漢黃芩素通過激活活性氧簇介導(dǎo)的p38MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡

王慧蓮 孟慶良 李松偉 王濟(jì)華

1. 河南省中醫(yī)院風(fēng)濕病科，河南 鄭州 450000 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕病科，河南 鄭州 450000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫疾病，主要病理表現(xiàn)為炎癥的反復(fù)發(fā)作、滑膜組織過度增殖和功能異常，最終引起關(guān)節(jié)纖維化和關(guān)節(jié)功能障礙[1]。已經(jīng)證實(shí)成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)可表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征，呈類腫瘤細(xì)胞樣異常增殖，侵入到軟骨和軟骨下的骨質(zhì)，并產(chǎn)生炎性介質(zhì)、分泌基質(zhì)金屬蛋白酶等，其過度增殖在RA的發(fā)病過程中起到了重要作用[2-3]。因此，誘導(dǎo)人成纖維樣滑膜細(xì)胞的凋亡是治療RA的主要靶點(diǎn)。目前臨床上多采用甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺等抗腫瘤藥物治療RA患者，雖然療效明顯，但都有不良反應(yīng)多或價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，增加了患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。本研究從中醫(yī)中藥的角度研究漢黃芩素對(duì)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes，RA-FLS)凋亡的影響，探討漢黃芩素對(duì)RA潛在的治療作用。

1 材料和方法

1.1 樣本與試劑

采集2015年6至12月河南省中醫(yī)院風(fēng)濕科收治的7例RA患者關(guān)節(jié)積液標(biāo)本，其中男4例、女3例；年齡38～62歲，平均55.7歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：確診診斷均符合2010年ACR/EULR分類標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并感染者；②伴隨慢性心、肝、腎功能不全者；③合并其他自身免疫性疾病者；④合并冠心病患者；⑤合并血液系統(tǒng)疾病患者。所有患者均簽署知情同意書。體外原代培養(yǎng)人成纖維樣滑膜細(xì)胞。

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、DCFH-DA和羅丹明123熒光染料購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Annexin V/FITC 細(xì)胞凋亡試劑盒和活性氧清除劑(NAC)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所，p38MAPK抑制劑 (SB203580)購(gòu)于美國(guó)Calbiochem公司，漢黃芩素購(gòu)自南京郎澤醫(yī)藥科技有限公司(純度大于98.0%)，p-p38MAPK、p38MAPK及β-actin 的單克隆抗體及辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 成纖維樣滑膜細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

無菌采集患者關(guān)節(jié)腔積液30 mL，1000 r/min 離心10 min，棄上清后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)重懸沉淀，經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，將濾液以1000 r/min 離心10 min，再以PBS清洗沉淀2次后，用含有10%的胎牛血清及青霉素和鏈霉素各100U的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。將收集的細(xì)胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。12 h更換一次培養(yǎng)液，去除非貼壁細(xì)胞，重復(fù)2～3次。3 d后倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈梭狀成纖維樣。用胰蛋白酶法收集滑膜細(xì)胞，按細(xì)胞密度5×105個(gè)/L復(fù)種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中。后續(xù)用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞為3～5代生長(zhǎng)穩(wěn)定的成纖維樣滑膜細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞處理與分組

將純化培養(yǎng)的成纖維樣滑膜細(xì)胞按照1×103個(gè)/L接種于平底48孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)進(jìn)行處理并分組。(1)正常對(duì)照組：不加任何藥物處理，常規(guī)培養(yǎng)；(2)低劑量漢黃芩素組：加入漢黃芩素使其終濃度為20 μg/mL；(3)中劑量漢黃芩素組：加入漢黃芩素使其終濃度為50 μg/mL；(4)高劑量漢黃芩素組：加入漢黃芩素使其終濃度為100 μg/mL；(5)100 μg/mL漢黃芩素+ N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)組：細(xì)胞先加入終濃度為5 mmol/L活性氧的清除劑NAC處理12 h，然后再加入漢黃芩素，使其終濃度為100 μg/mL；(6)100 μg/mL漢黃芩素+SB203580組：細(xì)胞先加入終濃度為10 μmol/L p38MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)抑制劑SB203580處理12 h，再加入漢黃芩素使其終濃度為100 μg/mL。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取待測(cè)組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度以5×104個(gè)/mL接種于96孔板中，同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照孔(即不加細(xì)胞按照同步驟處理)，各自培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，室溫振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm處吸光度[光密度(optical delnsity，OD)值]。每組同時(shí)設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

調(diào)整待測(cè)組細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，取200 μL 細(xì)胞懸液，F(xiàn)ITC標(biāo)記的Annexin-V和PI各5 μL 混勻后避光孵育20 min，低速離心收集細(xì)胞，150 μL PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞檢測(cè)儀上樣檢測(cè)各組成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡率。

1.6 細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)含量的測(cè)定

Rh123是一種可被線粒體吸收的綠色熒光染料，其吸收值隨細(xì)胞MMP的改變而變化，因此本實(shí)驗(yàn)根據(jù)熒光強(qiáng)度來間接反映MMP的高低。將100 μL待測(cè)組細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入10 μg/L Rh123于37 ℃避光孵育45 min，再用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)不同區(qū)觀察其熒光，并用ImageJ 1.41軟件分析各視野下平均熒光強(qiáng)度，對(duì)各組細(xì)胞的每個(gè)樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)含量的檢測(cè)

DCFH-DA能夠自由通過細(xì)胞膜，被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化成有熒光的DCF，本研究通過觀察DCF的熒光強(qiáng)度分析細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。將100 μL待測(cè)組細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入10 μmol/L DCFH-DA于37 ℃避光孵育30 min，再用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)不同區(qū)觀察其熒光，并用ImageJ 1.41軟件分析各視野下平均熒光強(qiáng)度，對(duì)各組細(xì)胞的每個(gè)樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 Western blot分析p38MAPK相關(guān)蛋白的表達(dá)

收獲待測(cè)組細(xì)胞，加裂解液提取蛋白，BCA 法進(jìn)行總蛋白定量。調(diào)整上樣量為25 μg總蛋白/樣本，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉過夜。封閉完畢后PBS 洗膜5次，分別加一抗(所用的一抗稀釋比例分別為p-p38MAPK抗體11000、p38MAPK抗體11000)，37 ℃反應(yīng)1.5 h，PBS洗膜5次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，37 ℃反應(yīng)1 h，PBS洗膜5次。染色，曝光，采用BIORAD GELDOC XR 凝膠成像系統(tǒng)依次顯影、定影，Quantity One Basic 軟件分析膠片蛋白條帶。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

7例患者的關(guān)節(jié)滑液經(jīng)處理后均成功獲得大量成纖維樣細(xì)胞，經(jīng)鑒定該細(xì)胞為CD68陰性細(xì)胞，即人成纖維樣滑膜細(xì)胞。經(jīng)過反復(fù)貼壁與傳代3代后，細(xì)胞純度達(dá)到90%以上，體外生長(zhǎng)穩(wěn)定，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)基本為長(zhǎng)梭形，胞質(zhì)透亮、均勻，細(xì)胞輪廓清晰，適合后續(xù)實(shí)驗(yàn)(見圖1)。

圖1 光鏡下成纖維樣滑膜細(xì)胞形態(tài)觀察(×200)Fig.1 Morphology of RA-FLS under light microscope (×200)

2.2 漢黃芩素抑制RA-FLS細(xì)胞增殖

與正常對(duì)照組相比，不同濃度漢黃芩素處理后RA-FLS細(xì)胞各個(gè)時(shí)間點(diǎn)在490 nm下OD值均明顯減少，并且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

2.3 漢黃芩素誘導(dǎo)RA-FLS細(xì)胞凋亡

與正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率(7.69±1.46)%比較，從低劑量到高劑量漢黃芩素處理組細(xì)胞凋亡率依次為(12.32±1.65)%、(15.89±2.17)%和(19.16±2.13)%，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖2)。

表1 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖(OD值，Table 1 Proliferation of RA-FLS in each group detected with MTT assay (OD Value,

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與低劑量漢黃芩素組相比，#P<0.05；與中劑量漢黃芩素組相比，&P<0.05。

圖2 不同濃度漢黃芩素對(duì)RA-FLS細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 The effect of wogonin with different concentrations on the RA-FLS apoptosis

2.4 漢黃芩素降低RA-FLS細(xì)胞MMP水平

與正常對(duì)照組細(xì)胞Rh123的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)(反應(yīng)MMP大小的指標(biāo))(43.56±2.45)%相比，從低劑量到高劑量漢黃芩素處理組細(xì)胞中Rh123的MFI數(shù)值依次為(38.37±2.31)%、(32.76±2.89)%和(27.98±1.98)%，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

2.5 漢黃芩素增加RA-FLS細(xì)胞內(nèi)ROS生成

與正常對(duì)照組細(xì)胞中DCF的MFI(5.65±0.91)%相比，從低劑量到高劑量漢黃芩素處理組細(xì)胞中DCF的MFI數(shù)值依次為(9.28±1.02)%、(12.47±1.24)%和(15.89±1.14)%，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

2.6 漢黃芩素通過激活p38MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

與正常對(duì)照組相比，不同劑量漢黃芩素均能夠上調(diào)p-p38MAPK蛋白水平，并且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，但并不影響p38MAPK總蛋白水平。與100 μg/mL漢黃芩素組相比，100 μg/mL漢黃芩素+SB203580組中細(xì)胞p-p38MAPK蛋白水平明顯降低，同時(shí)細(xì)胞凋亡也明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖3、4)。

表2 不同劑量漢黃芩素對(duì)RA-FLS細(xì)胞MMP和ROS水平的影響Table 2 The effect of wogonin with different concentrations on the levels of MMP and ROS in RA-FLS

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與低劑量漢黃芩素組相比，#P<0.05；與中劑量漢黃芩素組相比，&P<0.05。

2.7 漢黃芩素通過介導(dǎo)ROS生成而激活p38MAPK信號(hào)通路

與100 μg/mL漢黃芩素組相比，100 μg/mL漢黃芩素+NAC組p-p38MAPK蛋白水平顯著降低，同時(shí)細(xì)胞凋亡率也顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖3、圖4)。

圖3 各組細(xì)胞中p38MAPK信號(hào)通路中相關(guān)蛋白檢測(cè)Fig.3 The protein levels of p38 MAPK in each group detected with Western blotting注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與低劑量漢黃芩素組相比，#P<0.05；與中劑量漢黃芩素組相比，&P<0.05；與100 μg/mL漢黃芩素組相比，aP<0.05。

圖4 SB203580和NAC對(duì)RA-FLS細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 The effect of SB203580 and NAC on the apoptosis of RA-FLS

3 討論

RA是目前臨床上比較常見的一種自身免疫性疾病，病因復(fù)雜。研究表明人成纖維樣滑膜細(xì)胞過度增生和分泌是RA發(fā)病的重要基礎(chǔ)，參與關(guān)節(jié)的炎性反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞[5]。因此，有效抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡能夠?yàn)榕R床治療RA提供新的靶點(diǎn)和思路。漢黃芩素是從常見中藥黃芩中提取的黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)等作用[6]。已經(jīng)證實(shí)漢黃芩素能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞的凋亡，例如白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞[7-8]。本研究探討漢黃芩素對(duì)成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡的影響以及可能的作用機(jī)制。

本研究中首先分離純化培養(yǎng)RA患者的成纖維樣滑膜細(xì)胞，經(jīng)過不同濃度漢黃芩素處理后，MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)均證實(shí)漢黃芩素能夠明顯抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。已知細(xì)胞凋亡的途徑有多種，其中線粒體損傷介導(dǎo)的凋亡是最常見的凋亡，主要表現(xiàn)為線粒體膜電位的缺失和細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。本研究在探索漢黃芩素對(duì)RA-FLS細(xì)胞凋亡機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，不同劑量漢黃芩素均能夠降低細(xì)胞線粒體膜電位，同時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量，并且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。這表明漢黃芩素通過誘導(dǎo)線粒體損傷來增加細(xì)胞的凋亡。

p38MAPK蛋白是MAPKs蛋白激酶家族的主要成員之一，絲氨酸/酪氨酸殘基可被磷酸化，細(xì)胞外多種應(yīng)激原都可引起細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的連鎖反應(yīng)，從而影響細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成和細(xì)胞表面受體表達(dá)等生物效應(yīng)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著舉足輕重的作用[9-10]。已有研究表明細(xì)胞內(nèi)ROS生成量的增加誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與p38MAPK信號(hào)通路密切相關(guān)[11-12]。本研究中發(fā)現(xiàn)不同劑量漢黃芩素能夠上調(diào)p38MAPK磷酸化水平，但不影響p38MAPK總蛋白的表達(dá)。加入p38MAPK抑制劑SB203580降低細(xì)胞中p38MAPK磷酸化水平，同時(shí)能夠明顯逆轉(zhuǎn)漢黃芩素誘導(dǎo)的RA-FLS細(xì)胞凋亡，這表明漢黃芩素通過激活p38MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)RA-FLS細(xì)胞的凋亡。另外，加入ROS清除劑NAC能夠抑制p38MAPK的磷酸化，阻斷漢黃芩素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此筆者推斷ROS生成的增加能夠誘導(dǎo)p38MAPK信號(hào)通路的激活，介導(dǎo)了漢黃芩素對(duì)RA-FLS細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。

綜上所述，漢黃芩素能夠通過誘導(dǎo)成纖維樣滑膜細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，繼而激活p38MAPK信號(hào)通路而介導(dǎo)細(xì)胞線粒體損傷相關(guān)的凋亡。