核仁素對小鼠糖尿病性心肌病心肌肥大與纖維化發(fā)生的影響*

呂青蘭， 孫 麗， 蔣碧梅， 劉艷娟， 李媛彬， 陳廣文， 劉梅冬， 肖獻忠

(中南大學湘雅醫(yī)學院病理生理學系， 湖南 長沙 410078)

核仁素對小鼠糖尿病性心肌病心肌肥大與纖維化發(fā)生的影響*

呂青蘭， 孫 麗， 蔣碧梅?， 劉艷娟， 李媛彬， 陳廣文， 劉梅冬， 肖獻忠

(中南大學湘雅醫(yī)學院病理生理學系， 湖南 長沙 410078)

目的： 闡明核仁素在小鼠糖尿病性心肌病中的作用。方法: 前期研究中我們采用了心肌特異性過表達核仁素轉基因小鼠制備了II型糖尿病性心肌病模型；實驗分為野生型對照組、轉基因對照組、野生型糖尿病組及轉基因糖尿病組。采用麥胚凝集素(wheat germ agglutinin，WGA)熒光染色檢測小鼠心肌肥大情況；采用 Masson三色染色檢測小鼠纖維化情況；采用PowerLab system檢測小鼠心肌功能變化。結果: 與對照組比較，轉基因糖尿病組小鼠的血糖值變化不明顯，心肌細胞肥大顯著減輕， 膠原纖維生成顯著減少， 血流動力學指標±dp/dtmax、左室舒張末壓、左室峰壓和心率均有不同程度的改善，且差異具有統(tǒng)計學意義。結論: 核仁素可能通過減輕糖尿病性心肌病小鼠心肌細胞肥大及纖維化的發(fā)生，從而改善糖尿病性心肌病小鼠的心功能。

糖尿病性心肌??； 核仁素； 心肌肥大； 纖維化； 轉基因小鼠

糖尿病性心肌病是一種以心肌細胞肥大、間質纖維化、心肌早期舒張功能不全、晚期收縮功能障礙為主要特征表現的特異性心肌病[1-3]。核仁素(nucleolin，C23)是細胞核中含量最豐富的非核糖體穿梭蛋白之一，迄今對其做了大量研究[4]。近年研究表明核仁素作為一種凋亡相關蛋白[5-6]，在心肌內源性保護中也發(fā)揮重要的作用[7]。前期研究中，我們采用核仁素轉基因(transgenic，TG)小鼠成功構建了小鼠II型糖尿病性心肌病模型并且檢測到小鼠心肌中核仁素蛋白表達水平明顯升高[8-9]。 然而核仁素是否在糖尿病性心肌病中發(fā)揮作用目前尚不清楚，為此我們采用麥胚凝集素(wheat germ agglutinin， WGA)熒光染色、Masson染色及PowerLab system檢測等技術，進一步闡明核仁素對糖尿病性心肌病心肌細胞肥大與纖維化以及小鼠心功能改變的影響。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

實驗動物為野生型(wild-type，WT)C57BL/6小鼠，體重22～25 g，雌雄各半，共60只，購自南京大學模式動物研究中心；核仁素過表達轉基因小鼠共30只，由南京大學模式動物研究中心構建完成。

2 實驗方法

2.1 小鼠II型糖尿病性心肌病模型的制備 將野生型和TG小鼠隨機分為對照組和糖尿病模型組，其中模型組給予高脂高糖飼料(20%葡萄糖、2.5%膽固醇、10%豬油和67.5%常規(guī)飼料)喂養(yǎng)20周，然后分別于第5、6周將小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(劑量為60 mg/kg)處理1次；對照組則給予普通飼料喂養(yǎng)并加腹腔注射同等劑量檸檬酸緩沖液處理，保證小鼠在整個實驗過程中自由飲食和飲水。

2.2 Western blot檢測各組小鼠心肌中核仁素表達水平 分別提取各組小鼠心臟組織中蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，取20 μg蛋白裂解液經12% SDS-PAGE分離，然后采用電轉移法將膠上蛋白轉移至PVDF膜上，加入封閉液4℃封閉過夜后加入兔nucleolin多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，于搖床上室溫反應2 h。用洗膜液洗3次洗去多余Ⅰ抗，加入辣根過氧化物酶偶聯的抗兔IgGⅡ抗(1∶1 000稀釋)，于搖床上反應1 h，用洗膜液洗3次洗去多余Ⅱ抗。最后DAB顯色后進行灰度掃描機及定量分析。

2.3 RT-PCR 檢測 提取各小鼠心肌組織RNA。PCR引物由上海生物工程技術服務有限公司設計并合成。β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)上游引物為5′-ATGTGCCGGACCTTGGAA-3′，下游引物為5′-CCTCGGGTTAGCTGAGAGATCA-3′,長度170 bp； GAPDH上游引物為5′-ATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG-3′，下游引物為 5′-GAAGACACCAGTAGACTCCACGACA-3′,長度171 bp; collagen 1(Col-1)上游引物為5′-CTGGTCCTGTTGGAAGTCGT-3′，下游引物為 5′-CAGATGCACCTGTTTCTCCA-3′,長度201 bp。以2 μL RNA為模板進行一步法RT-PCR，將PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色后于紫外透射儀下攝像。

2.4 WGA熒光染色 脫蠟同HE染色，抗原修復，80 ℃水浴20 min，冷卻，D-Hanks液洗片2次，每次5 min，WGA工作液染色，于室溫孵育10 min， 接著D-Hanks洗片3次，每次10 min，甘油封片，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍片。

2.5 Masson三色染色 小鼠心肌組織經冰凍切片后，鐵蘇木素染色 6 min，氨水返藍，麗春紅品紅染色液染色 3 min，磷鉬酸分化 3 min，苯胺藍染色 2 min，分化水洗，脫水，透明，中性樹脂封片。鏡下觀察并拍照。膠原纖維染成藍色，心肌組織染成紅色。

2.6 PowerLab system檢測小鼠心臟血流動力學 于第20周末，我們將小鼠經腹腔注射10%水合氯醛0.1 mL，待麻醉完全后將其仰臥位固定在動物實驗手術臺上，行氣管切開術，連接小動物呼吸機(其中呼吸頻率設置為每分鐘90次，潮氣量設置為0.6 mL)，接著開胸，暴露心臟視野，將20 mL注射器針頭連于PowerLab system 數據采集分析系統(tǒng)傳感器，然后于小鼠心尖處進針入左心室，采用血流動力學分析軟件監(jiān)測心功能變化并記錄結果。

2.7 染色分析方法 WGA熒光染色心肌細胞面積與Masson三色染色膠原纖維面積采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 核仁素過表達對小鼠血糖的影響

采用心肌特異性過表達小鼠構建糖尿病模型，Western blot結果顯示野生型糖尿病組小鼠心肌核仁素蛋白水平較對照組野生型小鼠顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學意義，但轉基因糖尿病組小鼠心肌核仁素蛋白水平與轉基因對照組小鼠比較改變不明顯，差異無統(tǒng)計學顯著性；此外，野生型糖尿病組和轉基因糖尿病組空腹血糖值均明顯升高，且分別較野生型對照組與轉基因對照組增加了58.86%及63.43%。轉基因糖尿病組與野生型糖尿病組相比較差異無統(tǒng)計學顯著性。上述結果變化說明了小鼠糖尿病模型構建成功，且核仁素過表達并不影響血糖值的改變，見圖1。

Figure 1.The protein level of nucleolin (A) and blood glucose (B) in the mice. WT: wild-type mice; TG: nucleolin transgenic mice. Mean±SD.n=5.#P<0.05vsWT mice in control group；*P<0.05vsWT mice in diabetes group.

圖1 小鼠心肌核仁素蛋白水平與空腹血糖值的檢測

2 核仁素過表達對糖尿病性心肌病小鼠心肌細胞肥大的影響

心肌肥大是糖尿病性心肌病的主要特征之一，我們將各組小鼠心臟切片通過WGA熒光染色后再分別觀察各組小鼠心肌細胞的大小。如圖2所示，野生型糖尿病組心肌細胞較野生型對照組出現明顯肥大，且差異具有統(tǒng)計學意義，而轉基因糖尿病組心肌細胞與野生型糖尿病組相比較，心肌細胞肥大明顯減輕，2組差異具有統(tǒng)計學意義。

3 核仁素過表達對糖尿病性心肌病小鼠心肌間質纖維化的影響

心肌纖維化是糖尿病性心肌病的另一個主要的病理變化。為了探討核仁素對糖尿病性心肌病心肌纖維化的影響，我們采用Masson三色染色法觀察各組小鼠心肌纖維化程度并統(tǒng)計了膠原纖維的面積。如圖3所示，野生型對照組和轉基因對照組心肌中可見少量膠原纖維分布，野生型糖尿病組除血管旁膠原累積增多外，心肌間質中也可見大量膠原累積，但轉基因糖尿病組較野生型糖尿病組比較，膠原纖維顯著減少，經Image-Pro Plus軟件分析野生型糖尿病組膠原面積是野生型對照組的11.56倍，轉基因糖尿病組膠原面積是野生型糖尿病組的37.4%。

Figure 2.The effect of nucleolin over-expression on cardiac hypertrophy in diabetic mice. A: analysis of cardiomyocyte size by WGA staining (×400)； B: the mRNA expression of β-MHC. Mean±SD.n=5.#P<0.05vswild-type (WT) mice in control group;*P<0.05vsWT mice in diabetes group.

圖2 核仁素過表達對糖尿病性心肌病心肌細胞肥大的影響

Figure 3.The effect of nucleolin over-expression on myocardial fibrosis in diabetic mice. A: myocardial interstitial Masson staining (×200); B: the mRNA expression of Col-1. Mean±SD.n=5.#P<0.05vswild-type (WT) mice in control group;*P<0.05vsWT mice in diabetes group.

圖3 核仁素過表達對糖尿病性心肌病心肌纖維化的影響

4 核仁素過表達對糖尿病性心肌病小鼠心功能改變的影響

為了進一步確定核仁素過表達對糖尿病性心肌病心功能的保護作用，我們檢測了糖尿病性心肌病小鼠相關的心臟血流動力學指標，如圖4所示，與野生型對照組小鼠比較，野生型糖尿病組小鼠左心室功能明顯降低，其中+dp/dtmax下降了28.2%，-dp/dtmax下降了26.8%，LVEDP升高了2.4倍，LVSP下降了35.9%，心率下降了18.9%，且差異均具有統(tǒng)計學意義；轉基因糖尿病組小鼠與野生型糖尿病組小鼠比較其血流動力學指標±dp/dtmax、LVEDP、LVSP和心率均有不同程度的改善，且差異具有統(tǒng)計學意義。

討 論

糖尿病心肌病是指糖尿病患者心肌細胞原發(fā)性損傷引起廣泛的結構異常，最終導致左心室肥厚、舒張期和(或)收縮期心臟功能障礙的一種疾病。糖尿病性心肌病的發(fā)病機制很復雜，主要包括RASS系統(tǒng)的激活、鈣離子交換障礙、糖毒性等，上述原因可引起患者心肌炎癥細胞浸潤、心肌細胞肥大、心肌纖維化、心肌細胞氧化損傷等一系列改變，從而影響其心肌舒縮功能，最終導致患者因心力衰竭而死亡。糖尿病性心肌病以早期舒張功能障礙，晚期收縮功能障礙為主要特點，為此第20周末我們采用左室導管插入術檢測了糖尿病心肌病模型小鼠的血流動力學變化，結果發(fā)現，模型小鼠多種心功能指標較正常對照組發(fā)生了明顯異常。第20周末我們監(jiān)測了小鼠多種血流動力學指標，結果也表明糖尿病小鼠確實已發(fā)生了心功能改變。上述結果也同時表明我們前期研究中構建的II型糖尿病性心肌病小鼠模型是成功的。

作為一種多功能的穿梭蛋白，核仁素可穿梭于細胞核、細胞漿和細胞膜之間，從而發(fā)揮其調節(jié)機體DNA和RNA代謝等多方面的作用。近年文獻報道，核仁素還可介導內皮抑素的抗血管生成、抗腫瘤生物學行為[10-14]，促進早期炎癥發(fā)生[15]，協(xié)助病原微生物(如艾滋病病毒、肝炎病毒)感染[16]，調控神經細胞分化和發(fā)育等[17]。

前期研究中我們檢測到了糖尿病心肌病模型中野生型糖尿病小鼠心肌中核仁素蛋白水平較對照組出現明顯表達上調[8]。然而核仁素蛋白水平改變究竟只是一種伴隨現象，還是在糖尿病性心肌病中發(fā)揮作用，目前尚不能確定。為此我們采用了心肌特異性核仁素過表達轉基因小鼠構建了II型糖尿病性心肌病小鼠模型，然后采用WGA熒光染色Masson三色染色及PowerLab system檢測等技術進一步闡明核仁素對糖尿病性心肌病心肌細胞肥大與纖維化以及小鼠心臟血流動力學改變的影響。結果發(fā)現與對照組相比較，野生型糖尿病小鼠的心肌明顯肥大與纖維化明顯減輕，血液動力學指標變化也表明核仁素轉基因糖尿病組小鼠心臟功能也有明顯改善，這些結果表明在糖尿病性心肌病中，核仁素可能通過減輕小鼠糖尿病所致的心肌肥大及纖維化而改善其心功能。

Figure 4.The effect of nucleolin over-expression on cardiac function alterations in diabetic mice. A: the maximal rate of left ventricular pressure rise (+dp/dtmax); B: the maximal rate of left ventricular pressure drop (-dp/dtmax); C: the left ventricular systolic pressure (LVSP); D: the left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP); E: the heart rate. Mean±SD.n=8.#P<0.05vswild-type (WT) mice in control group;*P<0.05vsWT mice in diabetes group.

圖4 核仁素過表達對糖尿病性心肌病小鼠心臟血流動力學改變的影響

近年文獻表明，核仁素也是一種RNA結合蛋白，我們前期研究發(fā)現核仁素可通過與心肌內源性保護基因的mRNA相結合，從而調控其mRNA的穩(wěn)定性，進而在心肌保護中發(fā)揮作用[7]。然而核仁素是否也可通過調控心肌肥大及纖維化相關基因的mRNA穩(wěn)定性進而在心肌肥大及纖維化中起作用，目前尚不清楚。TGF-β是纖維化信號通路中主要的細胞因子，有文獻報道TGF-β可誘導核仁素蛋白水平顯著增加，使其下游促纖維化因子的mRNA穩(wěn)定性增加，從而促進纖維化的發(fā)生[18]。本實驗中核仁素過表達可減輕纖維化程度，因此我們推斷其機制很可能是核仁素通過調控心肌肥大、纖維化相關基因的mRNA穩(wěn)定性而發(fā)揮作用的，但具體機制還有待進一步的研究證實。綜上所述，我們的研究結果為進一步闡明核仁素的心肌內源性保護作用提供了新的線索與思路。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Role of nucleolin on myocardial hypertrophy and fibrosis in type II diabetic cardiomyopathy mice

Lü Qing-lan, SUN Li, JIANG Bi-mei, LIU Yan-juan, LI Yuan-bin, CHEN Guang-wen, LIU Mei-dong, XIAO Xian-zhong

(DepartmentofPathophysiology,XiangyaSchoolofMedicine,CentralSouthUniversity,Changsha410078,China.E-mail:jiangbimei@163.com)

AIM: To investigate the effect of nucleolin on diabetic cardiomyopathy in mice. METHODS: A type II diabetic cardiomyopathy mouse model was prepared using a cardiac-specific nucleolin-overexpressing transgenic mice. The mice were divided into wild-type mouse control group, nucleolin transgenic mouse control group, wild-type mouse diabetes group and nucleolin transgenic mouse diabetes group. Wheat germ agglutinin (WGA) fluorescent dye, Masson staining and PowerLab system detection were used to further clarify the role of nucleolin on cardiac hypertrophy, fibrosis and cardiac function in type II diabetic cardiomyopathy mice. RESULTS: Compared with wild-type mouse control group, no significant increase in blood glucose level was found, while genetical myocardial cell hypertrophy was significantly attenuated in nucleolin transgenic mouse diabetes group. The collagen fibers were also significantly reduced, and hemodynamic indexes ± dp/dtmax, left ventricular end-diastolic pressure, left ventricular systolic pressure and heart rate were also improved. The above differences were statistically significant.CONCLUSION: Nucleolin may reduce the occurrence of myocardial hypertrophy and fibrosis, thus improving the cardiac function of diabetic cardiomyopathy mice.

Diabetic cardiomyopathy; Nucleolin; Myocardial hypertrophy; Fibrosis; Transgenic mice

1000- 4718(2017)07- 1231- 06

2016- 05- 09

2017- 04- 26

國家自然科學基金資助項目(No. 81170113)

R587.1； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.013

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