烏司他丁對(duì)氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)癲癇大鼠腦保護(hù)作用及其機(jī)制研究

何保明 李素萍 喻良

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烏司他丁對(duì)氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)癲癇大鼠腦保護(hù)作用及其機(jī)制研究

何保明 李素萍 喻良

目的 研究烏司他丁對(duì)癲癇發(fā)作時(shí)大腦的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 通過對(duì)Wistar大鼠建立癲癇模型，建模成功后并對(duì)其進(jìn)行4種分組處理，即A組注射生理鹽水；B組注射卡馬西平；C組注射卡馬西平和少量烏司他丁(10 000 U/kg)；D組注射卡馬西平和大量烏司他丁(70 000 U/kg)；測(cè)量每組達(dá)到驚厥標(biāo)準(zhǔn)后24、48、72、96 h不同時(shí)間段的S100β蛋白和神經(jīng)烯醇化酶(NSE)水及96 h后腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與IL-1β水平；通過免疫組化檢測(cè)caspase-3、bax與bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)；觀察神經(jīng)元凋亡情況；用水迷宮檢測(cè)大鼠的認(rèn)知功能，通過模型組與空白對(duì)照組和模型組間對(duì)比分析烏司他丁對(duì)癲癇大鼠的影響；空白對(duì)照組全程注射等量生理鹽水。結(jié)果 注射烏司他丁能夠降低S100β和NSE水平，并且大劑量烏司他丁效果更顯著(P<0.05)；烏司他丁對(duì)TNF-α與IL-1β表達(dá)進(jìn)行抑制，且大劑量烏司他丁效果更顯著(P<0.05)；注射烏司他丁后caspase-3與bax的陽性細(xì)胞減少而bcl-2的陽性細(xì)胞增加，且大劑量烏司他丁效果更顯著(P<0.05)；注射烏司他丁能夠減少海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡，且大劑量烏司他丁效果更顯著(P<0.05)；注射烏司他丁能夠改善癲癇大鼠的認(rèn)知功能，且大劑量烏司他丁效果更顯著(P<0.05)。結(jié)論 烏司他丁可能是通過抑制炎癥因子的表達(dá)和caspase-3與bax的激活，促進(jìn)bcl-2蛋白激活，并減少神經(jīng)元凋亡來對(duì)癲癇大鼠的大腦進(jìn)行保護(hù)。

烏司他丁 癲癇 氯化鋰-匹羅卡品

顳葉癲癇(Temporal Lobe Epilepsy,TLE)系中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其是難治性癲癇中最常見的類型，TLE常常自發(fā)性發(fā)作和反復(fù)發(fā)作，其病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確[1]。癲癇的發(fā)生與神經(jīng)元的凋亡、神經(jīng)元興奮性增加及突觸的異常等相關(guān)[2]，大量研究表明免疫應(yīng)答也參與了癲癇的發(fā)病機(jī)制[3]。烏司他丁是一種來源于人尿液的糖蛋白水解酶抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，并且具有一定的抗炎效果[4]。本研究通過在癲癇大鼠模型注射烏司他丁，以了解烏司他丁對(duì)癲癇模型鼠腦的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 建模及實(shí)驗(yàn)分組

通過對(duì)健康成年Wistar大鼠(250～300 g)腹腔注射氯化鋰(3 mg/kg)及20 h后皮下注射匹羅卡品(30 mg/kg)進(jìn)行建模，并隨機(jī)分組(A、B、C、D組)，每組各10只，對(duì)空白對(duì)照組(10只)只進(jìn)行生理鹽水注射，模型組中共對(duì)53只進(jìn)行建模處理，其中8只沒有達(dá)到驚厥標(biāo)準(zhǔn)、5只死亡；共4組模型組和1組空白對(duì)照組；密切觀察模型組大鼠狀態(tài)并進(jìn)行Simialowski 6級(jí)評(píng)分，達(dá)到IV或V級(jí)為本次研究驚厥的標(biāo)準(zhǔn)，不達(dá)評(píng)分等級(jí)的大鼠則另用其大鼠實(shí)驗(yàn)，以保證每組10只大鼠達(dá)標(biāo)，達(dá)標(biāo)后對(duì)大鼠進(jìn)行如下處理。A組不進(jìn)行任何治療，也不注射烏司他?。籅組在發(fā)生驚厥后注射卡馬西平進(jìn)行止驚治療，但不注射烏司他丁；C組在發(fā)生驚厥后注射卡馬西平進(jìn)行止驚治療，并注射少量烏司他丁(10 000 U/kg)；D組在發(fā)生驚厥后注射卡馬西平進(jìn)行止驚治療，并注射大量烏司他丁(70 000 U/kg)。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 S100β蛋白和神經(jīng)烯醇化酶(NSE)水平檢測(cè) 各組大鼠在達(dá)到驚厥標(biāo)準(zhǔn)后24、48、72、96 h分別收集鼠尾靜脈血，使用S100β蛋白和神經(jīng)烯醇化酶(NSE)試劑盒檢測(cè)其水平，操作步驟嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

1.2.2 TNF-α與IL-1β水平檢測(cè) 96 h后用雙抗夾心ELISA法檢測(cè)每組大鼠腦中TNF-α與IL-1β水平，并觀察注射烏司他丁后其水平的變化情況。

1.2.3 caspase-3、bax、bcl-2陽性細(xì)胞計(jì)數(shù) 上述處理完后斷頭處死，對(duì)大鼠海馬進(jìn)行切片，每只大鼠取一個(gè)切片并進(jìn)行caspase-3、bax、bcl-2免疫組化檢測(cè)，于400倍光鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，多少個(gè)？視野讀取求平均值。陽性細(xì)胞是指aspase-3胞核呈棕黃色，bax與bcl-2胞漿呈棕黃色。

1.2.4 TUNEL陽性細(xì)胞計(jì)數(shù) 斷頭處死后對(duì)海馬CA3區(qū)切片并TUNEL染色，陽性細(xì)胞是指細(xì)胞核呈棕黃色顆粒者，在400倍光鏡下計(jì)算10個(gè)視野的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)并其求均值。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

對(duì)建模后4個(gè)模型組進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，水迷宮設(shè)備是一個(gè)直徑為150 cm，深度為60 cm的水池，分為4個(gè)象限并在某一象限固定放置一個(gè)直徑12 cm的平臺(tái)；實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于站臺(tái)上適應(yīng)10 s，隨后將大鼠隨機(jī)從不同象限面壁置入池內(nèi)，大鼠登上站臺(tái)5 s后終止記錄，最長記錄時(shí)間為120 s，若大鼠在120 s內(nèi)不能上臺(tái)，引導(dǎo)其登上站臺(tái)適應(yīng)10 s，最后將大鼠擦干放入鼠籠；如此將大鼠置入游泳池，4次/d，每次間隔1 h，定位航行訓(xùn)練需要4 d；第5 d撤下平臺(tái)測(cè)量平臺(tái)逃避潛伏期，來評(píng)價(jià)大鼠的空間記憶能力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組腦電圖異常及發(fā)作次數(shù)比較 C、D組的發(fā)作次數(shù)與A、B組比較無明顯差異(P>0.05)，但腦電圖異常情況明顯改善(表1，圖1)。

表1 各組各時(shí)間段的發(fā)作次數(shù)和腦電圖異常情況,n=10)

注：與A組比較，*P<0.05

圖1 96h后4組腦電圖表現(xiàn)

2.2 各組S100β蛋白和NSE水平比較 對(duì)5組在驚厥發(fā)作后不同時(shí)間段S100β蛋白、NSE水平和每小時(shí)發(fā)作次數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，隨著時(shí)間的持續(xù)發(fā)現(xiàn)兩者水平都在上升，且模型組S100β和NSE水平較空白對(duì)照組高(P<0.05)；烏司他丁能夠降低S100β和NSE水平，且烏司他丁劑量越大效果越顯著(P<0.05)(表2)。

2.3 各組TNF-α與IL-1β水平比較 建模96 h后模型組TNF-α與IL-1β水平明顯高于空白對(duì)照組，模型組中C、D組明顯低于A、B組(P<0.05)，其中B組低于A組，但無明顯差異(P>0.05)，而D組明顯低于C組(P<0.05)(表3)。

2.4 各組caspase-3、bax、bcl-2陽性細(xì)胞計(jì)數(shù) 模型組中C、D組的caspase-3和bax陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于A、B組，而bcl-2陽性細(xì)胞明顯高于A、B組(P<0.05)，其中A、B組無明顯差異(P>0.05)，但C、D組有明星差異(P<0.05)(表4)。

表1 驚厥發(fā)作后不同時(shí)間段S100β蛋白、NSE水平,n=10，ng/L)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與C組比較，△P<0.05

表3 建模96 h后各組TNF-α與IL-1β水平,n=10，ng/g)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與A組、B組比較，△P<0.05；與C組比較，▲P<0.05

表4 各組caspase-3、bax與bcl-2的陽性細(xì)胞數(shù),n=10，個(gè)/每400倍視野)

注：與A組、B組比較，△P<0.05；與C組比較，▲P<0.05

2.5 各組TUNEL陽性細(xì)胞計(jì)數(shù) 模型組海馬CA3區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯較高，模型組中C、D組明顯低于A、B組(P<0.05)；C、D組也有明顯差異(P<0.05)，但A、B組無明顯差異(P>0.05)(表5)。

表5 各組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元的凋亡情況,n=10，個(gè)/每400倍視野)

注：與A組、B組比較，△P<0.05；與C組比較，▲P<0.05

2.6 水迷宮檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力 模型組大鼠認(rèn)知功能明顯降低，模型組中C、D組認(rèn)知功能于A、B組明顯改善(P<0.05)；C、D組之間無明顯差異(P>0.05)，A、B組之間也無明顯差異(P>0.05)(表6)。

3 討 論

癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)第二常見的疾病，全世界發(fā)病率為5%～8%，其特征性表現(xiàn)之一是自發(fā)性痙攣發(fā)作，主要是因?yàn)樯窠?jīng)元的興奮性增加或腦電波同步性增強(qiáng)所致[5]。本研究通過對(duì)模型組的發(fā)作次數(shù)和腦電圖異常情況分析發(fā)現(xiàn)烏司他丁對(duì)癲癇大鼠的大腦具有一定的保護(hù)作用。

S100β蛋白和NSE常用于檢測(cè)是否存在腦損傷與腦功能失調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)驚厥發(fā)作后不同時(shí)間段S100β蛋白和NSE的水平迅速增加，通過不同藥物方案處理后對(duì)照發(fā)現(xiàn)，注射烏司他丁后S100β蛋白和NSE的水平低于未使用烏司他丁，并且其差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，對(duì)模型大鼠經(jīng)止痙治療同時(shí)給予烏司他丁處理，對(duì)癲癇模型大鼠的腦功能具有一定的保護(hù)作用。

表6 各組大鼠認(rèn)知功能的情況,n=10)

注：與A組、B組比較，△P<0.05

本研究發(fā)現(xiàn)注射烏司他丁后TNF-α與IL-1β表達(dá)減少，烏司他丁劑量越大其效果越明顯。TNF-α與IL-1β是重要的炎癥細(xì)胞因子，在癲癇發(fā)作時(shí)對(duì)大腦的損害具有重要的作用，炎癥反應(yīng)不僅僅在持續(xù)性癲癇狀態(tài)中存在，在慢性癲癇患者中一樣存在并一直潛伏著，直到自發(fā)性癲癇發(fā)作的時(shí)候起作用[6-8]。越來越多的證據(jù)表明，長時(shí)間的炎性反應(yīng)表現(xiàn)不僅僅是病理組織所附帶存在的，相反它極大程度地降低了易受影響的大腦區(qū)域中驚厥發(fā)生的閾值，炎性細(xì)胞因子在產(chǎn)生驚厥及自發(fā)性復(fù)發(fā)中具有重要的作用[9-12]。實(shí)驗(yàn)證明，TNF-α水平升高會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，當(dāng)注射烏司他丁后對(duì)腦具有保護(hù)作用[13]。IL-1主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，即在所有腦區(qū)都有表達(dá)，在海馬和皮層神經(jīng)元的表達(dá)水平最高，并且對(duì)突觸神經(jīng)遞質(zhì)的釋放具有重要的作用[14]。Yang等[15]通過免疫熒光和免疫組化等方法對(duì)IL-1在難治性癲癇中的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)IL-1主要在神經(jīng)元表達(dá)，在癲癇模型中參與影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。最近一項(xiàng)對(duì)腦缺血再灌注損傷的模型研究中發(fā)現(xiàn)，烏司他丁能夠明顯降低TNF-α與IL-1β表達(dá)，能夠降低大腦的炎癥反應(yīng)[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)注射烏司他丁后caspase-3與bax的陽性細(xì)胞數(shù)減少而bcl-2的陽性細(xì)胞數(shù)增加，烏司他丁的劑量越高陽性細(xì)胞的變化越明顯。眾所周知，驚厥和癲癇持續(xù)狀態(tài)會(huì)激活內(nèi)在和外在的凋亡通路，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，caspase-3與bax的激活進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)元形成不可逆死亡。caspase-3蛋白酶在細(xì)胞凋亡過程中直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，Amorim等[8]發(fā)現(xiàn)海馬在癲癇持續(xù)發(fā)作時(shí)活性較高，并通過對(duì)癲癇模型在持續(xù)發(fā)作時(shí)進(jìn)行深部腦刺激發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)caspase-3的活性明顯減低，能夠減輕大鼠大腦的傷害。據(jù)報(bào)道，烏司他丁也可抑制caspase-3蛋白與bax蛋白的表達(dá)，并對(duì)bcl-2蛋白的表達(dá)進(jìn)行上調(diào)[17]。

本研究通過對(duì)模型癲癇大鼠的海馬CA3區(qū)進(jìn)行切片發(fā)現(xiàn)，注射烏司他丁后神經(jīng)元凋亡數(shù)低于未注射烏司他丁，并且烏司他丁的劑量越高其神經(jīng)元凋亡率越低。據(jù)報(bào)道，通過建立癲癇大鼠模型發(fā)現(xiàn)，烏司他丁抑制caspase-3與bax的激活，從而減少腦細(xì)胞凋亡，對(duì)大腦產(chǎn)生保護(hù)作用，最終在整體水平上改善大鼠的認(rèn)知功能[18]，本研究與此觀點(diǎn)一致。

綜上所述，烏司他丁對(duì)癲癇模型大鼠腦部具有明確的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過對(duì)炎性因子的表達(dá)和caspase-3、bax的激活進(jìn)行抑制及加速對(duì)bcl-2進(jìn)行激活，并減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡來對(duì)癲癇大鼠的大腦進(jìn)行保護(hù)。

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(2016-07-18收稿)

Protective effect and mechanism of ulinastatin on brain in rats with epilepsy induced by LICI-pilocarpin

HeBaoming，LiSuping，YuLiang.

Departmentofinternalmedicine,SichuanProvincialPeople'sHospital,SichuanAcademyofMedicalSciences,Chengdu610072

Objective To study the protective effect and mechanism of ulinastatin on brain in rats during seizures.Methods Wistar rats were divided into 5 groups:control group with saline,A group with saline, B group with carbamazepine,C group with carbamazepine and little amount of ulinastatin(10 000 U/kg)and D group with carbamazepine and large amount of ulinastatin(70 000 U/kg).After seizures 24 h,48 h,72 h and 96 h,the level of S100β and NSE were detected.After 96 h,the level of TNF-α and IL-1β,the expression of caspase-3,bax and bcl-2,and the apoptosis of neuron in the CA3 area of hippocampus were detected.Water maze was used to assay cognitive function.Results The injection of ulinastatin reduced the contents of S100β,NSE,caspase-3,bax,the expression of TNF-α and IL-1β,and the apoptosis of neuron,increased the content of bcl-2,and ameliorated the cognitive function of rats with epilepsy.The effect was more significant when rats were treated with higher dose of ulinastatin(P<0.05).Conclusion The protective effect of ulinastatin on brain may be through inhibiting the expression of inflammatory cytokines,the activation of caspase-3 and bax,and the apoptosis of neuron,and improving the activation of bcl-2.

Ulinastatin Epilepsy LICI-pilocarpine

610072 成都，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

R742.1

A

1007-0478(2017)01-0013-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.01.003