骨硬化蛋白單克隆抗體對于有去卵巢大鼠骨折愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究

謝輝

湖北省荊門市第一人民醫(yī)院創(chuàng)傷手足外科，湖北 荊門 448000

骨質(zhì)疏松骨折已經(jīng)成為公共衛(wèi)生問題，約有40%～50%的女性和13%～22%的男性一生中出現(xiàn)骨質(zhì)疏松骨折，防治骨質(zhì)疏松對臨床醫(yī)生來說是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)[1]。由于低骨密度(BMD)，骨強(qiáng)度降低，骨組織脆性增加，骨質(zhì)疏松性骨折延遲愈合，不愈合等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高[2]。經(jīng)典Wnt信號/β-聯(lián)蛋白途徑在骨折的愈合中發(fā)揮重要的作用已被人們熟知，骨硬化蛋白(Scl)，是由Wnt信號通路傳導(dǎo)中骨細(xì)胞分泌的糖蛋白的抑制劑，已被證明是骨量和骨形成的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)物[3]。最近的研究[4]表明，骨硬化蛋白單克隆抗體(Scl-Ab)有助于增加去卵巢(OVX)大鼠的骨量。綜上所述，我們假設(shè)，Scl-Ab也可能有助于骨折部位增加骨量，骨強(qiáng)度和骨形成促進(jìn)OVX大鼠骨折的愈合。

本研究通過使用骨硬化蛋白單克隆抗體來治療去卵巢大鼠股骨干骨折，觀察其療效，為臨床上此抗體的使用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

骨硬化蛋白單克隆抗體(MSD 公司)，Micro-CT (SkyScan1176，荷蘭)，手術(shù)操作器械(美國史塞克醫(yī)療器械公司)。鈣黃綠素 (sigma, 美國)，硬組織切片機(jī)(EXAKT300，德國)，顯微鏡(ZEISS Axio Imager M1，德國)，Image-Pro Plus全自動(dòng)圖像分析儀(Media Cybernetics，美國)，骨密度測量儀(法國DMS公司，Lexxos)。

1.2 方法

1.2.1 骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的建立：30只健康的雌性Sprague-Dawley大鼠(3月齡，體重 220～240 g。由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)用于去卵巢(OVX，n=25)制作骨質(zhì)疏松模型和假手術(shù)(Sham,n=5)。手術(shù)開始前，所有大鼠稱重，根據(jù)體重，適量腹腔注射10% 水合氯醛(3 mL/kg)進(jìn)行麻醉，麻醉成功后，于大鼠背部正中線中下 1/3處作一長約 2 cm 縱行切口，向兩側(cè)鈍性分離皮下軟組織，于脊柱旁開0.5 cm處鈍性分開肌肉組織，顯露卵巢脂肪包被組織，輕輕提起卵巢，于輸卵管卵巢交界處絲線結(jié)扎，完整摘除雙側(cè)卵巢，逐層縫合，關(guān)閉創(chuàng)口。

1.2.2 股骨干骨折模型的建立：適量腹腔注射10% 水合氯醛(3 mL/kg)進(jìn)行麻醉，麻醉成功后，常規(guī)消毒，取左下肢髕骨外側(cè)緣縱行切口，長約 1 cm，逐層切開皮膚及部分股四頭肌腱性組織，屈曲膝關(guān)節(jié)并向內(nèi)側(cè)脫位髕骨，充分顯露股骨髁間凹。從股骨髁間凹處逆行插入 1 根 5 mL注射器針頭沿髓腔至股骨粗隆間。剪斷多余的針頭，并將其遠(yuǎn)端埋于股骨髁間骨皮質(zhì)下。碘伏及生理鹽水反復(fù)沖洗切口后，使用 3～0 絲線逐層縫合切口。 將動(dòng)物左下肢外展內(nèi)旋位固定于造模支架上， 通過三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)的原理打擊大腿中部，致股骨中斷橫行骨折。

1.2.3 術(shù)后護(hù)理及藥物治療：術(shù)后前3 d給予青霉素肌肉注射(2. 5 萬U/kg)預(yù)防感染。正常環(huán)境下飼養(yǎng)12 w后各組取5只大鼠處死股骨行骨密度測量儀檢測來檢驗(yàn)骨質(zhì)疏松建立模型建立情況。隨后所有的去卵巢(OVX)大鼠隨機(jī)的分成兩組：OVX組、Scl-Ab組。術(shù)后第1天開始給予藥物治療：Scl-Ab組：Scl-Ab皮下注射(劑量25 mg/kg，每w 2次)，OVX組注射相同劑量的生理鹽水，直至8 w，每周稱量大鼠體重，根據(jù)體重變化來調(diào)整藥物劑量。所有大鼠在處死前第 13天以及處死前第3天, 分別腹腔內(nèi)注射15 mg/kg劑量的鈣黃綠素。本實(shí)驗(yàn)所使用的藥物劑量參考以前發(fā)表的治療骨質(zhì)疏松效果明顯的文獻(xiàn)中所使用劑量[5]。

1.2.4 Micro-CT檢測：將骨折術(shù)后8w股骨標(biāo)本置于掃描床上，掃描參數(shù)設(shè)置:電壓50 kV，電流500 μA，掃描方式為360°旋轉(zhuǎn)，曝光時(shí)間250 ms，圖像平面分辨率1024×1024。每次掃描約持續(xù)10 min，掃描完成后，選擇圓柱形的骨折區(qū)域?yàn)楦信d趣區(qū)(region of interest， ROI)，得到骨折端新生骨組織的三維圖像，并用Micro-CT內(nèi)置軟件(CT An software)進(jìn)行定量分析，獲得大鼠骨折區(qū)域骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)骨體積分?jǐn)?shù) (bone volume/total volume， BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb． Th)、骨小粱數(shù)量(trabeculae number， Tb． N)、骨小粱分離度(trabecular spacing，Tb.Sp)。

1.2.5 骨折處組織切片：待所有股骨經(jīng)過Micro-CT檢測后，去掉股骨內(nèi)置針頭后，部分標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，甲基丙烯酸甲酯包埋。包埋塊修整后置于硬組織切片機(jī)沿脛骨縱軸冠狀面切片，清洗打磨拋光，切片最終厚度約為30～40 μm，切片在熒光顯微鏡及Image-Pro Plus 6.0 全自動(dòng)圖像分析儀對骨礦化沉積率(MAR) 進(jìn)行計(jì)算。剩下的部分標(biāo)本放置在 EDTA 脫鈣液中浸泡，每3～4天換液1 次，連續(xù)脫鈣4 w，X 線檢測是否脫鈣完全，然后充分水洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋， 切片，HE染色，OLYMPUS BX5l多功能顯微鏡下觀察新生骨生長情況，骨小梁的微觀結(jié)構(gòu)及分布。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)對大鼠的影響

截止到實(shí)驗(yàn)截止時(shí)間，有2只大鼠由于手術(shù)不當(dāng)、麻醉不當(dāng)和傷口感染死亡，它們其中1只屬于OVX組，一只屬于Scl-Ab，最終共有18只去勢大鼠進(jìn)入最終試驗(yàn)結(jié)果評估。術(shù)后12 w時(shí)兩組大鼠股骨的骨密度變化骨密度測量儀檢測所得，Sham組大鼠的股骨骨密度為233.21±29.78 mg/cm2，而OVX組大鼠股骨骨密度為167.24±27.31 mg/cm2。相對Sham組，OVX組大鼠的骨密度下降42.59%(P<0.05)，結(jié)果表明我們的骨質(zhì)疏松模型建立是成功的。

2.2 Micro- CT圖片及骨微觀參數(shù)檢測

我們通過Micro- CT對骨折端感興趣區(qū)域進(jìn)行掃描的結(jié)果如圖1所示，通過內(nèi)置軟件計(jì)算的骨微觀參數(shù)如表1所示。我們可以通過觀察圖1 明顯的發(fā)現(xiàn)相對而言Scl-Ab組骨小梁的數(shù)量明顯多于OVX組，而且骨小梁聯(lián)系緊密，骨小梁更粗。骨微觀參數(shù)更加明顯的表明Scl-Ab組有最高的BV/TV、Tb.Th、Tb.N和最低Tb.Sp，而OVX組有最高的Tb.Sp和最低BV/TV、Tb.Th、Tb.N。和OVX組比較，Scl-Ab組骨微觀參數(shù)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些表明聯(lián)合使用Scl-Ab可以明顯增加去卵巢大鼠骨折端新生骨組織的生成，加速骨折的愈合。

圖1 藥物治療8 w時(shí)OVX組及Scl-Ab組大鼠股骨干骨折端Micro-CT掃描結(jié)果Fig.1 Micro-CT results of the femoral shaft fracture site in OVX and Scl-Ab group after 8 weeks of the treatment

ParameterScl-AbOVXTb.N3.234±0.115*2.124±0.090Tb.Th0.198±0.016*0.118±0.011BV/TV0.534 ±0.013*0.178±0.016Tb. Sp0.412±0.037*0.657±0.129

注：與OVX組比較。*P<0.05

2.3 組織切片觀察結(jié)果

大鼠左側(cè)股骨切片經(jīng)過HE染色結(jié)果如圖2.A所示，我們可以清楚發(fā)現(xiàn)Scl-Ab組骨折處新生骨的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于OVX組，且新生骨之間聯(lián)系緊密，排列有規(guī)律，這表明Scl-Ab明顯加速骨折端新生骨組織的形成，HE切片的觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)Micro-CT的結(jié)果。熒光共聚焦顯微鏡的觀察的結(jié)果如圖2.B所示，通過Image-Pro Plus 6.0 計(jì)算OVX組、Scl-Ab組骨礦化沉積率(MAR)結(jié)果如下：0.80±0.09、1.56±0.10；通過SPSS軟件統(tǒng)計(jì)表明各組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這表明聯(lián)合使用Scl-Ab可以加速骨折端新生骨組織的礦化。

圖2 A. 藥物治療8周時(shí)OVX組及Scl-Ab組骨痂HE染色切片B. 藥物治療8周時(shí)OVX組及Scl-Ab組骨痂礦化情況Fig.2 A. HE staining in OVX and Scl-Ab group after 8 weeks of the treatmentB. Mineralization of the callus in OVX and Scl-Ab group after 8 weeks of the treatment

3 討論

本研究通過去卵巢手術(shù)來建立骨質(zhì)疏松模型，正常狀況下飼養(yǎng)3月后通過檢測股骨骨密度變化情況來確保骨質(zhì)疏松建立是成功的；隨后通過三點(diǎn)彎曲原理建立閉合股骨中斷橫行骨折，通過使用Scl-Ab來治療去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松骨折，Scl-Ab使用8w后處死大鼠取股骨行Micro-CT、硬組織切片等評估；我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Scl-Ab可以明顯增加去卵巢大鼠股骨干骨折處新生骨組織的生成，加速骨折的愈合以及骨質(zhì)的礦化。

本實(shí)驗(yàn)主要研究的是原發(fā)性骨質(zhì)疏松狀態(tài)下的骨折，原發(fā)性骨質(zhì)疏松分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松主要由于雌激素的不足，因此，骨形成較快，但破骨更快，屬于高轉(zhuǎn)化型。老年型骨質(zhì)疏松，骨量丟失較慢，屬于低轉(zhuǎn)化型[6]。但無論哪種骨質(zhì)疏松癥，骨形成和骨吸收的平衡打破了，都將影響骨質(zhì)最終導(dǎo)致一系列的病理性骨折如做常見的骨質(zhì)疏松骨折，因此其骨折愈合能力大大下降。目前可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松骨折愈合的藥物繁多，但均存在各自的局限性。雖然雙膦酸鹽類、甲狀旁腺素類藥、地諾單抗在治療骨質(zhì)疏松骨折中都有不錯(cuò)的療效，但是常常會(huì)出現(xiàn)一些不利因素影響其臨床應(yīng)用，如雙膦酸鹽類人體吸收率低，不適用于有血栓栓塞性疾病或腎功能不全者[7]；地諾單抗使用時(shí)出現(xiàn)下頜骨壞死率[8]；甲狀旁腺素需皮下注射，應(yīng)用不便，且不可用于骨骺線尚未閉合的青少年患者[7]。

本實(shí)驗(yàn)選用的治療骨質(zhì)疏松骨折的藥物Scl-Ab在治療骨質(zhì)疏松癥也有著不錯(cuò)的效果，是目前治療骨質(zhì)疏松癥一種非常有潛力的一種藥物[4]。Scl是由SOST基因編碼，具有通過Wnt通路負(fù)向調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生蛋白活動(dòng)及骨代謝，是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的原因之一。Scl-Ab可以可拮抗骨硬化蛋白對骨形成的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，在抑制骨量丟失的同時(shí)促進(jìn)骨生成。在本實(shí)驗(yàn)中的Scl-Ab組8w時(shí),可以看見大量排列整齊且成熟的編織骨形成，且骨組織之間聯(lián)系緊密,而OVX組股骨干骨折處新生骨組織排列紊亂稀疏,且骨組織之間聯(lián)系不緊密.同時(shí),本試驗(yàn)還利用Micro-CT測定各組的新骨圍觀, Scl-Ab組的新骨密度要明顯高于OVX組 (P<0.05)。通過Micro-CT對骨微觀結(jié)構(gòu)的觀察中，發(fā)現(xiàn)Scl-Ab組與OVX組比較中，在骨小梁體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)都增高(均P<0.05)，骨小梁分離度(Tb.Sp)降低(P<0.05)，表明Scl-Ab在增加骨折端骨量的同時(shí)也改善了骨質(zhì)量。硬組織切片進(jìn)一步證實(shí)Micro-CT的結(jié)果，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)Scl-Ab明顯可以加速新生骨組織的礦化，增加骨質(zhì)強(qiáng)度。

本次試驗(yàn)也有其局限性，首先我們實(shí)驗(yàn)使用的大鼠數(shù)量有限，且時(shí)間較短，8w之后動(dòng)物骨質(zhì)疏松的具體情況不知。我們沒有從生化角度進(jìn)一步觀察Scl-Ab加速骨折愈合的具體改變，同時(shí)也沒有進(jìn)一步探索機(jī)制。但是這次試驗(yàn)從體內(nèi)很好的證實(shí)Scl-Ab可以促進(jìn)骨折端骨量的增加、加速骨組織的礦化及加速骨質(zhì)疏松骨折的愈合，為其在臨床上骨質(zhì)疏松骨折的愈合治療使用提供了理論基礎(chǔ)。