去氧穿心蓮內(nèi)酯的大鼠腸吸收特征研究

伍治中++葉玲

[摘要] 目的 檢測并分析去氧穿心蓮內(nèi)酯的油水分配系數(shù)和大鼠腸道吸收特性。 方法 采用搖瓶法和大鼠在體腸灌流模型，運用UPLC法測定去氧穿心蓮內(nèi)酯的油水分配系數(shù)、化學生物穩(wěn)定性及其在腸灌流液和膽汁中的含量。 結(jié)果 去氧穿心蓮內(nèi)酯在pH=6.5的緩沖液的油水分配系數(shù)Log P=1.45±0.12，其化學和生物穩(wěn)定性均良好；在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的吸收率分別為30.29%、28.39%、22.04%和34.63%；去氧穿心蓮內(nèi)酯膽汁排泄量為灌流藥物總量的0.146%。 結(jié)論 去氧穿心蓮內(nèi)酯在大鼠的各腸段均有吸收，不同腸段吸收率無顯著性差異。

[關(guān)鍵詞] 去氧穿心蓮內(nèi)酯；大鼠腸灌流；吸收

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（a）-0008-04

Study on the intestinal absorption characteristics of deoxydeoxyandrographolide in rats

WU Zhizhong1 YE Ling2

1.Department of Pharmacy， Shenzhen Shahe Hospital， Guangdong Province， Shenzhen 518053， China； 2.College of Pharmacy， Southern Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510000， China

[Abstract] Objective To measure and analyze the oil-water partition coefficients and intestinal absorption characteristics of deoxyandrographolide in rats. Methods The shaking method and rat intestinal perfusion model in vivo was used. Oil-water partition coefficient， chemical and biological stability were measured by UPLC， and contents in intestinal perfusate and bile were determined. Results Oil water partition coefficient Log P=1.45±0.12 of deoxyandrographolide in the HBSS （pH 6.5）， and its chemical and biological stability were well. In the perfusion model， the absorption of deoxyandrographolide in duodenum， jejunum， ileum and colon were 30.29%， 28.39%， 22.04% and 34.63%. On the other hand， deoxyandrographolide was excreted by bile with 0.146% of total prefused amount of deoxyandrographolide. Conclusion Deoxyandrographolide in various intestinal segments of rats are absorbed， but there is no significant difference on absorption rate in different intestinal segments.

[Key words] Deoxydeoxyandrographolide； Rat intestinal perfusion； Absorption

去氧穿心蓮內(nèi)酯（DAG）（結(jié)構(gòu)式見圖1），又名穿心蓮甲素，是從傳統(tǒng)中藥穿心蓮中分離得到的一種二萜內(nèi)酯類化合物，也是其活性單體之一。現(xiàn)代藥理學研究表明，去氧穿心蓮內(nèi)酯是良好的天然化療增敏劑，同時具有顯著的抗免疫、抗瘧疾作用、抗菌、抗癌、保肝作用和抗高血壓等活性[1-3]。目前，已有報道研究了穿心蓮其他活性單體如穿心蓮內(nèi)酯、去水穿心蓮內(nèi)酯等在腸吸收方面的行為[4-5]，但由于去氧穿心蓮內(nèi)酯為脂溶性化合物，水溶性較差，且在穿心蓮提取物中含量偏低的特點，使得其在腸吸收特征方面研究較少。藥物腸吸收的研究方法有多種，包括在體、離體及細胞模型法，其中觀察藥物于小腸內(nèi)吸收水平的實驗方法常選用在體大鼠腸灌流，這是現(xiàn)今藥物吸收、排泄以及代謝實驗的首選方法[6-8]。本研究采用大鼠在體腸灌流模型分析去氧穿心蓮內(nèi)酯的腸道吸收特征，為今后的應(yīng)用開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 儀器、試劑及實驗動物

1.1 儀器

1100/1200系列可變波長檢測器（VWD），北京京普科技有限公司；美國Waters BreezeTM 2高效液相色譜儀，香港德祥科技有限公司；Radwag/XA.3Y.A分析天平，廣州圍谷潤儀器有限公司；德國Eppendorf儀器：5427 R小型臺式冷凍高速離心機，蘇州達麥迪生物有限公司；KDS 53220V多通道注射泵，贊德儀器有限公司；電熱恒溫水槽SSW-600-2S，廣州步步宏科學儀器設(shè)備有限公司；Wiggens Vortex 3000渦旋振蕩器，北京乾明基因技術(shù)有限公司；pH300便攜式pH計，廣東東南科儀；SZ-96A自動純水蒸餾器，北京東南儀誠實驗室設(shè)備有限公司。

1.2 試劑及藥品

去氧穿心蓮內(nèi)酯對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度98%以上）；睪丸酮（貨號：C17322500，英文名稱：Testosterone 0，CAS號：58-22-0，規(guī)格：250 mg，上海江萊生物科技有限公司，純度98%以上）；HBSS（貨號：SH30030.02B；品名和規(guī)格：HBSS 1個，上海子起生物科技有限公司）；緩沖鹽粉末（貨號：GL0035，規(guī)格：1 L，北京百奧萊博科技有限公司）；甲醇、乙醇、乙腈、水、葡萄糖、碳酸氫鈉和氯化鈉等均為分析純。

1.3 實驗動物

Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，SPF級，動物許可證號：SYXK（京）2016-0113，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC？誖BEH C18 1.7 μm，2.1 mm×50 mm Column；檢測器：二級管陣列檢測器；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），采用梯度洗脫方法：0～0.8 min，10% B，0.8～2.0 min，10%～35% B，2.0～4.0 min，35%～50% B，4.0～4.5 min，50%～60% B，4.5～5.0min，60%～10% B；流動相流速：0.3 mL/min；檢測波長：206 nm；進樣體積10 μL。該色譜條件下，各物質(zhì)的靈敏度高，分離度好，適用于去氧穿心蓮內(nèi)酯及內(nèi)標的檢測，測試結(jié)果見圖2。

2.2 化學穩(wěn)定性考察

2.2.1 方法 HBSS緩沖液的pH值調(diào)至1.0、5.0、7.4以及8.0，將去氧穿心蓮內(nèi)酯溶解至40 μmol/L，進行37℃水浴，于0、1、2、4、6、8 h加入內(nèi)標，靜止后以13 000 r/min離心30 min，進樣采用UPLC實驗方法。觀察去氧穿心蓮內(nèi)酯的HBSS緩沖液在pH值1.0～8.0之間、8 h內(nèi)是否穩(wěn)定。每個樣品平行進行3次檢測。

2.2.2 結(jié)果 37℃條件下，處于不同pH條件下的去氧穿心蓮內(nèi)酯濃度變化見圖3，其中，去氧穿心蓮內(nèi)酯在強酸條件（pH=1）下含量有所減少，穩(wěn)定性較差；而在pH=5.0～8.0條件下穩(wěn)定性良好。

2.3 油水分配系數(shù)的測定

2.3.1 方法 配制pH為6.5的HBSS緩沖液作為水相，油相為正辛醇，使油相以及水相等體積混合，并放置于10 mL EP管內(nèi)，在水浴搖床器上振搖24 h后取出，分為上下兩層，其中正辛醇飽和的水層為下層，水飽和的正辛醇層為上層[9]。

準確稱取去氧穿心蓮內(nèi)酯，分別用上述下層溶液溶解，得到未飽和的不同濃度的供試品溶液。各供試品液取少量，用50%甲醇稀釋至線性范圍后，取少量加入內(nèi)標后分別進樣UPLC，測定初始濃度P0。分別移取供試液各1 mL，置入上層水飽和的正辛醇層溶液各1 mL，渦旋5 min后放置于恒溫振蕩器內(nèi)，37℃環(huán)境下震蕩48 h以充分平衡，渦旋離心100 r/min。充分平衡后，分離出水層，用50%甲醇稀釋到線性范圍后，加內(nèi)標按UPLC法進樣10 μL分析，記錄峰面積，計算相應(yīng)濃度Pw。按以下公式算出去氧穿心蓮內(nèi)酯的表觀油/水分配分配系數(shù)： ，并計算其數(shù)值Log P。其中，P0為去氧穿心蓮內(nèi)酯在正辛醇飽和的水中的初始濃度，Pw為分配平衡時在水相中測得的去氧穿心蓮內(nèi)酯濃度。

2.3.2 結(jié)果 去氧穿心蓮內(nèi)酯在pH=6.5的緩沖液中的油水分配系數(shù)為Log P=1.45±0.12。

2.4 大鼠在體腸灌流實驗

2.4.1 手術(shù) 開始前對進行實驗的所有大鼠禁食12 h，自由飲水。稱重后予以50%烏拉坦2.8 mL/kg腹腔注射，麻醉后，固定，剃毛，置于燈光下，維持常規(guī)體溫。沿腹中線打開腹腔（約4.0 cm），靠近十二指腸處插入膽汁導管，分別在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的兩端插聚乙烯管，并用滅菌的手術(shù)線固定。實驗時用等滲生理鹽水浸漬的紗布覆蓋于腸組織表面以保濕，用等滲生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物后換灌流液平衡30 min。實驗結(jié)束以50%烏拉坦過量注射處死試驗大鼠，剪取灌流腸段，測量并記錄各腸段長度[10]。

2.4.2 生物穩(wěn)定性考察 分別用空白HBSS緩沖液對大鼠4個腸段灌流3 h，流速為10 mL/h，然后采用此空白灌流液配制去氧穿心蓮內(nèi)酯40 μmol/L，放于37℃水浴內(nèi)，于0、1、2、4、6、8 h分別取樣，150 μL樣品加入200 μL含20 μmol/L睪酮的甲醇溶液，渦旋混勻，13 000 r/min離心30 min，取上清液，利用UPLC檢測去氧穿心蓮內(nèi)酯在不同時間點內(nèi)各個腸段中空白灌流液含量。結(jié)果顯示，在各腸道中，腸道酶對去氧穿心蓮內(nèi)酯的水解作用較弱，8 h內(nèi)幾乎無水解作用。見圖4。

2.4.3 在體腸灌流 分別在4個腸段回流，監(jiān)測去氧穿心蓮內(nèi)酯大鼠各個腸段的吸收率。精確稱重所有樣品管，得出樣品凈重和記錄。吸取4個時間段各腸段灌流液150 μL至1.5 mL離心管內(nèi)，并置入150 μL含20 μmol/L睪酮的甲醇溶液，進行渦旋混勻，13 000 r/min離心30 min，取上層清液實施UPLC檢測，其余灌流樣品于-70℃液氮內(nèi)進行保存?zhèn)錂z。

按以下方程式計算滲透系數(shù)： ；

其中，為測量因素校正因子，對流速、腸長度等因素進行修正；和分別為經(jīng)校正的進出口灌流液中藥物濃度。

按下列方程式計算腸段吸收率：Mab=Qτ（CAin-CAout），式中Mab是去氧穿心蓮內(nèi)酯的吸收量，M原為灌流前溶液，灌流的速度用Q表示，τ單一樣品收集的時間段為30 min，進口溶液的濃度（μmol/L）采用CAin表示，出口溶液的濃度（μmol/L）用CAout表示。吸收率（%）=Mab/M原。結(jié)果顯示，去氧穿心蓮內(nèi)酯在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的吸收率分別為30.29%、28.39%、22.04%和34.63%，差異不大。見圖5。

2.4.4 膽汁排泄情況 精確稱重所有樣品管，得出樣品凈重并做記錄。分別取4個時間段膽汁50 μL，加入100 μL HBSS液稀釋，再加入10 μL含200 μmol/L睪酮的甲醇溶液，13000 r/min離心30 min，取上清液進行UPLC檢測。膽汁樣品內(nèi)氧穿心蓮內(nèi)酯含量檢測結(jié)果顯示，膽汁內(nèi)去氧穿心蓮內(nèi)酯水平呈持續(xù)升高趨勢，于90 min這一時間點保持平衡，計算結(jié)果表明，膽汁內(nèi)去氧穿心蓮內(nèi)酯總量占灌流總量的0.146%。見圖6。

3 討論

體腸灌流是臨床首選用于闡明藥物在體吸收機制以及藥物動力學的簡便易行的研究手段[11-13]。已證實，利用大鼠在體腸灌流模型來預測并評價藥物在人體內(nèi)的吸收相關(guān)性好，相關(guān)系數(shù)（R2）高達0.97，其實驗結(jié)果可推。實驗優(yōu)勢在于不僅能夠在在體大鼠腸灌流實驗中保持大鼠良好的生理狀態(tài)，還可以維護腸道內(nèi)的代謝酶活性，廣泛應(yīng)用于研究藥物吸收[14-15]。因此，本研究采用大鼠腸灌流模型以進行去氧穿心蓮內(nèi)酯的腸道吸收行為與特征的研究。

結(jié)果顯示，在各腸道中腸道酶對去氧穿心蓮內(nèi)酯的水解作用較弱，8 h內(nèi)幾乎無水解作用；去氧穿心蓮內(nèi)酯在各腸段均有吸收，但總吸收量均不高；在腸灌流模型膽汁中能檢測到去氧穿心蓮內(nèi)酯，說明去氧穿心蓮內(nèi)酯經(jīng)膽汁排泄，但排泄量不大。筆者前期研究綜合了Caco-2細胞模型、MDR1-MDCKⅡ細胞模型以及大鼠在體腸灌流模型以研究穿心蓮內(nèi)酯的吸收特征，結(jié)果證實，穿心蓮內(nèi)酯于十二指腸以及空腸的吸收率較回腸及結(jié)腸顯著，其生物利用度低與磺酸化代謝和P-糖蛋白的作用密切相關(guān)[16]。脫水穿心蓮內(nèi)酯為14-去氧-11，12脫氫穿心蓮內(nèi)酯，其在腸道中的吸收較好，不發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，外排轉(zhuǎn)運蛋白也不參與其細胞的轉(zhuǎn)運[17-19]。

口服給藥途徑的優(yōu)勢為臨床給藥方便，是最常用的給藥方式[20]。因此，為緩解給藥劑型設(shè)計的盲目性以及提供劑型開發(fā)的科學依據(jù)，實驗對藥物于胃腸道的吸收轉(zhuǎn)運情況進行研究。本研究結(jié)果表明，即使去氧穿心蓮內(nèi)酯在大鼠的各腸段吸收水平不同，但其在整個腸道均有吸收，提示去氧穿心蓮內(nèi)酯的口服應(yīng)用是可行的。

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（收稿日期：2017-02-11 本文編輯：程 銘）