抗帕顆粒對帕金森病模型小鼠酪氨酸羥化酶神經元的影響

趙曉暉 朱玉萍 楊娟 劉慧琴 沈建

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·論 著·

抗帕顆粒對帕金森病模型小鼠酪氨酸羥化酶神經元的影響

趙曉暉 朱玉萍 楊娟 劉慧琴 沈建

目的 探討抗帕顆粒對1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)帕金森病(PD)模型小鼠黑質紋狀體酪氨酸羥化酶(TH)陽性神經元的影響。方法 90只健康雄性C57BL/6小鼠，鼠齡8～12周，并隨機分為3組，即正常對照組30只、PD模型對照組30只、PD模型干預組30只；MPTP腹腔注射(40 mg·kg-1·d-1×7 d)制備小鼠PD模型；正常對照組及PD模型對照組予生理鹽水1 mL·d-1灌胃，PD模型干預組給予抗帕顆粒40 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)喂養(yǎng)4個月；黑質紋狀體切片、HE染色、免疫組織化學染色TH神經元及Western blotting檢測TH蛋白的表達量。結果 ①正常對照組30只(30/30只)最終均存活，PD模型對照組4個月存活27只(27/30只)，PD模型干預組4個月存活28只(28/30只)；②PD模型對照組、PD模型干預組小鼠每次注射MPTP后先有短暫興奮[持續(xù)(7.61±2.17)min]，表現為四處竄跳，隨即出現全身中重度震顫，皮毛及尾巴時有豎立，活動減少，持續(xù)(24.23±3.89)min后震顫消失，隨后出現活動減少；③HE染色顯示正常對照組大量褐色TH陽性細胞，PD模型對照組TH陽性細胞數明顯減少，PD模型干預組TH陽性細胞數有所增加；④免疫組織化學染色后經Imagepro-Plus 5.1系統(tǒng)分析，正常對照組TH陽性細胞面積為64 145 μm2，高倍鏡下可見大量胞質為褐色顆粒的TH陽性細胞；PD模型對照組TH陽性細胞染色面積為40 012 μm2，高倍鏡下見TH細胞數明顯減少；PD模型干預組TH陽性細胞染色面積為60 952 μm2，高倍鏡下見TH陽性細胞數較PD模型對照組增加；⑤Western blotting檢測顯示正常對照組TH蛋白表達量與PD模型對照組和PD模型干預組比較均有明顯差異(P<0.001)，PD模型對照組TH蛋白表達量與PD模型干預組比較也有明顯差異(P<0.05)。結論 抗帕顆?？墒筆D小鼠黑質紋狀體中多巴胺能神經元一定程度地減少丟失，對多巴胺能神經元的數量、形態(tài)及功能具有一定的保護作用。

帕金森病 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶 小鼠模型 抗帕顆粒 酪氨酸羥化酶陽性神經元

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是神經系統(tǒng)第二大慢性退行性疾病，近年來中醫(yī)藥在PD中的治療作用日益受到關注。本研究應用名老中醫(yī)傳統(tǒng)用來治療腦卒中中痰、半身癱瘓、手足痙攣的經驗方藥抗帕顆粒，分析其現代藥理具有抗氧化應激、抗自由基及提高免疫功能等作用[1]；建立1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine,MPTP)致C57BL/6小鼠PD模型[2]；觀察抗帕顆粒對PD小鼠黑質紋狀體酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)陽性神經元的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與試劑

1.1.1 實驗動物 SPF級健康C57BL/6小鼠90只，雄性，鼠齡8～12周，體質量20～22 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司供應，許可證編號為SCXK(滬)2013-0016；實驗動物由上海交通大學附屬上海市第六人民醫(yī)院動物中心喂養(yǎng)，許可證編號為SYXK(滬)2011-0128；均飼養(yǎng)于20～25 ℃環(huán)境中，相對濕度40%～70%，工作照度150～300 Ix，動物照度15～20 Ix，12 h晝夜節(jié)律喂養(yǎng)。

1.1.2 實驗試劑 抗帕顆粒由江蘇省南通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院提供[批準文號為通制劑(2001)02-050]，MPTP購自美國Sigma公司，生物素標記的羊抗兔IgG及ABC Kit購自Vector公司，DAB-H2O2購自武漢博士德公司，兔抗大鼠TH單克隆抗體購于美國Chemicon公司，小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體、HRP標記的羊抗兔Ⅱ抗及HRP標記的羊抗小鼠Ⅱ抗購自Boster公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 90只上述健康C57BL/6小鼠隨機分為3組，即正常對照組30只、PD模型對照組30只、PD模型干預組30只。正常對照組及PD模型對照組予生理鹽水1 mL·d-1灌胃，PD模型干預組給予抗帕顆粒(濃度800 mg·mL-1)按40 mg·kg-1·d-1灌胃，每日上午9∶00～10∶00給藥，每周稱體重1次，按體重調整給藥量，連續(xù)喂養(yǎng)4個月。

正常對照組30只最終均存活；PD模型對照組4月存活27只，其中1只背部皮膚被同籠小鼠咬傷感染于第92 d死亡，另2只進食逐漸減少，分別于第102 d、114 d衰竭死亡；PD模型干預組4月存活28只，均為進食逐漸減少，于第102 d、119 d衰竭死亡。

1.2.2 PD小鼠模型制備 對照組生理鹽水0.1 mL/只，腹腔注射，1次/d，連續(xù)7 d；PD模型對照組予MPTP腹腔注射，注射劑量40 mg·kg-1·d-1×7 d；PD模型干預組予MPTP腹腔注射，注射劑量40 mg·kg-1·d-1×7 d[2]。

1.2.3 黑質紋狀體切片制備 喂養(yǎng)4個月后每組中隨機取一半小鼠即正常對照組15只，PD模型對照組13只，PD模型干預組14只腦組織被用于制作切片；將實驗小鼠以麻醉劑(Kentamine 100 mg·kg-1，Xylaxine 10 mg·kg-1，i.p)深度麻醉，經心臟依次灌注生理鹽水20 mL和多聚甲醛30 mL；灌注完畢后將小鼠斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中4 ℃條件下后固定24 h；依次浸入15%、20%和30%蔗糖溶液中4 ℃過夜后入包埋劑O.C.T中冰凍包埋；將小鼠腦切至25 μM厚切片，隔5片取一片，入PBS(0.01 mol·L-1)中4 ℃保存。

1.2.4 TH神經元HE染色 用二甲苯去蠟(經2次)5～10 min；無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各1～2 min，然后蒸餾水洗3 min；蘇木紫液染色約10 min(視染液種類和著色情況增減)；水洗，1%酸性乙醇(鹽酸1 ml，70%乙醇99 mL)或1%鹽酸分化，顯微鏡下控制；流水浸洗至少15 min，至細胞核呈藍色，也可短時水洗后浸于40 ℃溫水使核變藍；顯微鏡下觀察若核染色過深或不足，應再分化或重染；伊紅液染1～2 min后用95%乙醇2次，無水乙醇2次，每次約1～2 min；苯酚、二甲苯(1∶3)5 min；二甲苯2次，每次3～5 min；中性樹膠蓋片封片。

1.2.5 TH免疫組織化學染色 切片經0.01 mol·L-1的PBS漂洗10 min后移入抗體稀釋液包被4 h,再予0.01 mol·L-1PBS漂洗3次(每次10 min)后加入R-TH抗體，4 ℃冰箱內孵育72 h；PBS同法再漂洗3次，移入生物素標記的羊抗兔IgG 4 ℃冰箱中孵育48 h；PBS同法再漂洗3次，移入ABC溶液4 ℃孵育24 h；PBS漂洗3次，每次5 min，DAB-H2O2染色；將切片貼于載玻片上，干燥后脫水透明封片；TH抗體工作濃度1∶5 000，生物素標記的羊抗兔IgG及ABC Kit工作濃度1∶200；應用Imagepro-Plus 5.1系統(tǒng)分析小鼠腦黑質紋狀體TH染色細胞形態(tài)及面積。

1.2.6 用Western blotting 檢測TH蛋白的表達量 喂養(yǎng)4個月后每組中取余下另一半小鼠即正常對照組15只、PD模型對照組14只、PD模型干預組14只腦組織被用于提取蛋白；經麻醉和冰鹽水等灌注后斷頭取腦，冠狀位切出包含黑質的腦組織(前囟尾側4.6～6.2 mm)，然后進行勻漿裂解、離心，保留上清于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

把已提取的蛋白解凍后測定樣品的總蛋白含量；每泳道加總蛋白20 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳后電轉至硝酸纖維素膜上，封閉液封閉3 h，4 ℃孵育兔抗大鼠TH單克隆抗體(1∶500)過夜，室溫下分別孵育HRP標記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶1 000)及HRP標記的羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶1 000)1 h，X線膠片曝光1～10 min，顯影、定影；為了證實每個泳道總蛋白量相等，用剝脫液洗膜后以小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1∶500)孵育4 ℃過夜，并以HRP標記的羊抗小鼠Ⅱ抗(1∶1 000)室溫下孵育1 h，X線膠片曝光1～10 min，顯影、定影；用天能化學發(fā)光掃描儀對PVDF膜進行掃描；利用Image J軟件分析條帶吸光度，用GraphPad 6.0進行作圖分析。

2 結 果

2.1 小鼠造模情況

PD模型對照組、PD模型干預組小鼠每次注射MPTP后先有短暫興奮[持續(xù)(7.61±2.17)min]，表現為四處竄跳隨即出現全身中重度震顫，皮毛及尾巴時有豎立，活動減少，持續(xù)(24.23±3.89)min后震顫消失，隨后出現活動減少，并于各時間點以爬桿實驗、懸掛實驗、游泳實驗等行為學評分顯示，制模后15 d開始正常對照組與PD模型對照組比較各評分均有明顯差異(P<0.05)，至4個月2組比較各評分仍有明顯差異(P<0.05)。(表1～3)

表1 各組各時間點爬桿實驗得分,分)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；△P>0.05;與PD模型對照組比較，▲P>0.05,#P<0.05

2.2 各組小鼠黑質紋狀體TH神經元HE染色情況見圖1。

2.3 各組小鼠黑質紋狀體區(qū)TH免疫組化染色情況見圖2。

2.4 各組小鼠腦黑質紋狀體TH蛋白含量見圖3。

表2 各組各時間點懸掛實驗得分,分)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；△P>0.05;與PD模型對照組比較，▲P>0.05,#P<0.05

表3 各組各時間點游泳實驗得分,分)

注：與正常對照組比較，*P<0.05；△P>0.05;與PD模型對照組比較，▲P>0.05,#P<0.05

圖1 TH神經元HE染色

圖2 TH免疫組織化學染色

注:Control為正常對照組;Model為模型對照組;Drug為模型干預組;A為各組小鼠TH蛋白含量變化;B為各組小鼠TH蛋白光密度定量分析;與模型對照組比較,*P<0.05;與正常對照組比較,△P<0.001圖3 Westernblotting檢測TH蛋白表達量

3 討 論

帕金森病(PD)是一種以震顫、強直、運動減少為主要臨床表現的中老年人常見的中樞神經系統(tǒng)變性疾病，隨著PD的進展，輕者可喪失工作能力，重者生活不能自理，甚至出現抑郁、癡呆、完全喪失運動功能等。因此，PD已成為我國乃至世界各國面臨的重大醫(yī)學和社會問題。

迄今為止，醫(yī)學上還沒有預防或治愈帕金森病的方法。左旋多巴作為治療PD藥物治療的首選，在疾病早期可使患者的運動癥狀得到有效控制，遺憾的是左旋多巴的治療并不能改變神經元變性的進展過程，并且長期使用可出現療效減退及副作用等問題[1-2]，因此PD患者亟需更多更全面的治療來有效阻斷或延緩神經元的死亡。

PD的主要病理改變是中腦黑質致密部多巴胺能神經元選擇性變性丟失，目前關于神經元選擇性退行性變的原因，主要的學說有氧化應激和線粒體功能障礙等。有學者發(fā)現，PD患者腦黑質中固醇類過氧化物比正常人增加10倍[3]。近年來隨著對中醫(yī)藥研究的深入，中醫(yī)藥在PD中的治療作用日益受到關注。本研究應用的抗帕顆粒由熟地、山萸肉、紅參、生黃芪、丹參、水蛭、全蝎、僵蠶等8味中藥組成，現代藥理分析顯示抗帕顆粒中熟地能調節(jié)谷氨酸/γ-氨基丁酸系統(tǒng)遞質與受體水平，維持中樞興奮性與抑制性氨基酸功能的協調平衡，同時可降低腦線粒體單胺氧化酶活性，降低體內過氧化脂含量，具有一定的抗自由基作用[4]。山萸肉能明顯抑制二磷酸腺苷、花生四烯酸誘導的血小板聚集，同時可抑制白介素-2的產生和表達[5]。紅參中的人參皂甙有促進神經元軸突生長、清除自由基等作用，并可通過抑制氧化應激來對抗多巴胺所誘導的PC-12細胞凋亡[6]。生黃芪能提高網狀內皮系統(tǒng)的吞噬功能，增加抗體分泌細胞及T、B淋巴細胞，提高NK細胞活性，具有增強免疫的作用[7]。丹參成分中的丹參酮類、丹參素、丹酚酸類化合物等具有很強的抗氧化、抑制炎癥因子、抗氧自由基功能[8-9]。水蛭有較強的抗凝與抗血栓作用,并可減少血小板源生長因子等重要炎癥因子的產生，同時通過調節(jié)Bax/Bcl-2的表達起到抑制神經細胞凋亡的作用[10]。僵蠶通過其所含的草酸胺具有催眠與抗驚厥作用，并可提高機體免疫力[11]。全蝎可促進乙酰膽堿的釋放，并通過調節(jié)血栓素B2和6-酮-前列腺素F1α的平衡，起到保護血管內皮、預防血栓的作用[12]。從以上藥理分析看到，抗帕顆粒具有抗氧化應激、抗自由基及提高免疫功能等作用，推測這種神經元保護作用很可能在PD治療中起重要作用。

TH為多巴胺(dopamine,DA)合成的限速酶，黑質紋狀體其蛋白含量及活性降低是發(fā)病的主要原因，在黑質水平面上連續(xù)冰凍切片之后行TH神經元HE、免疫組織化學染色，觀察TH陽性神經元并計數，是評價PD病理改變的主要方法，被認為是PD的直接指示劑[13-14]。本研究結果顯示，PD模型對照組黑質紋狀體TH陽性神經元較正常對照組明顯稀疏，數量明顯減少；高倍鏡下神經元胞體變小，胞質染色變淺，細胞數量減少，突起變短，說明制模有效成功。PD模型干預組黑質紋狀體TH陽性神經元較PD模型對照組顯著增多，顯示抗帕顆粒對TH陽性神經元損害有明顯的改善作用；同時運用Western blotting檢測顯示，正常對照組TH蛋白的表達量與PD模型對照組比較有明顯差異(P<0.001)，說明模型復制成功；PD模型對照組TH蛋白的表達量與PD模型干預組比較也有明顯差異(P<0.05)，提示抗帕顆粒干預可提高PD小鼠的黑質紋狀體TH蛋白的陽性表達水平，對PD多巴胺神經元具有保護作用，而正常對照組TH蛋白的表達量與PD模型干預組比較也有明顯差異(P<0.001)，顯示抗帕顆粒干預PD雖有效，但仍不能顯著改善至正常，分析可能與PD為神經系統(tǒng)退行性、變性疾病的特性有關，同時說明中藥治療的局限性，并提示在下一步的研究中需適當延長干預時間作進一步的研究。

綜上所述，抗帕顆粒可使PD小鼠黑質紋狀體中多巴胺能神經元一定程度地減少丟失，對多巴胺能神經元的數量、形態(tài)及功能具有一定的保護作用，阻斷氧化應激反應可能是這種保護作用的關鍵機制，但還有待于擴大樣本、延長干預時間作進一步跟蹤研究，并有望在臨床進一步推廣應用。

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(2016-06-08收稿)

Effect of anti-Parkinson granule on TH positive-neurons in model mice with Parkinson disease

ZhaoXiaohui,ZhuYuping,YangJuan,etal.

DepartmentofNeurology,thePeople’sHospitalofPudong,Shanghai201200

Objective To explore the pharmaceutical effect of anti-Parkinson granule on substantia nigra and striatum Tyrosine hydroxylase(TH)-positive neurons in model mice with Parkinson disease(PD) induced by 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP).Methods 90 healthy male C57BL/ 6 mice,aged from 8 to 12 weeks,were randomly divided into 3 groups(n=30): normal control group,PD model control group and PD model intervention group.The PD model group was made through intraperitoneal injection with MPTP(40 mg·kg-1·d-1×7 d).The normal control group and the PD model control group were treated with normal saline (1 mL·d-1) intragastrically.The PD model intervention group was treated with anti-Parkinson granule solution(40 mg·kg-1·d-1) intragastrically for 4 months.TH protein expression was detected by HE staining,and immunohistochemistry staining of Western blotting in substantia nigra and striatum slices.At the end of the forth month,TH-positive neurons in substantia nigra and striatum among groups was contrasted and analyzed.Results ①30 mice(30/30 mice)were living in the normal control group,27 mice(27/30 mice)in the PD model control group,and 28 mice(28/30 mice)in the PD model intervention group; ②After injection with MPTP,mice in the PD model control group and the PD model intervention group had short excitements[continued(7.61±2.17)min] with jumping around,followed with the whole body's moderate or severe tremors,fur and tails erected timely and less movement.Tremors ceased after (24.23±3.89)min,and then the movement became less; ③HE staining showed a large number of brown TH positive cells in the control group,the number of PD model control group was significantly reduced,and the number of TH positive cells in the PD model group increased significantly; ④After analysis by Imagepro-Plus 5.1 system,TH positive cells in the normal control group ranged 64 145 μm2,and the mass amount of TH positive cells with brown cytoplasmic granular could be observed under high power microscope.TH positive cells in the PD model control group ranged 40 012 μm2,and the number of TH positive cells decreased significantly.TH positive cells in the PD model intervention group ranged 60 952 μm2,and the number of TH positive cells under high power microscope was significantly increased than that in the PD model control group; ⑤The results of TH protein expression detected by Western Blotting were as follows: the comparison between the normal control group and the PD model group wasP<0.001,between the normal control group and the PD model intervention group wasP<0.001,and between the PD model control group and the PD model intervention group wasP<0.05.Conclusion Anti-Parkinson granule can weaken the lost of TH-positive neurons in PD mice substantia nigra and striatum to some degree.Anti-Parkinson granule can partly protect dopaminergic neurons in aspects of quantity,morphology and function,and may have a hope to improve PD treatment status and a wide application in clinic.

Parkinson’s disease 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Mouse Model Anti-Parkinson granule TH-positive neuron

上海市自然科學基金項目(項目編號為13ZR1437400)

201200 上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院神經內科

R742.5

A

1007-0478(2017)01-0008-06

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.01.002