人外周血單個核細胞體外重編程為少突膠質(zhì)前體細胞研究

唐璽和 李 默 王淑艷 李鵬燕 張 愚 陳志國* 陳 惠

(1. 中國康復醫(yī)學研究所，北京 100053； 2. 首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院細胞治療室，北京 100053；3. 北京腦重大疾病研究院神經(jīng)損傷和修復所，北京 100053； 4. 北京神經(jīng)損傷和康復重點實驗室，北京 100053)

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人外周血單個核細胞體外重編程為少突膠質(zhì)前體細胞研究

唐璽和1，2，3，4李 默2，3王淑艷2，3李鵬燕2，3張 愚2，3陳志國2，3*陳 惠1，3，4*

(1. 中國康復醫(yī)學研究所，北京 100053； 2. 首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院細胞治療室，北京 100053；3. 北京腦重大疾病研究院神經(jīng)損傷和修復所，北京 100053； 4. 北京神經(jīng)損傷和康復重點實驗室，北京 100053)

目的 利用非整合質(zhì)粒載體在體外將成人外周血中單個核細胞重編程為少突膠質(zhì)前體細胞(oligodendrocyte progenitor cells， OPCs)。方法 經(jīng)外周靜脈采集志愿者血液5 mL，利用Ficoll-Paquem密度梯度離心法獲得單個核細胞，體外擴增培養(yǎng)后，電轉(zhuǎn)染攜帶外源基因(OCT4，SOX2，KLF4，C-myc，LIN28，Nanog)的質(zhì)粒，然后在加有化學小分子的特定培養(yǎng)基中分三步培養(yǎng)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染后30 d左右，可以獲得血小板衍生生長因子受體α(platelet-derived growth factor receptor-α， PDGFR-α)陽性的早期少突膠質(zhì)前體細胞(Pre-OPC)，該細胞能傳20 代以上，繼續(xù)分化30 d左右可以獲得表達O4的少突膠質(zhì)前體細胞。結(jié)論 利用非整合質(zhì)粒載體攜帶外源基因可以將成人外周血單個核細胞在較短期時間內(nèi)重編程為具有增生能力的早期少突膠質(zhì)前體細胞，且能繼續(xù)分化為少突膠質(zhì)前體細胞。

外周血單個核細胞；重編程；少突膠質(zhì)前體細胞

中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細胞損傷及脫髓鞘疾病，如多發(fā)性硬化、脊髓損傷等可以發(fā)生在嬰兒及成人。脫髓鞘發(fā)生后將直接導致神經(jīng)信號傳導功能障礙及神經(jīng)元凋亡，其致殘率及致死率極高[1]。內(nèi)源性少突膠質(zhì)細胞再生或者移植外源少突膠質(zhì)細胞進行髓鞘重建是可選的治療方法，已有實驗[2]證明內(nèi)源性少突膠質(zhì)細胞的再生能力及髓鞘重建能力有限，而移植外源的少突膠質(zhì)前體細胞(oligodendrocyte progenitor cells， OPCs)能在小鼠體內(nèi)形成髓鞘[3-4]，因此，移植外源少突膠質(zhì)細胞治療脫髓鞘性疾病成為近年研究的熱點，而如何獲得有功能的可用于移植的人少突膠質(zhì)前體細胞成為該研究的核心。

從流產(chǎn)胎腦中獲取少突膠質(zhì)前體細胞不但受倫理限制，而且獲取的細胞量有限。2007年，Tatahashi等[5]將人皮膚成纖維細胞重編程為多能干細胞(induced pluripotent stem cells， iPSCs)使得自體細胞移植成為可能。目前，將iPSCs成功分化為少突膠質(zhì)細胞已經(jīng)實現(xiàn)[6-8]，但是，經(jīng)由iPSCs獲取少突膠質(zhì)前體細胞的周期較長，均在3個月以上，不利于臨床應用；獲取人成纖維細胞創(chuàng)傷性較大，有合并感染風險，病人不易接受。

本研究將利用非整合質(zhì)粒載體攜帶外源基因及化學小分子將人外周血單個核細胞重編程為少突膠質(zhì)前體細胞，縮短了誘導周期，該方法是一種無創(chuàng)，快捷的獲取少突膠質(zhì)前體細胞的方法。

1 材料與方法

1.1 外周血單個核細胞的獲取及擴增

本研究已獲得首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院倫理委員會批準。室溫下，采集成人志愿者外周靜脈血5 mL儲存在含有肝素的抗凝管中，上下顛倒混勻5次。按1∶2使用PBS稀釋，存放在50 mL離心管中，稀釋后血液用PBS補足至35 mL。另取50 mL離心管盛15 mL Ficoll-Paque Premium，然后傾斜45°，將稀釋的血液緩慢流入到盛Ficoll-Paque Premium管中。25 ℃，離心30 min，離心速度為750 g，離心時，離心機制動需關(guān)閉。 離心后在離心管中上層為血漿樣物，中間云霧狀細胞即為所需要的單個核細胞層。用巴斯特管吸去上層，然后使用移液管將中間的云霧狀細胞層移至另外50 mL離心管中。在獲得的細胞層中加入30 mL PBS，350 g，4 ℃，離心10 min，此時離心機制動要打開。吸去上清，將細胞重懸在25 mL PBS中。4 ℃，300 g，離心10 min。吸去上清，將細胞重懸在25 mL PBS中。4 ℃，300 g，離心10 min。去上清，將細胞重懸在5 mL PBS中，計數(shù)。繼續(xù)在單個核細胞培養(yǎng)基中擴增，具體步驟如下：轉(zhuǎn)染當日計為Day-0，采血當日為Day-14，Day-14將離心所得的單個核細胞以2×106/mL重懸在單個核細胞培養(yǎng)基中，37 ℃，5%(體積分數(shù))CO2孵育2 d。Day-11收集細胞，離心，200 g，去上清，將細胞按1×106/mL重懸在單個核細胞培養(yǎng)基中，孵育3 d。 Day-8收集細胞，離心，200 g，去上清，將細胞按1×106/mL重懸在單個核細胞培養(yǎng)基中，孵箱中孵育4 d。Day-4收集細胞，離心，200 g，去上清，將細胞按1×106/mL 重懸在單個核細胞培養(yǎng)基中，孵育4 d。此時，單個核細胞數(shù)量略增加，細胞體積較前增大。

1.2 試劑

質(zhì)粒oriP/EBNA-1購買于美國Addgenes公司；Ficoll-Paque Premium購自美國GE公司；Human CD34 + cell nucleofection kit購自瑞士Lonzawc ngk 公司。

1.3 儀器

肝素抗凝采血管購買自BD公司；可控制溫度的高速離心機購自美國Beckman Coulter；50 mL離心管，6孔板，12孔板均購買自美國Corning公司；細胞計數(shù)板購自美國Invitroge公司；液氮凍存罐購自美國Thermo Fisher公司；細胞電轉(zhuǎn)儀購自瑞士Amaxa/Lonza公司；激光共聚焦顯微鏡購自德國Lecias公司；倒置顯微鏡 Nikon TS100/100-F購自日本Nikon公司。

1.4 培養(yǎng)基配制

單個核細胞擴增培養(yǎng)基配制方法參見文獻[9]。

1)第一階段誘導培養(yǎng)基：DMEM/F12 48%，Neural basal 48%， N2 1%，B27 1% Glutamine 1%， 非必須氨基酸(non-essential amino acid， NEAA)1%，重組人白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor， LIF)10 μg/L 購自美國Millpore公司；SB431542 2 μmol/L及CHIR99021 3 μmol/L 購自美國 Geneoperation公司。

2)第二階段培養(yǎng)基：DMEM/F12 48%，Neural basal 48%， N2 1%，B27 1%，Glutamine 1%， NEAA 1%，SAG1 1 μmol/L 購自美國Enzo公司，重組人血小板衍生長因子AB(recombinant human platelet-derived growth factor-AB，PDGF-AB) 20ng/mL 購自Peprotech公司，反維甲酸(retinoic acid， RA) 1μmol/L 購自Sigma-Aldrich公司，bFGF10 μg/L。

3)第三階段培養(yǎng)基：DMEM/F12 48%，Neural basal 48%，N2 1%，B27 1%，Glutamine 1%， NEAA 1%，T3 60 ng/mL 購自Sigma-Aldrich公司，cAMP 1 mmol/L，購自Sigma-Aldrich，SAG1 1 μmol/L，PDGF-AB 20 ng/mL。

1.5 外周血單個核細胞轉(zhuǎn)染及少突膠質(zhì)前體細胞誘導

收集擴增后的單個核細胞，將2×106單個核細胞重懸在5 mL PBS中，室溫，離心5 min，200 g，去上清后重懸在100 μL的人CD34+細胞轉(zhuǎn)染液。在以上混合液中加入3種質(zhì)粒，每種質(zhì)粒各2 μg。使用LONZA試劑盒中配的移液管將以上混合液轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)染杯中。將電轉(zhuǎn)杯放置在電轉(zhuǎn)儀中，使用T-160程序。電轉(zhuǎn)程序結(jié)束后，使用LONZA試劑盒配的移液管將電轉(zhuǎn)后的懸液移至事先在12孔板的1個孔中放置的2 mL單個核細胞培養(yǎng)基中，放置在孵箱中37 ℃，5%(體積分數(shù))CO22 d。之后在誘導第一階段培養(yǎng)基中培養(yǎng)至克隆出現(xiàn)后10 d左右。緊接著使用第二階段誘導培養(yǎng)2周，取部分細胞染色鑒定；第三階段培養(yǎng)基培養(yǎng)4周。

1.6 免疫組織化學染色

吸去細胞培養(yǎng)基，使用PBS洗3遍，冰冷的 4%(質(zhì)量分數(shù)) 多聚甲醛固定 10 min，洗滌后用 0.03%(質(zhì)量分數(shù))Triton-X100破膜3次，每次5 min，室溫下用 3%(體積分數(shù))驢血清室溫封閉 1 h 后，然后加入相應的第一抗體：兔源抗Ki-67 ( 1∶500，美國Millipore公司) 、小鼠源抗 O1 ( 1∶300，美國Ebioscience 公司) 、小鼠源抗 O4 ( 1∶200，美國Stanta Cruz 公司)，兔源性抗PDGFR-α( 1∶200，美國Stanta Cruz 公司) 、小鼠源性抗 A2B5( 1∶200，美國Abcam 公司)，兔源性抗GFAP(1∶500，美國 Dako公司)4 ℃ 過夜。PBS 清洗 3 次后，然后加入 Alexa Fluor 488 (綠)標記的驢抗兔 IgG( 1∶1 000，美國Invitrogen公司)， Alexa Fluor 488 (綠)標記的驢抗小鼠 IgM ( 1∶1 000，美國Invitrogen公司 )，Alexa Fluor 594 (紅)標記的驢抗小鼠IgG( 1∶ 800，美國Invitrogen公司 )， Alexa Fluor 594 (紅)標記的驢抗小鼠IgM( 1∶ 800，美國Invitrogen公司 )，Alexa Fluor 647標記的驢抗兔IgG( 1∶ 800，美國Invitrogen 公司)的第二抗體，室溫避光孵育2 h，然后加入 DAPI( 0.5 mg/L) 進行細胞核染色，室溫避光孵育20 min，洗滌后以50%(體積分數(shù))甘油溶液封片。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后30 d內(nèi)獲得早期少突膠質(zhì)前體細胞(Pre-OPCs)

外周血單個核細胞在體外擴增2周后形態(tài)均一(圖1A、B)，轉(zhuǎn)染后第10 天，可以獲得成團聚集的細胞(圖1C)，該細胞可以繼續(xù)擴增，在轉(zhuǎn)染20 d左右，更換為第二階段培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2周左右，光鏡下可見多個突起的細胞(圖1D)，進行免疫組織化學染色，可見PDGFR-α和A2B5陽性的細胞(圖1E、F)。此時，PDGFR-α陽性細胞數(shù)比例為(26.2±2.7)%和A2B5陽性細胞數(shù)比例為(5.5±2.5)%(圖1G)。

圖1 將人外周血單個核細胞重編程為早期少突膠質(zhì)前體細胞

A：schematic drawing of Pre-OPC generation procedure；B：adult human peripheral blood mononuclear cells were cultured for 14 days before transfection；C：a compacted colony appeared 10 days after transfection；D： Pre-OPC appeared 30 days after transfection；E： Pre-OPC express PDGFR-α；F： Pre-OPC express A2B5；G：percentage of PDGFR-α positive cells and A2b5 positive cells;Scale bars: 50 μm; OPCs:oligodendrocyte progenitor cells；PDGFR-α: platelet-derived growth factor receptor-α.

2.2 RA可以促進少突膠質(zhì)前體細胞形成

在第二階段培養(yǎng)基中不加RA組作為對照。在第二階段培養(yǎng)基分化2周后，RA組PDGFR-α陽性的細胞數(shù)(21.0±1.5)%較無RA組(3.2±1.4)%明顯增多(圖2A、B)。

2.3 早期少突膠質(zhì)細胞可以繼續(xù)分化為具有增生能力的少突膠質(zhì)前體細胞

第三階段分化培養(yǎng)基分化4周后，可見O1陽性的少突膠質(zhì)前體細胞(圖3A～D)，除了O1陽性的細胞，還有部分細胞表達GFAP (圖3B)。同時部分O4陽性的細胞同時表達ki-67(圖3E～H)。

3 討論

圖2 反維甲酸可以促進血小板衍生生長因子受體-α(PDGFR-α)陽性的細胞產(chǎn)生

A：immunostaining of cells cultured in medium added with RA or without RA. Scale bars: 50 μm； B：percentage of PDGFR-αpositive cells grown in medium with RA or without RA；PDGFR-α: platelet-derived growth factor receptor-α.

圖3 早期少突膠質(zhì)前體細胞可分化為成熟的少突膠質(zhì)前體細胞

A-D： OPC expresses O1 and partly are GFAP positive；E-H： OPC expresses O4 and partly are Ki-67 positive; Scale bars: 50 μm；OPCs:oligodendrocyte progenitor cells.

少突膠質(zhì)細胞對神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的維護以及損傷后的修復有極其重要的意義，目前，將iPSCs分化為少突膠質(zhì)前體細胞已經(jīng)獲得成功[10-11]。Wang等[7]用健康人iPSCs來源的少突膠質(zhì)前體細胞治療免疫缺陷小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘模型，有明顯治療作用。Douvaras等[8]將多發(fā)性硬化病人皮膚成纖維細胞重編程為iPSCs并分化為少突膠質(zhì)前體細胞，移植到脫髓鞘小鼠模型中后發(fā)現(xiàn)其能成熟并形成髓鞘。以上結(jié)果均說明體細胞重編程技術(shù)獲得的少突膠質(zhì)細胞是具有功能的，有細胞治療的潛力。但是從iPSCs分化為少突膠質(zhì)細胞的周期很長，Wang等[7]將iPSCs分化為少突膠質(zhì)前體細胞需要150 d。也有研究者[4，12-13]直接利用轉(zhuǎn)分化技術(shù)獲得少突膠質(zhì)前體細胞：Yang等[4]在小鼠和大鼠的皮膚成纖維細胞中直接轉(zhuǎn)入外源因子SOX10、Olig2和Zfp536可以將其轉(zhuǎn)分化為少突膠質(zhì)前體細胞，并繼續(xù)分化為有功能的成熟少突膠質(zhì)細胞；Najm等[12]應用Nkx6.2，SOX10，Olig2將小鼠肺成纖維細胞重編程為少突膠質(zhì)細胞。但是均沒有報道同樣的方法在人源起始細胞中存在作用，而且，直接轉(zhuǎn)分化很難逃脫“表觀遺傳記憶”現(xiàn)象[13]。本研究中，所轉(zhuǎn)入的外源因子OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、LIN28、NANOG后是將成體細胞重編程為一個多能的狀態(tài)，這樣可見減弱“表觀遺傳記憶效應”，然后再利用化學小分子，將其誘導為少突膠質(zhì)前體細胞。

一直以來，皮膚成纖維細胞被用做體細胞重編程的起始細胞被廣泛接受，但是就實際應用來講，皮膚成纖維細胞并不是最佳選擇。首先，獲取人成纖維細胞是一個有創(chuàng)的過程；第二，成纖維細胞在體外傳代時會發(fā)生基因突變[14-16]。本研究所用的外周血單個核細胞取材方便，創(chuàng)傷小，用于重編程前在體外擴增時間短，更加適合用于重編程。

本研究獲得的少突膠質(zhì)前體細胞，有明顯增生能力，表達Ki-67。PDGFR-α陽性的Pre-OPC可以體外傳代，能為后期的移植實驗提供足量細胞。實驗[15]證明，在少突膠質(zhì)細胞的誘導過程中，反維甲酸具有重要作用，這可能與其可以促進神經(jīng)干細胞向后腦及脊髓交界處腹側(cè)神經(jīng)元分化的作用有關(guān)，而這個部位的神經(jīng)前體細胞被認為是運動神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細胞的祖細胞。本研究所獲得的表達O1和O4的少突膠質(zhì)前體細胞，在移植之前，可以使用流式細胞篩選，以獲得純度更高的少突膠質(zhì)前體細胞。

總之，利用外周血單個核細胞作為起始細胞重編程為少突膠質(zhì)前體細胞具有創(chuàng)傷小，周期短等特點，未來有一定的應用前景。

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編輯 慕 萌

Generation of oligodendrocyte progenitor cells from human peripheral blood mononuclear cells

Tang Xihe1，2，3，4， Li Mo2，3， Wang Shuyan2，3， Li Pengyan2，3， Zhang Y. Alex2，3， Chen Zhiguo2，3*， Chen Hui1，3，4*

(1.ChinaRehabilitationResearchCenter，Beijing100053，China; 2.CellTherapyDepartment，XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity，Beijing100053，China; 3.CenterofNeuralInjuryandRepair，BeijingInstituteforBrainDisorders，Beijing100053，China; 4.BeijingKeyLaboratoryofNeuralInjuryandRehabilitation，Beijing100053，China)

Objective To generate oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) from peripheral blood mononuclear cells by episomal vectors.Methods Peripheral blood of a donor was collected by venipuncture and then mononuclear cells (MNCs) were isolated by density-based centrifugal separation. After a short period of expansion， the isolated MNCs were transfected with three plasmids expressingOCT4，SOX2，KLF4，C-MYC，LIN28，NANOG， and cultured in chemical defined medium with small molecules. Results Sixty days later， the O4 oligodendrocyte progenitor cells appeared and could be expanded more than 60 passages. Conclusion The peripheral blood MNCs can be converted to oligodendrocyte progenitor cells by non-integrative plasmid vectors.

peripheral blood mononuclear cells; cell reprogramming; oligodendrocyte progenitor cells

國家自然科學基金(81661130160)，北京市科委計劃項目 (Z151100001615055)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81661130160)， Beijing Municipal Science and Technology Commission (Z151100001615055).

時間：2017-07-16 17∶34 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20170716.1734.048.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.04.013]

R329.2

2016-06-14)

*Corresponding authors， E-mail：chenzhiguo@gmail.com， chenhui55299@163.com