基于一測多評法測定甘肅紅芪中4種黃酮類成分

楊秀娟，邵晶，楊志軍，吳國霞，寧艷梅，張金保，黑生瑞

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

論著·中藥研究與開發(fā)

基于一測多評法測定甘肅紅芪中4種黃酮類成分

楊秀娟1，2，邵晶1，2，楊志軍1，2，吳國霞1，寧艷梅1，2，張金保1，2，黑生瑞1

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

目的 建立甘肅紅芪中芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素 4 種黃酮類成分的一測多評法，驗證該方法在紅芪質(zhì)量評價中應(yīng)用的準(zhǔn)確性及可行性。方法 以毛蕊異黃酮為內(nèi)標(biāo)，分別建立毛蕊異黃酮與芒柄花苷、金雀異黃酮、芒柄花素的相對校正因子，計算紅芪中毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的含量，實現(xiàn)一測多評。結(jié)果 各相對校正因子重復(fù)性良好，一測多評法測定結(jié)果與外標(biāo)法無顯著差異。結(jié)論 以毛蕊異黃酮為內(nèi)標(biāo)，同時測定芒柄花苷、金雀異黃酮、芒柄花素的一測多評法可用于紅芪的定量分析。

一測多評；紅芪；芒柄花苷；毛蕊異黃酮；金雀異黃酮；芒柄花素；相對校正因子

紅 芪 是 豆 科 植 物 多 序 巖 黃 芪 Hedysarum polybotrys Hand. Mazz.的干燥根[1]，其性微溫、味甘，歸肺、脾經(jīng)，具有補氣升陽、利水消腫、生津養(yǎng)血等功效。紅芪根皮為紅棕色，因此而得名，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，南北朝時期梁代陶弘景在《本草經(jīng)集注》中描述：“有赤色者，可作膏貼，俗方多用，道家不須?！奔t芪現(xiàn)主要分布在甘肅隴南、天水、定西等地區(qū)，一般被認為是甘肅的道地藥材，為十大隴藥之一[2]。目前，較多學(xué)者就紅芪化學(xué)成分及其藥理活性展開了大量研究，發(fā)現(xiàn)紅芪中含有較多的活性物質(zhì)如黃酮[3]、皂苷[4]、生物堿、氨基酸、有機酸、甾醇、多糖[5]、微量元素[6]等，且藥理作用廣泛，主要包括提高免疫能力、強心利尿、抗自由基、抗病毒等[7]。

一測多評法是利用中藥有效成分之間的內(nèi)在函數(shù)和比例關(guān)系測定1個成分而實現(xiàn)多個成分的同步測定，該方法已在枳實、大黃、淫羊藿等藥材的含量測定中得到應(yīng)用[8-11]，2015 年版《中華人民共和國藥典》收載了黃連等藥材的一測多評法含量測定。本研究采用一測多評法測定紅芪中4種黃酮類成分，為紅芪藥材多指標(biāo)定量測定提供全新的分析模式。

1 儀器與試藥

Agilent1260 高效液相色譜儀（DAD 檢測器，四元泵），Hanbon Sci. &Tech.Phecda C18 色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），電子天平（AL104，梅特勒-托利多儀器上海有限公司），恒溫水浴鍋（HH-S，金壇市大地自動化儀器廠），超聲清洗儀（KQ-250，昆山市超聲儀器有限公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（SFG-02B，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）。

芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素對照品（批號分別為 PY150816RM、PY150826RM、PY150814RC、PY150822YG，南京普怡生物科技有限公司，純度均為 99%），乙腈為色譜純，甲醇、磷酸等其他試劑均為分析純。

11批紅芪樣品分別采自甘肅武都、隴西、甘谷、武山等 10個產(chǎn)地，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李成義教 授 鑒 定 為 豆 科 植 物 多 序 巖 黃 芪 Hedysarum polybotrys Hand. Mazz.的干燥根，樣品來源見表 1。

表 1 11 批紅芪樣品產(chǎn)地及采集時間

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

精密稱取芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素對照品適量，加甲醇分別制成 0.481 3、0.492 0、0.130 5、0.452 6 mg/m L 的對照品溶液。取上述溶液適量于同一量瓶中，制得混合溶液，即濃度分別為0.048 13、0.049 20、0.003 95、0.045 26 mg/m L 的對照品貯備液 A。精密量取對照品貯備液 A 1 m L，置于10 m L 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液B。

2.2 供試品溶液制備

取紅芪樣品粉末（過 2 號篩）約 3 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇 25 m L，稱定質(zhì)量，加熱回流 1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：Hanbon Sci. &Tech.Phecda C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 m in，10%～15%B；10～15 m in，15%～25%B；15～35 m in，25%～45%B；35～45 m in，45%～60%B）；柱溫：25 ℃；波長：254 nm；進樣量：10 μL；流速：1 m L/m in。記錄 45 min 色譜圖，供試品和對照品分離情況良好，見圖1。

圖 1 紅芪中 4 種黃酮類成分 HPLC 圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取上述對照品貯備液 A、B，分別進樣 2.5、5、10、15、20 μL，分析記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品進樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各對照品的回歸方程和線性范圍（見表 2）。結(jié)果表明，芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素4種成分在各自的范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

表 2 4 種黃酮類成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，計算芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的峰面積 RSD 分別為 2.14%、1.46%、2.34%、1.70%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一紅芪樣品（GS-2）粉末 6 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件分別進樣測定。結(jié)果芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的含量分別為 0.108 9、0.025 5、0.003 6、0.117 0 mg/g，各成分含量 RSD 分別為 3.77%、0.82%、2.56%、0.96%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一紅芪（GS-2）供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、12、24 h 按“2.3”項下色譜條件進樣 10 μL，測得芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的峰面積 RSD 分別為3.44%、0.93%、2.17%、1.34%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取已測定的樣品6份，每份 1.5 g，分別加入一定量對照品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件分別進樣測定，結(jié)果芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的平均加樣回收率分別為 98.81%、102.54%、101.87%、98.28%，RSD 分別為 2.08%、1.84%、2.38%、2.32%，表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.5 相對校正因子的測定

2.5.1 待測成分相對校正因子的計算 取混合對照品溶液，按“2.3”項下條件進行測定，分別進樣 1、2.5、5、10、15 μL，以毛蕊異黃酮為內(nèi)標(biāo)，分別計算芒柄花苷、金雀異黃酮、芒柄花素的相對校正因子（fR）。計算公式：fR＝fs/i＝（As×Ci）/（Ai×Cs），式中 As為內(nèi)標(biāo)峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)濃度，Ai為待測成分對照品峰面積，Ci為待測成分對照品濃度。結(jié)果見表3。

2.5.2 相對校正因子重現(xiàn)性考察 分別采用Hanbon Sci. &Tech.Phecda C18 和 Angilent XDB 色譜柱，分別考察了 Angilent 1260 和 Angilent 1200 液相色譜系統(tǒng)對校正因子的影響，結(jié)果各成分相對校正因子的重現(xiàn)性良好（RSD＜5%），見表 4。

表 3 4 種黃酮類成分相對校正因子考察結(jié)果（n＝3）

表 4 4 種黃酮類成分相對校正因子重現(xiàn)性考察（n＝3）

2.5.3 相對校正因子的確定 根據(jù)《一測多評法建立的技術(shù)指南》[12]，綜合影響校正因子的因素，取各次試驗結(jié)果平均值，最終確定芒柄花苷、金雀異黃酮、芒柄花素的相對校正因子分別為 1.15、0.72、0.75。2.5.4 待測成分色譜峰的定位 計算在不同色譜儀器或不同色譜柱中各待測成分色譜峰與毛蕊異黃酮色譜峰的相對保留時間（rk/s）。rk/s＝TR（k）/TR（s），式中k為待測組分，s為對照物。利用相對保留時間定性，對各待測成分進行定位。結(jié)果表明相對保留時間的波動較小，其 RSD 均小于 5%，見表 5。

表 5 不同色譜儀器中 4 種黃酮類成分的相對保留時間（n＝3）

2.6 一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較

分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定 11 批樣品，采用外標(biāo)法和一測多評法計算紅芪中芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素含量，結(jié)果見表 6。并對一測多評法與外標(biāo)法得到的量值進行比較，2種方法所得值的偏差均在 5%以內(nèi)，由此說明一測多評法用于紅芪藥材及其炮制品的多成分質(zhì)量評價研究是可行的。

表 6 紅芪樣品中 4 種黃酮類成分一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果比較（mg/g，n＝2）

3 討論

毛蕊異黃酮對照品在市場上可購得，且試驗發(fā)現(xiàn)，以毛蕊異黃酮為內(nèi)標(biāo)，在不同色譜柱和不同色譜儀上保留時間差值波動最小，均在 5%以內(nèi)。而若以芒柄花苷為內(nèi)標(biāo)，則保留時間差值的波動均大于 5%，不宜進行待測組分色譜峰的定位。故最終確定以毛蕊異黃酮為內(nèi)標(biāo)，建立紅芪中4種黃酮類成分的一測多評方法。

在色譜條件的考察過程中，我們對檢測波長、流動相組成、樣品提取方式、提取溶劑及提取時間均做了考察。經(jīng) HPLC-DAD 檢測器全波長掃描，綜合考慮，優(yōu)選出芒柄花苷、毛蕊異黃酮、金雀異黃酮、芒柄花素的檢測波長為 254 nm；通過考察甲醇及乙醇2 種溶媒及提取時間 30 m in、1 h、2 h，優(yōu)化出最佳提取條件為紅芪用甲醇回流提取 1 h。

紅芪主產(chǎn)于甘肅武都、宕昌、甘谷、武山、隴西等地。本試驗采集了甘肅 10 個產(chǎn)地 11 批紅芪藥材，用校正因子法從一測多評的角度闡明了主要成分間的相互關(guān)系，實現(xiàn)在對照品短缺的情況下進行多指標(biāo)成分含量測定。結(jié)果表明，一測多評法與外標(biāo)法實測值間沒有顯著差異，說明建立的校正因子具有較好的可信度。采用一測多評法對紅芪進行更全面的質(zhì)量控制可為深入開發(fā)利用紅芪資源提供科學(xué)依據(jù)。

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Content Determ ination of Four Flavonoids in Hedysari Radix in Gansu Province Based on Quantitative Analysis of M ulti-components by Single M arker

YANG Xiu-juan1,2, SHAO Jing1,2, YANG Zhi-jun1,2, WU Guo-xia1, NING Yan-mei1,2, ZHANG Jin-bao1,2, HEI Sheng-rui1(1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese and Tibetan Medicine of Gansu Province, Lanzhou 730000, China)

Objective To establish a method for simultaneous determination for the contents of four flavones (ononin, calycosin, genistein and formononetin) of Hedysari Radix in Gansu Province With quantitative analysis of multi-components by single-marker (QAMS); To prove its feasibility and accuracy. Methods Calycosin was taken as internal standard substance. Relative correction factors (RCF) of ononin, genistein and formononetin to calycosin were established. The contents of ononin, calycosin, genistein and formononetin were determined to realize QAMS. Results RCF was With good repeatability. The results of QAMS were consistent With the results of the external standard method. Conclusion The method that determ ines the contents of ononin, genistein and formononetin With calycosin as internal standard substance, can be used for quantitative analysis of Hedysari Radix.

quantitative analysis of multi-components by single marker; Hedysari Radix; ononin; calycosin; genistein; formononetin; relative correction factor

R284.1

A

1005-5304(2017)08-0066-04

2016-10-20）

（

2016-11-05；編輯：陳靜）

甘肅省財政廳高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費項目（BH-2013-20）；甘肅省高等學(xué)?；究蒲谢鹳Y助項目（BH2012-020）；甘肅省高等學(xué)?？蒲许椖浚?016B-054）；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中青年科研基金項目（2305016601）

楊志軍，E-mai l：yangzhi jun1971@yeah.net

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.015