降，總黃酮含量分別減少31.84%和26.45%，總黃烷醇含量分別降低14.86%和10.60%；處理6 d后，總黃酮和總黃烷醇含量逐漸上升；12 d達到最大值，NaCl和NaCl+MT的總黃酮含量與0 d相比分別增長了15.89%和28.87%，總黃烷醇含量分別增加50.26%和51.85%。由此推測，外源MT預處理可以在逆境條件下有效地增加獼猴桃幼苗體內(nèi)總酚和總黃酮含量，以此增加獼猴桃的耐鹽性。

2.3 外源褪黑素對鹽脅迫下獼猴桃葉片抗氧化能力的影響

圖3為在鹽脅迫過程中，三個處理組獼猴桃實生苗葉片抗氧化能力的變化。由圖可知，0 d時三個處理的抗氧化能力差異不顯著。鹽脅迫處理后，NaCl和NaCl+MT處理組的抗氧化能力(DPPH、ABTS、FRAP)均呈先下降后上升趨勢，且NaCl+MT處理組的抗氧化能力稍高于NaCl處理組。處理0～6 d，NaCl和NaCl+MT處理組的DPPH逐漸下降，較處理前分別降低了7.06%和4.46%，ABTS和FRAP也呈下降趨勢。處理6～12 d，NaCl和NaCl+MT的DPPH逐漸上升，但是仍較0 d分別降低了3.51%和0.61%；FRAP同DPPH的變化相似；ABTS在12 d時高于0 d的測定值，分別增加了2.42%和3.02%。由此可以推測，外源褪黑素可以在一定程度上增強獼猴桃體內(nèi)的抗氧化能力，從而提高獼猴桃的耐鹽性。

圖2 外源褪黑素對鹽脅迫下獼猴桃幼苗總酚、總黃酮、總黃烷醇含量的影響Fig.2 Effects of exogenous melatonin on TPC， TFC， TFAC content in kiwifruit seedlings under salt stress

2.4 酚類物質(zhì)與抗氧化能力相關(guān)性分析

獼猴桃幼苗的酚類物質(zhì)含量和抗氧化能力的相關(guān)性分析表明(表1)，所有相關(guān)系數(shù)均為正值，其中總酚和總黃烷醇的相關(guān)系數(shù)達到最高，為0.935。絕大多數(shù)相關(guān)系數(shù)均呈極顯著水平，僅有的幾個不顯著相關(guān)的與總酚和總黃烷醇有關(guān)。3種方法與總黃酮均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，說明獼猴桃幼苗的抗氧化能力主要來自體內(nèi)的總黃酮。此外，DPPH法、ABTS法和FRAP法測定抗氧化能力間相關(guān)系數(shù)均為0.746以上，并呈極顯著正相關(guān)。同時，獼猴桃幼苗總酚、總黃酮和總黃烷醇含量之間均呈極顯著相關(guān)。

圖3 外源褪黑素對鹽脅迫下獼猴桃幼苗抗氧化能力(DPPH、ABTS、FRAP)的影響Fig.3 Effects of exogenous melatonin on DPPH， ABTS， FRAP assays in kiwifruit seedlings under salt stress

表1 酚類物質(zhì)與抗氧化能力相關(guān)性分析

Table 1 Relation coefficients among the level of phenols and antioxidant activity in kiwifruit seedlings

指標Index總酚Totalphenols總黃酮Totalflavonoids總黃烷醇TotalflavanolsDPPH值DPPHvalueABTS值A(chǔ)BTSvalueFRAP值FRAPvalue總酚Totalphenols1總黃酮Totalflavonoids0676??1總黃烷醇Totalflavanols0935??0766??1DPPH值DPPHvalue01500610??02401ABTS值A(chǔ)BTSvalue0538??0760??0662??0644??1FRAP值FRAPvalue01330588??02090843??0746??1

*在0.05水平上顯著相關(guān)；**在0.01水平上顯著相關(guān)。

*denote significance at the level of 0.05， ** denote significance at the level of 0.01.

3 討論

鹽脅迫對植物生長的影響是涉及滲透脅迫、離子毒害和礦物質(zhì)營養(yǎng)虧缺的復雜癥狀的綜合表現(xiàn)，對植物組織和器官的生長發(fā)育具有顯著的影響[27]。細胞膜是植物細胞隔離原生質(zhì)體與外界環(huán)境的重要組織，具有控制細胞與外界環(huán)境的物質(zhì)交換和信息傳遞的作用。正常情況下，植物細胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，而當植物處于鹽脅迫時，體內(nèi)會產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，造成植物膜相變和膜結(jié)構(gòu)破壞，質(zhì)膜及各種細胞器的內(nèi)膜系統(tǒng)會膨脹或破損[28-29]。本研究結(jié)果顯示，鹽脅迫灌根條件下，獼猴桃幼苗葉片中相對膜透性顯著上升，且隨鹽脅迫時間延長，均維持較高水平，說明細胞受損，膜透性增大，細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，細胞物質(zhì)交換平衡被破壞，而經(jīng)過MT預處理的獼猴桃幼苗的相對膜透性的增幅顯著降低。這可能是由于MT預處理有效地降低了ROS的產(chǎn)生速率，緩解了活性氧對細胞膜的傷害[30-31]，另外，褪黑素具有一定抗氧化能力和在細胞培養(yǎng)中被證明具有保護膜(細胞核和血漿膜)完整性的功能[32-33]。

酚類是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，在植物體內(nèi)除具有重要的生理學作用和形態(tài)學作用外，還具有抵抗病原體和外來傷害的作用[34-36]。Jaakola等[37]研究證實，酚類物質(zhì)具有在逆境下作為抗氧化劑清除活性氧的作用；Selmar等[38]也發(fā)現(xiàn)干旱通常會引起酚類物質(zhì)的積累；Nakabayashi等[39]在最新的研究中發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質(zhì)的過量積累提高了擬南芥的抗氧化和抗旱能力；Yuan等[40]也發(fā)現(xiàn)，MYB8轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱及抗鹽能力顯著提高，主要是因為其提高了煙草的類黃酮物質(zhì)的代謝水平；Walia等[41]發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫會導致酚類合成途徑中基因水平的上調(diào)，對鹽脅迫敏感的品種上調(diào)幅度大于抗鹽品種。本試驗結(jié)果表明，鹽脅迫會使獼猴桃體內(nèi)總酚、總黃酮、總黃烷醇含量先下降后升高，且在9～12 d時顯著升高，可能是酚類物質(zhì)作為第二道防線開啟了自我保護機制，而外源褪黑素的加入進一步促進了總酚、總黃酮、總黃烷醇含量增加。由此推測，外源MT預處理可以有效提高獼猴桃幼苗體內(nèi)總酚、總黃酮、總黃烷醇含量，從而增強清除活性氧能力，抑制脂質(zhì)過氧化，提高獼猴桃耐鹽性。

近幾年，對于抗氧化能力的測定有很多方法，其中以清除自由基為基礎(chǔ)測定抗氧化能力的方法，是目前最流行、使用最多的方法。自由基清除能力(DPPH法)是1950年[42-43]提出的，DPPH(1，1′-二苯基苦基苯肼)是一種穩(wěn)定的自由基，與具有供氫能力的抗氧化劑(如酚類)反應時，溶液顏色變淺。脂質(zhì)過氧化抑制力[44](ABTS法，342 nm)在有供氫能力的抗氧化劑(如酚類)存在時，藍綠色的自由基陽離子ABTS·十與之反應，變成無色的ABTS。鐵離子還原抗氧化劑能力[45](FRAP法)是最常用的一種測定還原能力的方法，從而通過測定被測物將Fe3+還原成Fe2+的能力來反映它們的抗氧化能力。本研究結(jié)果表明，NaCl處理下通過DPPH、ABTS、FRAP三種方法測定的獼猴桃抗氧化能力結(jié)果均呈先下降再上升的趨勢，而外源褪黑素預處理可以緩解這種脅迫，提升了獼猴桃體內(nèi)的抗氧化能力，從而提高獼猴桃的耐鹽性。

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(責任編輯 張 韻)

Effects of exogenous melatonin on phenolic substance content and antioxidant ability of kiwifruit seedlings under salt stress

GAO Fan1， XIA Hui2， YUAN Xuezhen1， HUANG Shouyi1， LIU Ji3， LIANG Dong2，*

(1.CollegeofHorticulture，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.InstituteofPomologyandOlericulture，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 3.ChengduAcademyofAgricultureandForestrySciences，Chengdu611130，China)

One-year-old wildActinidiadeliciosaseedlings were treated with exogenous melatonin solution in order to investigate the effects of electrolyte leakage， phenolic substances (total phenolics， total flavonoids and total flavanols) and antioxidant activities were evaluated， including ABTS.+radical scavenging capacity (ABTS)， DPPH radical scavenging capacity (DPPH)， and iron ion reducing ability (FRAP).The results showed that the relative electrolytic leakage was reduced， total phenolics and total flavonoids were significantly increased and antioxidant ability was improved. This suggested that MT pretreatment alleviated the damage by salt stress in kiwifruit seedlings， and thus improved the salt resistance.

kiwifruit; exogenous melatonin; salt stress; phenolic; antioxidant ability

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.07.12

2017-03-03

2016年學科建設(shè)雙支計劃；2016年四川農(nóng)業(yè)大學科研興趣培養(yǎng)項目(ky2016115)

高帆(1993—)，女，河南安陽人，碩士研究生，主要從事果樹生物技術(shù)研究。E-mail: 18227551150@163.com

*通信作者，梁東，E-mail: liangeast@sina.com

S663.9

A

1004-1524(2017)07-1144-07

浙江農(nóng)業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(7): 1144-1150

高帆，夏惠，袁雪偵，等. 外源褪黑素對鹽脅迫下獼猴桃幼苗酚類物質(zhì)含量和抗氧化能力的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2017，29(7)： 1144-1150.