阿爾茨海默病樣三重轉(zhuǎn)基因小鼠血小板的功能改變及機(jī)制探討

劉遠(yuǎn)新,劉 濤

(西安體育學(xué)院健康科學(xué)系，西安 710068)

阿爾茨海默病樣三重轉(zhuǎn)基因小鼠血小板的功能改變及機(jī)制探討

劉遠(yuǎn)新,劉 濤

(西安體育學(xué)院健康科學(xué)系，西安 710068)

目的 探討常見的阿爾茨海默病(AD)小鼠模型APP/PS-1/tau(3xTg)小鼠血小板功能變化情況及機(jī)制分析。方法 實(shí)驗(yàn)小鼠分為3xTg-AD組和WT組；采用流式細(xì)胞術(shù)和粘附試驗(yàn)等方法評價(jià)3xTg-AD和WT小鼠血小板的功能；并采用Western blotting方法對其機(jī)制進(jìn)行探討。結(jié)果 老年3xTg-AD小鼠血小板計(jì)數(shù)和糖蛋白表達(dá)與對照WT小鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。但是與對照WT小鼠相比，3xTg-AD小鼠血小板與纖維蛋白原的粘附能力增強(qiáng)(P<0.05)。此外，與纖維蛋白原粘附功能增強(qiáng)的3xTg-AD小鼠血小板信號蛋白的磷酸化也增加，包括PI3激酶Akt和p38MAP激酶(P<0.05)。然而，兩組小鼠中由激動劑誘導(dǎo)的活化血小板無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 3xTg-AD小鼠循環(huán)血液中血小板粘附功能增加，可能與AD疾病的進(jìn)展相關(guān)。

三重轉(zhuǎn)基因小鼠; 阿爾茨海默病; 血小板功能

在外周血細(xì)胞中，在止血與血栓形成中發(fā)揮重要作用的血小板，最有可能與血管疾病和AD有聯(lián)系[4]。與同齡健康者比較，AD患者血小板形態(tài)及淀粉樣前體蛋白 (amyloid precursor protein, APP)代謝異常，特別是APP比值明顯降低[5]。此外，AD患者血小板在一般情況下處于高活化狀態(tài)，受到刺激后P-選擇素高表達(dá)，整合素αIIbβ3激活，以及高水平的血小板/白細(xì)胞聚集[6]。血小板活化也在APP23小鼠AD模型中觀察到，老年APP23小鼠血小板整合素活化增強(qiáng)，激活的血小板可導(dǎo)致血管炎癥和血栓形成[7]。研究發(fā)現(xiàn)，3xTg-AD小鼠血小板APP減少，這是AD患者血小板常出現(xiàn)的狀況[8]。此外，3xTg-AD小鼠腦血管中Aβ、凝血酶、腫瘤壞死因子α，白細(xì)胞介素1和6等過表達(dá)[9]。然而，3xTg-AD小鼠血小板功能變化未被報(bào)道。因而，本研究旨在比較老年3xTg-AD和野生型(WT)小鼠血小板粘附及活化狀態(tài)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

清潔級C57BL/6 小鼠購于購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部【SCXK(陜)2007-003】；APP/PS1/Tau 三重轉(zhuǎn)基因(3xTg)小鼠購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司【SCXK(滬)2012-0002】，鼠齡為18個月。實(shí)驗(yàn)動物分為兩組，3xTg-AD組和正常對照(WT)組。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)；凝血酶受體活化肽(TRAP4)、 convulxin (CVX)和U46619(美國Sigma公司); 糖蛋白VI、CD42b、CD41和CD49b 抗體(美國Biolegend公司)；TRITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(美國Sigma公司); P-Akt、P-p38和β-actin抗體(美國CST公司)。

1.3 血小板制備

從麻醉小鼠的腹腔靜脈采集血液，注射器中含有3.8%枸櫞酸鈉做為抗凝劑。血液用HEPES緩沖液稀釋后180 r/min離心10 min，獲得血小板豐富的血漿(PRP)。再加入0.02 U/mL磷酸酶和1 μmol/L PGE1后，離心10 min (550 r/min)。去除上清液后，用PIPES緩沖液洗滌血小板顆粒后離心15 min (720 r/min)。然后制備的血小板懸浮在HEPES緩沖液中(5 × 108/mL)。

呂凌子終于在星期三下午接到了生產(chǎn)廠家打來的電話，那會她正收拾好辦公桌上的資料，準(zhǔn)備下班。給她打電話的是個男中音，充滿磁性。男中音自稱負(fù)責(zé)售后的一名工作人員，說兩家防盜門可以互開純屬偶然現(xiàn)象，這樣的事情居然出現(xiàn)在同一個城市同一個小區(qū)同一幢樓的上下層，其概率比買福彩中頭獎的概率還低，不能不說是個奇跡。

1.4 流式細(xì)胞分析

制備好的血小板樣品(在0.05 mL HEPES緩沖液中含有106細(xì)胞)，未經(jīng)處理或0.5 mmol/L TRAP4、50 ng/mL convulxin和5 μmol/L U46619刺激的血小板，在室溫下與 FITC標(biāo)記的纖維蛋白原反應(yīng)30 min。采用特異性抗體檢測WT和3xTg-AD小鼠血小板表面的糖蛋白表達(dá)。

1.5 粘附分析

首先，蓋玻片放入100 μg/mL纖維蛋白原溶液中在室溫下過夜，然后用1% 胎牛血清室溫下封閉2 h。0.5 mL血小板(4 × 107/mL)放到覆蓋纖維蛋白原蓋玻片上反應(yīng)1 h，且含有1 mmol/L CaCl2，非貼壁血小板移去，貼壁血小板被固定， Triton X-100通透，經(jīng)TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽與血小板肌動蛋白結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察蓋玻片上的血小板。

1.6 Western blotting

收集與纖維蛋白原粘附功能增強(qiáng)的3xTg-AD小鼠血小板，進(jìn)行全細(xì)胞裂解。BCA法蛋白定量，制備成電泳樣品。組取15 μg樣品，進(jìn)行凝膠電泳。電泳結(jié)束后將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后分別加入P-Akt、P-p38和β-actin抗體(1:1000)中，室溫下孵育3 h。然后將膜放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG中，孵育1 h。根據(jù)ECL試劑盒顯示特異蛋白條帶X光片。所得X-光膠片用Gel Doc凝膠成像分析系統(tǒng)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3xTg-AD小鼠血小板計(jì)算及糖蛋白表達(dá)

流式細(xì)胞分析表明，與對照WT組小鼠比較，3xTg-AD組小鼠血小板和白細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1A、B)。下一步觀察兩組小鼠血小板糖蛋白的表達(dá)，包括糖蛋白Ibα(CD42b)、糖蛋白α2 (CD49b)、糖蛋白αII b(CD41)和糖蛋白VI(GPVI)。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，兩組小鼠血小板表面糖蛋白的表達(dá)差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)(圖1C)。

2.2 3xTg-AD小鼠血小板活化狀態(tài)

通過檢測與整合素結(jié)合的纖維蛋白原，比較不同激活劑對兩組小鼠血小板活化的影響。流式細(xì)胞結(jié)果顯示，兩組小鼠血小板纖維蛋白原表達(dá)相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)(圖2A)。同時(shí)，研究也觀察了兩組小鼠血小板P-選擇素的表達(dá)，不同激活劑刺激后，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)(圖2B)。

2.3 3xTg-AD小鼠血小板粘附功能增加

下面比較兩組小鼠血小板與纖維蛋白原結(jié)合的能力，粘附分析結(jié)果表明，與對照WT組小鼠比較，3xTg-AD組小鼠與纖維蛋白原結(jié)合的血小板顯著增加(P<0.01) (圖3)。

圖1 3xTg-AD小鼠血小板計(jì)算及糖蛋白表達(dá)Fig.1 Characterization of platelets from the 3xTg-AD mice. A,B: Platelets and white blood cells count in whole blood from WT and 3xTg-AD mice. (C) Surface expression of different glycoproteins on the platelets of WT and 3xTg-AD mice.

圖2 3xTg-AD小鼠血小板活化狀態(tài)Fig.2 Integrin αIIβb3 inside-out activation and P-selectin expression of the 3xTg-AD platelets. (A) Flow cytometric analysis of FITC-labeled fibrinogen binding to WT and 3xTg-AD platelets stimulated with agonist. (B) P-selectin (CD62P) expression on the platelet surface is analyzed in flow cytometry under esting and stimulated conditions.

注：WT組與3xTg-AD組相比較，***P<0.005圖3 3xTg-AD小鼠血小板粘附功能(標(biāo)尺=250 μm)Note. Wild type compared with the transgenic,***P<0.005Fig.3 Adhesion function of the 3xTg-AD platelets. Representative images of adherent platelets to the indicated substrates are reported (Bar=250 μm). Quantification of platelets adhesion, evaluated as number of adherent platelets/mm2.

2.4 Western blotting分析

Western blotting結(jié)果顯示，與對照WT組小鼠比較，3xTg-AD組小鼠血小板P-Akt 和 P-p38表達(dá)顯著的增加(P<0.05) (圖4)。

注：WT組與3xTg-AD組相比較，***P<0.005圖4 3xTg-AD小鼠血小板P-Akt和P-p38表達(dá)Note. Wild type compared with the transgenic mice,***P<0.005Fig.4 Expression of P-Akt and P-p38 in the 3xTg-AD platelets

3 討論

本研究表明，與年齡相匹配的WT小鼠血小板比較，老年3xTg-AD小鼠循環(huán)血液中血小板顯示出與內(nèi)皮下基質(zhì)(纖維蛋白原)的粘附能力增強(qiáng)。3xTg-AD小鼠血小板粘附能力增強(qiáng)或許可以解釋AD患者血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)增加[10]。使用AD小鼠模型而不是AD患者去探討血液中血小板功能的改變具有一定的優(yōu)勢，并可克服內(nèi)在的局限性。比如，AD小鼠通常攜帶特定的突變基因，其與AD的發(fā)生相關(guān)，因此，這種方法可將特定的突變基因與血小板功能改變的機(jī)制聯(lián)系起來。

這些AD模型到目前為止已經(jīng)用于AD的病理學(xué)多方面的研究，但是血小板功能的變化尚不明確。因此，本研究證實(shí)廣泛使用的AD模型，3xTg-AD小鼠血小板粘附功能(血栓形成的初始關(guān)鍵步驟) 發(fā)生改變。以往在相關(guān)的AD小鼠模型，APP23小鼠中發(fā)現(xiàn)了血小板過度活化[11]。相對于以往的研究，本研究不僅將血小板功能分析擴(kuò)展，而且采用目前廣泛使用的3xTg-AD小鼠模型。事實(shí)上， 3xTg-AD小鼠與APP23小鼠一樣，攜帶APP23突變，同時(shí)也攜帶早老素和tau蛋白突變。這些AD小鼠的表型和生化特征與AD患者有許多相似之處，包括過度磷酸化tau蛋白的積累[12]。

值得注意的是，我們的研究結(jié)果與已往在APP23小鼠中報(bào)道是不一致的[11]。相對于APP23小鼠，3xTg-AD小鼠與對照WT小鼠的血小板，在可溶性激動劑誘導(dǎo)下血小板的活化狀態(tài)無顯著差異。這種差異提示，不同的突變誘導(dǎo)的AD可能對血小板功能有影響。然而，也不能排除我們的研究結(jié)果與Jarre等人報(bào)道的差異，可能是由于血小板制備過程中存在差異[11]。然而， 3xTg-AD小鼠和APP23小鼠研究均表明AD的發(fā)病血小板功能改變有關(guān)。在3xTg-AD小鼠主要與血小板粘附功能改變；在APP23小鼠主要與激動劑誘導(dǎo)的血小板活化有關(guān)。在血栓形成的過程中，粘附能力改變可激活血小板，是血栓形成的關(guān)鍵步驟[13,14]。在本研究，我們已經(jīng)證明，3xTg-AD小鼠血小板與細(xì)胞外基質(zhì)粘附增加，導(dǎo)致血小板活化的信號通路激活，包括P-Akt 和 P-p38表達(dá)顯著增加。粘附血小板的激活是后續(xù)血栓形成必不可少的步驟。

總之，本研究證實(shí)了廣泛使用的AD模型，3xTg-AD小鼠血小板粘附功能發(fā)生變化，提示血小板粘附功能改變可能有助于AD相關(guān)的血管并發(fā)癥。

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Changes of platelet function in Alzheimer-like triple transgenic mice and its mechanism

LIU Yuan-xin, LIU Tao

Department of Health Science, Xi’an Physical Education University, Xi’an 710068, China

Objective To investigate the changes of the platelet function in APP/PS-1/tau(3xTg) mice, a murine model for Alzheimer’s disease，and explore its mechanisms. Methods We assessed the change of function of platelet in 3xTg-AD mice by flow cytometry. Adhesion assay and Western blotting were used to compare with the data of wild type mice. Results Platelets from aged 3xTg-AD mice were normal in number and glycoprotein expression (P>0.05), but adhere more avidly on matrices such as fibrinogen, compared with the platelets from age-matching wild type mice (P<0.05). The washed platelets of 3xTg-AD mice were adherent to fibrinogen, and also showed increased phosphorylation of selected signaling proteins, including PI3 kinase effector Akt and p38MAP kinase (P<0.05). In contrast, activation induced by several agonists in 3xTg-AD mice was similar to that of wild type platelets (P>0.05). Conclusions These results demonstrate that Alzheimer’s mutations result in a significant hyper-activated adhesion state of circulating platelets, evident with the progression of the disease.

3xTg mice; Alzheimer’s disease; Platelet function

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號：2014JM2-3027)。

劉遠(yuǎn)新(1976-)，女，研究方向：運(yùn)動康復(fù)及健康促進(jìn)。E-mail: liuyuanxin505@126.com。

研究報(bào)告

R-33

A

1671-7856(2017) 06-0017-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.004

2016-11-26