孕期尼古丁暴露致成年雄性仔鼠心肌纖維化

董偉家，李希寧，夏志恒，張于娟

（1.湖州師范學院醫(yī)學院護理學院人體解剖與組織胚胎系，浙江湖州313000；2.蘇州大學基礎(chǔ)醫(yī)學與生物科學院和醫(yī)學部人體解剖與組織胚胎系，江蘇蘇州215123）

孕期尼古丁暴露致成年雄性仔鼠心肌纖維化

董偉家1，李希寧1，夏志恒1，張于娟2

（1.湖州師范學院醫(yī)學院護理學院人體解剖與組織胚胎系，浙江湖州313000；2.蘇州大學基礎(chǔ)醫(yī)學與生物科學院和醫(yī)學部人體解剖與組織胚胎系，江蘇蘇州215123）

目的 研究孕期尼古丁暴露對子代大鼠心射血功能和心肌纖維化的影響。方法尼古丁暴露組孕鼠從妊娠第4～20天每天sc尼古丁6.0 mg·kg-1，連續(xù)17 d，正常對照組sc生理鹽水。檢測孕21 d胎鼠、出生后15和90 d雄性仔鼠的體質(zhì)量和心臟質(zhì)量。心電圖記錄90 d雄性仔鼠的心率；多普勒超聲儀檢測仔鼠心射血功能，包括每搏輸出量（SV）、心輸出量（CO）、左室長軸縮短分數(shù)（FS）、射血分數(shù)（EF）、左室后壁舒張期厚度（LVPWd）和室間隔舒張期厚度（IVSd）；電鏡檢測心肌超微結(jié)構(gòu)，Masson染色定性檢測心肌膠原蛋白的沉積，放射免疫法定量檢測心肌組織Ⅰ型膠原蛋白水平。結(jié)果 與正常對照組仔鼠比較，孕期尼古丁暴露組21 d胎鼠和15 d雄性仔鼠心臟質(zhì)量和體質(zhì)量下降（P＜0.05，P＜0.01），但90 d雄性仔鼠的心臟質(zhì)量和體質(zhì)量無明顯差異。尼古丁暴露組90 d雄性仔鼠心率升高〔366±10 vs（418±10）min-1〕（P＜0.05）；超聲心動圖檢測顯示，CO，F(xiàn)S和EF明顯降低（P＜0.01），IVSd和LVPWd明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）；電鏡觀察顯示，心肌纖維紊亂，細胞外基質(zhì)增加；Masson染色顯示，心肌膠原蛋白沉積；放射免疫法檢測結(jié)果 顯示，心肌組織Ⅰ型膠原蛋白水平升高〔0.59±0.09 vs（0.40±0.05）μg·g-1組織〕（P＜0.01）。結(jié)論孕期尼古丁暴露可導致成年雄性仔鼠心肌組織Ⅰ型膠原蛋白水平升高，心肌纖維化，心射血功能下降。這些病理變化可能導致其心血管疾病易感性增加。

尼古??；懷孕；心射血功能；心肌纖維化；Ⅰ型膠原蛋白

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.018

主動或被動吸煙是孕婦最易接觸到的不良刺激之一。尼古丁是煙氣的主要成分，可以直接通過胎盤進入胎兒體內(nèi)濃縮聚集，其濃度可比母體內(nèi)高15%。因此，孕期的尼古丁暴露更易導致對胎兒的損傷［1］?；A(chǔ)研究和流行病學調(diào)查顯示，孕期尼古丁暴露可導致子代心血管疾病易感性增加，如高血壓、冠心病、肥胖和胰島素抵抗等［2-6］。進一步的研究顯示，孕期的尼古丁暴露會導致子代大鼠心肌組織重構(gòu)，包括心肌細胞肥大、肌球蛋白重鏈增加以及膠原蛋白沉積等［7］，而這些變化是心肌纖維化的病理基礎(chǔ)。心肌組織纖維化是指膠原蛋白在心肌組織細胞外基質(zhì)中沉積，從而導致心臟收縮和舒張功能的障礙，影響心射血功能［8］。Ⅰ型膠原蛋白由成纖維細胞分泌，是膠原纖維的主要成分，決定了組織的韌性。在心肌組織中Ⅰ型膠原蛋白主要分布在心肌細胞間質(zhì)中，其組成纖維的彈性和伸展性較小，有較強的抗牽拉作用［9］，但當心肌組織發(fā)生纖維化病變時，其顯著特點即為Ⅰ型膠原蛋白水平增加，導致心收縮和舒張功能障礙，進而導致心臟的射血功能下降［10］。因此，Ⅰ型膠原蛋白的正常表達對心臟的射血功能至關(guān)重要。

前期的研究顯示，孕期的尼古丁暴露會導致成年雄性子代大鼠心率增加［11］，但是機制不明。本研究主要探討孕期尼古丁暴露對雄性子代大鼠心臟射血功能和心肌組織纖維化的影響，期望從病理生理學角度對子代大鼠心率增加的可能機制加以探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌、雄SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量250～300 g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司〔生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013-0006；使用許可證號：SYXK（滬）2012-0006；動物合格證號：2010002608320〕。大鼠分籠單獨飼養(yǎng)，控制光照（12/12 h晝/夜循環(huán)），自由飲食飲水。

1.2 主要試劑和儀器

尼古丁注射液（6 g·L-1，Sigma公司，美國），臨用時用生理鹽水新鮮配制；Masson染液（上海遠慕生物科技有限公司）；Ⅰ型膠原蛋白放免檢測試劑盒（上海捷瑞生物有限公司）。心臟超聲儀（Philips iE33，美國）；電鏡（場發(fā)射掃描電鏡，SIRION-100，荷蘭FEI公司）；光學顯微鏡（Olympus CHK2-F-GS，日本）；γ-計數(shù)器（GC-1500，北京科普順科技有限公司）；心電圖機（科曼CM300，中國）。

1.3 大鼠分組和染毒

于18∶00將雌、雄大鼠隨機合籠，次日8∶00觀察鼠籠底盤，有白色陰道栓雌鼠即為交配成功，當日記為孕第1天。將懷孕4 d的28只孕鼠隨機分為2組，每組14只。實驗組孕鼠每天8∶00～9∶00 sc給予尼古丁6.0 mg·kg-1，該尼古丁劑量近似于中、重度吸煙者的尼古丁攝入量［1］，連續(xù)注射17 d。正常組孕鼠sc給予生理鹽水0.3 mL。妊娠第21天9∶00，2組孕鼠各隨機選取7只處死，取胎鼠（實驗當日不注射尼古?。y量體質(zhì)量和心臟質(zhì)量。其他孕鼠21～22 d正常分娩。仔鼠于出生15和90 d時檢測體質(zhì)量。30 d時仔鼠雌雄分籠，為避免雌激素和孕激素的影響，僅選取雄性仔鼠用于實驗指標的檢測。

1.4 仔鼠心率和射血功能檢測

將90 d仔鼠置于塑料桶內(nèi)，心電圖機的3個電極分別連接到仔鼠的左前肢、右前肢和左后肢。仔鼠處于清醒狀態(tài)下檢測心電圖，選擇記錄平穩(wěn)狀態(tài)下的心電圖，計算心率。之后ip給予10%水合氯醛0.8 mL·kg-1麻醉進行心臟超聲檢測。胸部剃毛，將探頭用耦合劑置于胸腔部位。超聲心動圖以胸骨旁長軸切面和心尖四腔平面進行檢查，分別記錄每搏輸出量（stroke volume，SV）、心輸出量（cardiac output，CO）、左室長軸縮短分數(shù)（left ventricular long axis shortening fraction，F(xiàn)S）、射血分數(shù)（ejection fraction，EF）、左室后壁舒張期厚度（left ventricular posterior wall diastolic diameter，LVPWd）和室間隔舒張期厚度（interventricular septum diastolic diameter，IVSd）。

1.5 電鏡觀察仔鼠心肌超微結(jié)構(gòu)

功能檢查完成后，將仔鼠以胸骨旁切口開胸，從主動脈根部取出心臟，生理鹽水快速沖洗，選取左心室部分，以刀片切取約3 mm×3 mm×3 mm的心肌組織，置于2.5%戊二醛液中固定。掃描電鏡檢查由浙江大學紫金港校區(qū)電鏡室完成。

1.6 Masson染色檢測仔鼠心肌膠原蛋白沉積和放射免疫法檢測Ⅰ型膠原蛋白水平

刀片切取約5 mm×5 mm×5 mm左心室心肌組織，固定，切片，脫蠟至水；Masson復合染色液染色5 min；0.2%醋酸水溶液浸洗；5%磷鎢酸水溶液分化8 min；0.2%醋酸水溶液浸洗2次；苯胺藍染色液染色5 min，0.2%醋酸水溶液洗2次；無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察有無膠原蛋白沉積。正常心肌組織呈紅色，藍色提示纖維蛋白沉積。

放射免疫法檢測Ⅰ型膠原蛋白水平，由上海捷瑞生物有限公司完成。具體操作如下：心肌組織塊稱重，剪碎，加入9倍體積的PBS液，冰浴中用勻漿器研磨制備勻漿，894×g離心8 min，取上清液0.1 mL加入0.4 mL PBS液，稀釋成2%勻漿上清進行檢測。樣品在室溫平衡30 min，標準品、質(zhì)控血清和樣品各50 μL加入已包被［I125］抗Ⅰ型膠原蛋白抗體的試管，各管再加入200 μL溫育液，室溫搖床2 h，用洗滌液1000 μL清洗，吸干；再重復清洗2次，吸干1次。γ-計數(shù)器測定每管1 min的放射性強度計數(shù)，依據(jù)標準曲線和質(zhì)控血清計算樣品中Ⅰ型膠原蛋白濃度。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 孕期尼古丁暴露對仔鼠心臟和體質(zhì)量的影響

孕鼠尼古丁暴露導致21 d胎鼠和15 d雄性仔鼠的體質(zhì)量和心臟質(zhì)量較正常對照組降低（P＜0.01），90 d時無明顯差異（表1）。

2.2 孕期尼古丁暴露對成年雄性仔鼠心率和射血功能的影響

出生后90 d，正常對照組和尼古丁暴露組雄性仔鼠的心率分別為366±10和（418±10）min-1，孕鼠尼古丁暴露顯著增加了成年雄性仔鼠的心率（P＜0.01）。心臟超聲心動圖顯示，與正常對照組比較，尼古丁暴露組仔鼠的CO，F(xiàn)S和EF明顯降低（P＜0.01），IVSd（P＜0.05）和LVPWd（P＜0.01）明顯升高；SV降低約35%，但無統(tǒng)計學意義，其原因可能是個體差異較大且觀察例數(shù)較少所致（表2）。提示尼古丁暴露組雄性仔鼠心臟的舒縮功能下降。

Tab.1 Effect of prenatal nicotine exposure on body mass and heart mass of 21 d fetal rats and offsprings

Tab.2 Effect of prenatal nicotine exposure on heart ejection function of offspring

2.3 孕期尼古丁暴露對成年雄性仔鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響

電鏡觀察顯示，正常對照組仔鼠心肌纖維排列整齊規(guī)則，M線和Z線清晰；尼古丁暴露組仔鼠心肌纖維排列紊亂，部分纖維斷裂，心肌纖維間隙增大，間充質(zhì)增多，但M線和Z線仍可見（圖1）。

Fig.1 Effect of prenatal nicotine exposure on cardiac ultrasturcture of offspring observed under an electron microxcope.See Tab.1 for the rat treatment.↑shows cardiac myofibril；?shows M line；↑shows Z line.

2.4 孕期尼古丁暴露對成年雄性仔鼠心肌組織Ⅰ型膠原蛋白水平的影響

Masson染色（圖2）顯示，正常對照組雄性仔鼠心肌纖維表面呈暗紅色，均勻一致；而尼古丁暴露組心肌纖維表面部分呈深藍色，提示有膠原蛋白沉積。放射免疫法檢測結(jié)果 顯示，尼古丁暴露組雄性仔鼠心肌組織Ⅰ型膠原蛋白為（0.59±0.09）μg·g-1組織（n=5），較正常對照組（0.40±0.05）μg·g-1組織（n=6）明顯升高（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of prenatal nicotine exposure on myocardial tissue of offspring observed by Masson staining.See Tab.1 for the rat treatment.The arrows show collagen protein.

3 討論

本研究結(jié)果 顯示，孕鼠尼古丁暴露導致孕21d胎鼠和出生15 d仔鼠的心臟質(zhì)量和體質(zhì)量低于正常對照組，可能有2個原因：①尼古丁的直接毒性作用。尼古丁可以通過胎盤并在胎兒體內(nèi)濃縮并聚集，濃度可高于母體的15%，高濃度尼古丁可直接影響胎兒的發(fā)育，導致其體質(zhì)量和重要臟器質(zhì)量下降［1］。②尼古丁可以降低子宮和胎盤的血流量，導致胎兒缺血低氧［12］，進一步導致胎鼠宮內(nèi)生長發(fā)育受限［13］。但本研究中，90 d雄性仔鼠的心臟質(zhì)量和體質(zhì)量與正常對照組比較無顯著差異，說明尼古丁暴露組雄性仔鼠出生后出現(xiàn)了“追趕性生長（catchup growth）”。追趕性生長主要是由于胎兒在宮內(nèi)受到不良因素的刺激，導致宮內(nèi)生長受限，胎兒出生時體質(zhì)量較低，出生后主要通過細胞增大或者間充質(zhì)增生等，于成年后達到正常子代體質(zhì)量［14］。追趕性生長雖然實現(xiàn)了體質(zhì)量的正常，但器官的功能與正常子代可能存在差異，其代償功能可能下降［15-16］。本研究結(jié)果 顯示，尼古丁暴露組雄性仔鼠心臟舒縮功能下降，射血功能降低，心率代償性增高。可見90 d的雄性仔鼠心臟質(zhì)量雖然與正常對照組仔鼠無明顯差異，但心臟射血功能受損。

至于心臟功能受損的潛在機制，有報道提示，孕期尼古丁暴露會導致子代心肌組織重構(gòu)，包括心肌細胞肥大、肌球蛋白比重增加和膠原蛋白沉積等［7］。本研究用電鏡檢測了仔鼠心肌的超微結(jié)構(gòu)，可見尼古丁暴露組仔鼠心肌肌原纖維排列紊亂，部分肌原纖維斷裂，肌原纖維間隙增大，間充質(zhì)增多。

心肌組織纖維化的主要本質(zhì)是細胞基質(zhì)的重塑，膠原蛋白沉積，部分伴有心肌肥大［17］。本研究Masson染色結(jié)果 顯示，尼古丁暴露組雄性仔鼠心肌纖維表面部分呈深藍色，說明有膠原蛋白沉積，這與電鏡觀察的結(jié)果 一致。心肌組織Ⅰ型膠原蛋白水平檢測結(jié)果 也顯示，尼古丁暴露組雄性仔鼠心肌組織Ⅰ型膠原蛋白水平明顯上升。Ⅰ型膠原蛋白由成纖維細胞分泌，是膠原纖維的主要成分，決定了組織的韌性，其組成的纖維彈性和伸展性較小，有較強的抗牽拉作用［9］，但當心肌組織發(fā)生纖維化病變時，其顯著特點即為Ⅰ型膠原蛋白水平增加，導致心臟的收縮和舒張功能障礙，進而導致心臟的射血功能下降，心率增加［10］。

綜上提示，孕期尼古丁暴露可導致雄性仔鼠心肌組織出現(xiàn)Ⅰ型膠原蛋白沉積，從而導致心肌組織纖維化，心臟舒縮功能下降，心輸出量減少，心率代償性增加。這也可以解釋孕期尼古丁暴露導致仔鼠心率增加的原因［11］。但是，尼古丁是直接通過表觀遺傳學機制導致心肌纖維化，還是由于其使心臟功能下降間接導致心肌纖維化并不明確，還需要進一步探討。本課題組將對孕期尼古丁暴露大鼠子二代相關(guān)指標進行檢測分析，并對胎源性疾病機制進行深入研究。

［1］Slotkin TA.Fetal nicotine or cocaine exposure：which one is worse？［J］.J Pharmacol Exp Ther，1998，285（3）：931-945.

［2］Xiao D，Xu Z，Huang X，Longo LD，Yang S，Zhang L.Prenatal gender-related nicotine exposure increases blood pressure response to angiotensinⅡin adult offspring［J］.Hypertension，2008，51（4）：1239-1247.

［3］Lawrence J，Xiao D，Xue Q，Rejali M，Yang S，Zhang L.Prenatal nicotine exposure increases heart susceptibility to ischemia/reperfusion injury in adult offspring［J］.J Pharmacol Exp Ther，2008，324（1）：331-341.

［4］Xiao DL.Fetal nicotine exposure increases the risk of cardiovascular disease in late life.A review of the literature［J］.Austin J PharmacolTher，2014，2（11）：1-6.

［5］Somm E，Schwitzgebel VM，Vauthay DM，Aubert ML，Hüppi PS.Prenatal nicotine exposure and the programming of metabolic and cardiovascular disorders［J］.Mol Cell Endocrinol，2009，304（1-2）：69-77.

［6］Behl M，Rao D，Aagaard K，Davidson TL，Levin ED，Slotkin TA，et al.Evaluation of the association between maternal smoking，childhood obesity，and metabolic disorders：a National Toxicology Program Workshop review［J］.Environ Health Perspect，2013，121（2）：170-180.

［7］Chou HC，Chen CM.Maternal nicotine exposure during gestation and lactation induces cardiac remodeling in rat offspring［J］.Reprod Toxicol，2014，50：4-10.

［8］Ma J，Ding C.Research progress on cardiac fibroblasts and myocardial fibrosis［J］.Chin J Cardiol（中華心血管病雜志）。2014，42（3）：269-272.

［9］Rosin NL.Molecular mechanisms of myocardial fibrosis development［D］.Halifax，Nova Scotia：Dalhousie University，2014.

［10］Goldsmith EC，Bradshaw AD，Zile MR，Spinale FG. Myocardial fibroblast-matrix interactions and potential therapeutic targets［J］.J Mol Cell Cardiol，2014，70：92-99.

［11］Feng Y，Caiping M，Li C，Can R，F(xiàn)eichao X，Li Z，et al.Fetal and offspring arrhythmia following exposure to nicotine during pregnancy［J］.J Appl Toxicol，2010，30（1）：53-88.

［12］Wong MK，Nicholson CJ，Holloway AC，Hardy DB. Maternal nicotine exposure leads to impaired disulfide bond formation and augmented endoplasmic reticulum stress in the rat placenta［J］.PLoS One，2015，10（3）：e0122295.

［13］Huang LZ，Hsiao SH，Trzeciakowski J，F(xiàn)rye GD，Winzer-Serhan UH.Chronic nicotine induces growth retardation in neonatal rat pups［J］.Life Sci，2006，78（13）：1483-1493.

［14］Embleton ND，Korada M，Wood CL，Pearce MS，Swamy R，Cheetham TD.Catch-up growth and metabolic outcomes in adolescents born preterm［J］.Arch Dis Child，2016，101（11）：1026-1031.

［15］Stawerska R，Sza?apska M，Hilczer M，Lewiński A. Ghrelin，insulin-like growth factor I and adipocytokines concentrations in born small for gestational age prepubertal children after the catch-up growth［J］.J Pediatr Endocrinol Metab，2016，29（8）：939-945.

［16］Alves JG，Vasconcelos SA，de Almeida TS，Lages R，Just E.Influence of catch-up growth on abdominal fat distribution in very low birth weight children-cohort study［J］.J Pediatr Endocrinol Metab，2015，28（1-2）：153-156.

［17］Díez J.Mechanisms of cardiac fibrosis in hypertension［J］.J Clin Hypertens（Greenwich），2007，9（7）：546-550.

Prenatal nicotine exposure induces cardiac fibrosis in adult male offspring

DONG Wei-jia1,LI Xi-ning1,XIA Zhi-heng1,ZHANG Yu-juan2
(1.Department of Human Anatomy Histology and Embryology,School of Medicine and Nursing Science, Huzhou University,Huzhou 313000,China;2.Department of Human Anatomy,Histology and Embryology, School of Biology and Basic Medical Sciences,Suzhou University,Suzhou 215123,China)

OBJECTlVETo investigate the effect of prenatal nicotine exposure on cardiac ejection function and myocardial fibrosis of the offspring of rats.METHODSPregnant rats were sc given nicotine 6.0 mg·kg-1,once daily for 17 d.The body mass and heart mass of the offspring were detected at the 21thday of gestation,and 15 and 90 d after birth.Heart rate of 90 d offspring was recorded by ECG,and cardiac functions were detected by Doppler ultrasonography,including cardiac output(CO),stroke volume(SV), ejection fraction(EF),left ventricular long axis shortening fraction(FS),interventricular septum diastolic diameter(IVSd)and left ventricular posterior wall diastolic diameter(LVPWd).The myocardial ultrastructure was detected under an electron microscope.Masson staining was used to detect the myocardial collagen fiber deposition.The level of collagen protein typeⅠin heart tissue was detected by radioimmunoassay.RESULTSCompared with control group,prenatal nicotine exposure resulted in a decrease of heart mass and body mass in groups of 21 d fetal rats and 15 d offspring(P＜0.05,P＜0.01),but had no effect on the 90 d offspring.Compared with the normal control group,the heart rate of 90 d offspring increased〔366+10 vs(418+10)min-1〕(P＜0.05),CO,FS and EF decreased(P＜0.01),and IVSd and LVPWd increased(P＜0.05,P＜0.01).Electron microscopy revealed that in the heart of nicotine 90 d offspring,myocardial fiber arrangement was loosened and confused,while extracellular matrix increased.Masson staining showed collagen deposited in the myocardium.The level of collagen typeⅠin heart tissue increased〔0.59±0.09 vs (0.40±0.05)μg·g-1tissue〕(P＜0.01).CONCLUSlONPrenatal nicotine exposure induces the increased level of cardiac collagen typeⅠ,myocardial fibrosis and decrease of cardiac ejection function in adult offspring, which may lead to increased susceptibility to cardiovascular diseases.

nicotine;pregnancy;cardiac ejection function;myocardial fibrosis;collagen typeⅠ

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81200482);and Natural Science Research Project of Colleges and Universitys in Jiangsu Province(SZ2170311)

DONG Wei-jia,E-mail:dwj@zjhu.edu.cn,Tel:(0572)2322569

R99

A

1000-3002-（2017）06-0621-05

2016-10-26接受日期：2017-05-27）

（本文編輯：齊春會）

國家自然科學基金（81200482）；江蘇省高校自然科學研究項目（SZ2170311）

董偉家，男，實驗師，主要從事心血管疾病的相關(guān)研究。

董偉家，E-mail：dwj@zjhu.edu.cn，Tel：（0572）2322569