miR-21對運動性右室心肌纖維化發(fā)生的影響

饒志堅常蕓王世強

1國家體育總局體育科學研究所（北京 100061）2上海體育學院運動科學學院3湖南工業(yè)大學體育學院

miR-21對運動性右室心肌纖維化發(fā)生的影響

饒志堅1，2常蕓1王世強3

1國家體育總局體育科學研究所（北京 100061）2上海體育學院運動科學學院3湖南工業(yè)大學體育學院

目的：研究在長期大強度運動引起的右室心肌纖維化中miR-21表達水平的變化，探討miR-21在運動性心肌纖維化中的作用。方法：72只雄性SD大鼠，隨機分為安靜對照組（Sed，n=24）、中強度運動組（ME，n=24）和大強度運動組（IE，n=24），每組按照訓練周期又分為8周、12周和16周，各8只。安靜對照組自由活動，中強度組和大強度組分別以速度15.2 m/min、坡度5°和速度28 m/min、坡度10°的條件每天運動1 h，每周運動5天。各組最后一次運動結(jié)束24小時后，下腔靜脈采血并處死，迅速分離心臟取右心室。天狼星紅染色測定右心室的膠原容積分數(shù)（CVF）；免疫熒光檢測Ⅰ膠原蛋白（ColⅠ）的含量；RTPCR檢測miR-21的表達水平。結(jié)果：12周（P<0.05，P<0.05）和16周（P<0.01，P<0.01）大強度運動后大鼠右室心肌膠原容積分數(shù)顯著高于安靜對照組與中強度運動組；與安靜對照組和中強度運動組比，12周（P<0.01，P<0.01）和16周（P<0.01，P<0.01）大強度運動使右室Ⅰ膠原蛋白的含量顯著增多。與安靜對照組相比，8周、12周和16周大強度運動都可使大鼠miR-21表達水平顯著升高（P<0.01、P<0.05和P<0.05），且在16周時miR-21的表達水平與Ⅰ膠原蛋白的含量正相關(guān)（r=0.443，P=0.03）。結(jié)論：長期大強度運動后右室心肌纖維化與miR-21表達水平增高有關(guān)，miR-21是潛在的運動性心肌纖維化的新生物標志物和干預靶點。

運動；右心室；纖維化；miR-21；膠原蛋白

有研究表明心肌纖維化是由于組織損傷后成纖維細胞生成過量的細胞外基質(zhì)而引起的[1]。心肌纖維化是許多慢性心血管疾病的最終階段，以白細胞浸潤、心肌細胞凋亡和細胞間質(zhì)中成纖維細胞增值及細胞外基質(zhì)堆積為特征[2]。目前，盡管取得了一些研究進展，但心肌纖維化的具體病理生理過程還不甚明了，因而其臨床干預方案極其有限。

研究證實長期大強度耐力運動可導致心肌纖維化，許多細胞和分子參與了運動性心肌纖維化的形成過程，包括促纖維化因子和促纖維化生長因子的基因表達增多，炎癥細胞浸潤增多及成纖維細胞的增殖等[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs（miRNAs）參與了許多病理生理過程的調(diào)控，多種疾病的發(fā)生和發(fā)展與miR?NAs表達紊亂有關(guān)，如癌癥、糖尿病和心血管疾病等[4]。

miRNAs是一種非編碼小RNA，長度大約為22nt。它可結(jié)合到靶基因mRNA的3’-UTR，通過抑制靶基因mRNA的翻譯或降解靶基因mRNA來發(fā)揮它的調(diào)控作用。大量實驗數(shù)據(jù)表明病理條件下，包括心肌纖維化，miRNAs的表達水平會發(fā)生顯著變化，主要包括miR-21、miR-29、miR-192和miR-200[5]。其中，研究人員對miR-21的研究興趣越來越大，尤其是在癌癥和心血管疾病方面[6]。幾乎所有類型的癌癥都伴隨著miR-21表達水平的顯著升高，miR-21可促進癌癥細胞的增殖、遷移和存活，因此被認為是onco-miR[7，8]。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)組織損傷后miR-21是所有發(fā)生變化的miRNAs中變化最大的，在組織修復過程中miR-21持續(xù)高表達，且miR-21參與了多種組織的纖維化過程[9-11]。已有報道[12-14]在心肌梗死和缺血再灌注誘導心肌纖維化模型中，miR-21的表達水平升高，但miR-21在運動性心肌纖維化中的表達變化還不明確。因此，本實驗對此進行探索性研究。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

72只8周齡雄性SD大鼠，體重為220±8g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXX（京）2012-0001。所有大鼠均以嚙齒類動物普通飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)于國家體育總局體育科學研究所AB?SL-3級動物房，室溫為20°C～25°C，相對濕度為55%～70%，飼養(yǎng)室晝夜循環(huán)為12/12（7:00～19:00）。

1.2 分組與運動方案

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，進行1周的適應(yīng)性跑臺訓練，15 min／天，速度為15 m／min。隨后將大鼠隨機分為安靜對照組（Sed，n＝24）、中強度運動組（ME，n＝24）和大強度運動組（IE，n＝24），每組按照訓練周期的長短又分為8周、12周和16周。運動強度參照Bedford方案，中強度組為：速度15.2 m／min，坡度5°（約等于58.4%±1.7%VO2max）；大強度組為：坡度10°，先以15 m／min的速度跑5 min，然后在隨后的5 min內(nèi)逐漸增到28 m／min（約等于81.0%±3.5%VO2max），運動頻率為5天／周，1次／天，1小時／次。安靜對照組大鼠自由活動。

1.3 取材

各組在訓練8周、12周和16周運動結(jié)束后24小時后分別進行取材，每組8只。麻醉后快速分離心臟取右心室，一部分浸入4%的多聚甲醛固定液，用于石蠟包埋進行天狼星紅染色；一部分?80℃保存用于免疫熒光蛋白檢測和RT-PCR。

1.4 天狼星紅染色

天狼星紅染色及膠原容積分數(shù)（collagen volume fraction，CVF）的計算方法參考本課題組之前的方案[15]。

1.5 免疫熒光蛋白檢測

采用免疫熒光技術(shù)檢測Ⅰ膠原蛋白（CollagenⅠ，ColⅠ）含量，檢測方法參考本課題組之前的方案[16]。

1.6 RTT--PPCCRR檢測mmiiRR--2211的表達水平

采用Trizol法提取右心室總RNA，采用TAKARA公司的Mir-X miRNA First-Strand Synthesis試劑盒，按操作說明書添加試劑，然后37℃反應(yīng)60 min，之后85℃反應(yīng)5 min以使酶失活。最后添加90 μl的去離子水，得到100 μl的cDNA用于后面的熒光定量。熒光定量采用TAKARA公司的SYBR Premix Ex Taq，以U6為內(nèi)參，miR-21和U6分別按操作說明書添加試劑，引物信息見表1，反應(yīng)條件為預變性90℃30s，PCR反應(yīng)40個循環(huán)95℃5 s、60℃31 s。得到的數(shù)據(jù)采用2–ΔΔCt的方法計算miR-21的相對表達量。

表1 miR-21引物信息

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 22.0進行分析處理，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，同一時間點組間比較用單因素方差分析，P<0.05有顯著性差異，P<0.01有非常顯著性差異。采用GraphPad Prism 6.0和SPSS作圖。

2 研究結(jié)果

2.1 長期大強度運動可導致右心室心肌纖維化

天狼星紅染色結(jié)果如圖1所示，根據(jù)右心室天狼星紅染色的結(jié)果計算膠原容積分數(shù)，結(jié)果如圖2所示，長期中強度運動后右心室膠原容積分數(shù)與安靜對照組相比沒有顯著性差異；與8周安靜對照組和8周中強度運動組相比，8周大強度運動后右心室膠原容積分數(shù)有增加的趨勢，但沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與12周安靜對照組和12周中強度運動組相比，12周大強度運動后右心室膠原容積分數(shù)顯著增加（P<0.05）；與16周安靜對照組和16周中強度運動組相比，16周大強度運動后右心室膠原容積分數(shù)顯著增加（P<0.01）。

2.2 長期大強度運動上調(diào)Ⅰ膠原蛋白含量

各組大鼠右心室Ⅰ膠原蛋白含量如圖3所示，中強度運動組與安靜對照組右心室Ⅰ膠原蛋白含量沒有顯著差異。與8周安靜對照組和8周中強度運動組相比，8周大強度運動后右心室Ⅰ膠原蛋白含量無顯著差異（P>0.05）；與12周安靜對照組和12周中強度運動組相比，12周大強度運動后右心室Ⅰ膠原蛋白含量顯著增加（P<0.01）；與16周安靜對照組和16周中強度運動組相比，16周大強度運動后右心室Ⅰ膠原蛋白含量顯著增加（P<0.01）。

圖1 各組大鼠右心室天狼星紅染色結(jié)果（×400）

圖2 各組大鼠右心室膠原容積分數(shù)

圖3 各組大鼠右心室Ⅰ膠原蛋白含量

2.3 長期大強度運動促使右室mmiiRR--2211表達水平升高

各組大鼠右心室miR-21的相對表達水平如圖4所示，中強度組與安靜對照組右心室miR-21表達水平?jīng)]有顯著差異（P>0.05）；與安靜對照組相比，8周、12周和16周大強度運動后右心室miR-21的表達水平顯著升高（P<0.01、P<0.05和P<0.05）。

圖4 miR-21的相對表達量

2.4 右室mmiiRR--2211表達水平與CCoollⅠ含量呈正相關(guān)

分析miR-21的表達水平與ColⅠ含量的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，16周時miR-21的表達水平與ColⅠ含量正相關(guān)（圖5，r＝0.443，P＝0.03）。

圖5 16周大鼠右心室miR-21相對表達量與Ⅰ型膠原蛋白含量的相關(guān)性

3 分析與討論

運動性心肌纖維化是指長期大強度運動導致的心臟細胞外基質(zhì)過度堆積，其發(fā)生機制仍不清楚，La Gerche等[17]認為可能是由大強度運動時心臟血液動力負荷急劇增加引起的。運動性心肌纖維化主要發(fā)生在耐力和超耐力運動員身上，尤其是老耐力運動員[18]。

心肌纖維化是一種不良的心肌重塑，可降低心臟的順應(yīng)性，輕則影響心臟的正常功能，重則誘發(fā)心律失常、導致心力衰竭或心源性猝死[19]。在心肌梗死和高血壓所致心肌纖維化的動物模型中已經(jīng)證實，纖維化的發(fā)生與發(fā)展需要滿足以下幾點條件[20]：（1）基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）上調(diào)誘導細胞外基質(zhì)合成增多，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（TIMP）下調(diào)使細胞外基質(zhì)降解減少；（2）促纖維化因子的刺激，如轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、血小板源生長因子等；（3）成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞可分泌α-SMA；（4）內(nèi)皮細胞的募集，以實現(xiàn)內(nèi)皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，生成的細胞仍可表達內(nèi)皮細胞標志物但獲得成纖維細胞樣特性。此外，固有和獲得性免疫反應(yīng)在纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中也發(fā)揮重要作用[21]。

在運動性心肌纖維化動物模型中也有實驗數(shù)據(jù)證實[22]，大鼠經(jīng)16周大強度運動后，TGFβ1通過調(diào)節(jié)MMP/TIMP表達上調(diào)Ⅰ膠原蛋白的含量，最終導致心肌纖維化，但4周和8周的大強度運動并未引起心肌纖維化。本研究在此基礎(chǔ)上增加12周大強度運動組，并增加中強度運動對照組，結(jié)果顯示，8周大強度運動后右心室膠原容積分數(shù)有增加的趨勢，12周和16周大強度運動后膠原容積分數(shù)顯著增加，但中強度運動不會引起膠原容積分數(shù)的變化；Ⅰ膠原蛋白含量的變化與膠原容積分數(shù)的變化一致。此外，也有實驗證據(jù)表明TNF-α是運動性心肌纖維化發(fā)生過程中的核心調(diào)節(jié)因子之一，它可通過P38和NFκB信號通路激活成纖維細胞[23]。表明運動性心肌纖維化模型和心肌梗死及高血壓心肌纖維化模型病理過程具有一定的相似性。

盡管TGFβ1已經(jīng)被證實是纖維化過程中的核心調(diào)節(jié)因子，但是以TGFβ1為靶點的治療方案并沒有取得理想的效果，因而研究人員一直在探索治療纖維化的有效方法。miR-21是參與人類癌癥發(fā)生和發(fā)展過程的主要miRNAs之一[24]，TGFβ1可上調(diào)miR-21的表達[25，26]，而在肝臟[10]、腎臟[9]、心臟[27]、肺[11]等器官中都可檢測到miR-21的表達。因此，miR-21可能參與了TGFβ1誘導的這些器官的纖維化過程，是潛在的治療纖維化的靶點。Thum等[28]發(fā)現(xiàn)，伴隨心肌纖維化的心衰小鼠心臟成纖維細胞miR-21表達水平顯著升高，而抑制miR-21的表達則可防止心肌纖維化的出現(xiàn)且心功能得到改善。他們還發(fā)現(xiàn)miR-21的促纖維化效果似乎主要針對成纖維細胞，而對心肌細胞的作用并不是很大[28]。然而隨后大量研究[6，29，30]發(fā)現(xiàn)，miR-21對不同細胞有特異性的效果，不僅對成纖維細胞，還包括心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞和炎癥細胞（表2）。此后，大量研究[31-34]在其他器官如腎臟、肝臟和肺纖維化過程中也發(fā)現(xiàn)，纖維化的出現(xiàn)伴隨miR-21表達水平的升高，抑制miR-21的表達可減輕纖維化程度，而用miR-21質(zhì)粒干預則可加劇纖維化程度。表明miR-21是多種病因?qū)е缕鞴倮w維化的關(guān)鍵因子。本研究發(fā)現(xiàn)8周、12周和16周大強度運動都可以引起右心室miR-21表達升高，且與右心室膠原容積分數(shù)和Ⅰ型膠原蛋白的含量正相關(guān)。值得注意的是，雖然在8周和12周大強度運動后右心室并未出現(xiàn)心肌纖維化，但miR-21的表達水平卻顯著升高，提示miR-21的表達水平可作為運動性右心室心肌纖維化的生物標志物之一。當然，miR-21并不是運動性右室纖維化的特異性生物標志物，因為在其他器官纖維化過程中miR-21的表達水平也顯著升高，包括肝臟[35]、腎臟[36]和肺[37，38]。

鑒于miR-21在纖維化過程中發(fā)揮了重要作用，研究人員對miR-21促進不同器官纖維化的機制進行了探索。目前實驗證實纖維化發(fā)生過程中TGFβ1是miR-21的上游調(diào)節(jié)因子，而TGFβ1主要通過Smads蛋白來調(diào)節(jié)miR-21的表達[39]。Zhong等[32]研究發(fā)現(xiàn)TGFβ 1通過Smad3來上調(diào)miR-21的表達，敲除Smad3則可防止miR-21的上調(diào)和腎纖維化的出現(xiàn)。此外，可負向調(diào)控TGFβ1通路的TGFβRⅢ[40]和Smad7[41]在器官纖維化過程中表達量下降，而通過基因或藥物的方法增加兩種蛋白的表達量，則可減輕器官纖維化程度。相比miR-21比較單一的上游調(diào)節(jié)因子，其下游靶基因則較多（表2），主要包括PTEN、SPRY-1、PDCD4、DDAH-1和Bcl-2。PTEN是細胞周期、細胞運動和凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[42]，在正常修復過程中，細胞外基質(zhì)收縮導致PTEN上調(diào)，可抑制Akt/PI3K通路并促發(fā)成纖維細胞凋亡、終止修復反應(yīng)。在纖維化過程中PTEN的表達下降，Akt/PI3K通路上調(diào)，因此成纖維細胞增殖、存活，最終形成纖維化[43]。Zanotti等[44]發(fā)現(xiàn)成纖維細胞PTEN下調(diào)和Akt/PI3K的激活與miR-21的上調(diào)有關(guān)；若沉默miR-21則可恢復PTEN的表達及降低Akt/PI3K的激活，并減少Ⅰ型膠原蛋白的含量。SPRY-1在心衰過程中表達減少，導致ERK信號通路上調(diào)，進而促進成纖維細胞的存活和間質(zhì)纖維化[28]。Adam等人發(fā)現(xiàn)，心房纖維化過程中miR-21上調(diào)導致SPRY-1下降；而Zanotti等人[44]證實抑制miR-21的表達可上調(diào)SPRY-1的表達水平。PDCD4是miR-21的另一個靶基因，它參與炎癥反應(yīng)和細胞凋亡過程[45]。Sheedy等[46]發(fā)現(xiàn)miR-21可通過抑制PDCD4的表達來促進抗炎因子IL-10的表達；Cheng等[47]也發(fā)現(xiàn)miR-21的表達與PDCD4的表達及細胞凋亡負相關(guān)，這可能是由于miR-21下調(diào)PDCD4的表達從而減少細胞凋亡[48]。DDAH1屬于二甲基精氨酸二甲胺水解酶家族基因，DDAH1可通過調(diào)節(jié)細胞非對稱二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）的濃度來影響一氧化氮的生成，而實驗證實ADMA的生成可降低一氧化氮的濃度，進而導致慢性低氧和纖維化[49，50]。Liu等[51]證實miR-21可直接與AADH1的3’-UTR結(jié)合，從而下調(diào)DDAH1的表達進而引起纖維化，而轉(zhuǎn)染DDAH1則可有效減少α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的含量。Bcl-2基因是一種重要的抗凋亡因子，抑制Bcl-2的表達可促進心臟成纖維細胞的凋亡[52]。Ji等發(fā)現(xiàn)miR-21可直接作用于它的靶基因Bcl-2，從而影響細胞的增殖/凋亡[53]。Dong等[54]發(fā)現(xiàn)miR-21通過上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2的表達抑制心臟成纖維細胞的凋亡從而促進心臟纖維化?？傊琺iR-21可通過多種通路促進膠原蛋白的分泌和成纖維細胞的增殖，抑制成纖維細胞的凋亡和炎癥來促進多種器官的纖維化。

表2 miR-21對不同細胞的特異性效果

本研究存在一些缺陷，盡管本研究直接證實了大強度運動引起的右室纖維化與miR-21表達量升高有關(guān)，但我們沒有采用miR-21抑制劑觀察miR-21表達被抑制后能否減輕運動性右室纖維化，或者采用miR-21相似物質(zhì)粒對大鼠進行轉(zhuǎn)染觀察miR-21過表達是否能加重運動性右室纖維化。希望今后的工作能對此進行研究，并探索在運動性右室纖維化過程中miR-21是通過哪個或哪些下游靶基因發(fā)揮作用的，以增加以miR-21為靶點治療運動性右室纖維化的可能性。

4 結(jié)論

長期大強度運動后右室心肌纖維化與miR-21表達水平增高有關(guān)，是潛在的運動性心肌纖維化的新生物標志物和干預靶點。

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Effects of MiR-21 on Exercises-induced Right Ventricularfibrosis

Rao Zhijian1，2，Chang Yun1，Wang Shiqiang3
1 China Institute of Sport Science，Beijing 100061，China 2 Shanghai University of Sport，Shanghai 200438，China 3 College of Physical Education，Hunan University of Technology，Zhuzhou 412000，China Corresponding Author:Chang Yun，Email:changyun@ciss.cn

ObjectiveTo explore the expression level of miR-21 in exercise-induced right ventricular（RV）fibrosis，and to analyze the role of miR-21 in exercise-induced right ventricular fibrosis.Meth?odsSeventy-two male Sprague-Dawley rats were randomly divided into a sedentary（Sed）group，a mod?erate exercise（ME）group and an intensive exercise（IE）group，each of 24.Rats in the Sed group were free of exercises，while those in ME and IE groups ran an hour on treadmill at 5°and 10°slopes at the speed of 15.2 m/min and 28 m/min respectively for 8 weeks，12 weeks or 16 weeks every day，5days per week.Twenty-four hours after the last training，all rats were sacrificed after blood sampling.The right ventricles were removed，and the collagen volume fraction（CVF）was tested using Sirius red staining，CollagenⅠ（ColⅠ）content was quantified using Immunofluorescence.The expression level of miR-21 was measured using the reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）.ResultsAf?ter 12 weeks（P<0.05，P<0.05）and 16 weeks（P<0.01，P<0.01）of intensive exercises，the averageCVF in the right ventricular was significantly higher than that of Sed and ME rats.Compared to Sed and ME groups，12 weeks（P<0.01，P<0.01）and 16 weeks（P<0.01，P<0.01）of intensive exercises sig?nificantly increased RV collagenⅠcontent.Compared to the Sed group，the expression of miR-21 in RV increased significantly in the IE group（P<0.01，P<0.05 and P<0.05）.After 16-week intensive exer?cises，the miR-21 expression was positively correlated with the RV ColⅠcontent.ConclusionThe right ventricular fibrosis induced by long-term intensive exercises is associated with increased miR-21 expression level.Therefore，miR-21 is a potent therapeutic target and novel biomarker of the exerciseinduced right ventricular fibrosis.

exercises，right ventricular，fibrosis，miR-21，collagen

2016.12.01

國家體育總局體育科學研究所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費（基本15-37和16-21）

第1作者：饒志堅，Email：1101294556@qq.com；

常蕓，Email：changyun@ciss.cn