補(bǔ)骨脂水煎液和醇提物對(duì)斑馬魚(yú)骨骼發(fā)育的影響及其毒性作用

陳穎，王茉，宋捷，詹揚(yáng)，景莉君，陳書(shū)芹，賈曉斌，韋英杰

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室，江蘇南京210028；3.中國(guó)人民解放軍93038部隊(duì)醫(yī)院，吉林通化135300）

補(bǔ)骨脂水煎液和醇提物對(duì)斑馬魚(yú)骨骼發(fā)育的影響及其毒性作用

陳穎1，2，王茉3，宋捷1，2，詹揚(yáng)2，景莉君1，2，陳書(shū)芹2，賈曉斌1，2，韋英杰1，2

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室，江蘇南京210028；3.中國(guó)人民解放軍93038部隊(duì)醫(yī)院，吉林通化135300）

目的 研究補(bǔ)骨脂水煎液（WD）和醇提物（EE）促骨骼發(fā)育與安全性的差異。方法將受精后3 d（3 dpf）斑馬魚(yú)幼魚(yú)暴露于潑尼松龍（PN）25 μmol·L-1和WD或EE 0.1，1，10和100 mg生藥·L-1，以及依替膦酸二鈉（ED）30 mg·L-1溶液中，隔天換液至9 dpf處死。茜素紅染色光學(xué)顯微鏡觀察斑馬魚(yú)頭骨骨礦化面積和骨密度，熒光定量PCR法檢測(cè)9 dpf斑馬魚(yú)骨保護(hù)素（OPG）和NF-κB受體活化因子配體（RANKL）mRNA表達(dá)。另將1 dpf斑馬魚(yú)胚胎置于EE 10，20，30，35，40，50和60 mg生藥·L-1、WD 10，50，100，125，150，175，200和500 mg生藥·L-1、補(bǔ)骨脂素（PS）12.5，25，50，100，200和400 μmol·L-1及補(bǔ)骨脂酚（BK）1，5，10，25和50 μmol·L-1溶液中，光鏡檢測(cè)3 dpf斑馬魚(yú)胚胎形態(tài)，觀察記錄給藥后2～9 dpf胚胎或幼魚(yú)死亡數(shù)，SPSS軟件計(jì)算4，6和9 dpf LC50；另用速率法檢測(cè)6 dpf斑馬幼魚(yú)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性。結(jié)果 與模型組相比，EE 0.1 mg生藥·L-1和WD 1 mg生藥·L-1能顯著增加斑馬魚(yú)頭部骨骼染色面積和骨密度（P＜0.01），提示增加骨礦化量；且WD和EE 1 mg生藥·L-1均上調(diào)OPG mRNA、下調(diào)RANKL mRNA表達(dá)水平（P＜0.01），OPG/RANKL比值顯著提高（P＜0.01）。EE，WD，PS和BK可致斑馬魚(yú)心包、卵黃囊腫大，GOT活性降低（P＜0.01），WD和PS的LC50值分別為EE和BK的4～7倍和4.3～20倍。結(jié)論EE較WD促骨骼發(fā)育活性強(qiáng)，且毒性更大，提示脂溶性特征性成分可能是起效或致毒的關(guān)鍵成分。

斑馬魚(yú)；補(bǔ)骨脂；骨骼發(fā)育

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.024

一直以來(lái)，中藥治療骨科疾病因安全性好且副作用相對(duì)較小而受到青睞［1］。但近年來(lái)，應(yīng)用范圍廣、社會(huì)關(guān)注度高的壯骨中藥如淫羊藿和補(bǔ)骨脂等的肝毒性已引起重視，為臨床應(yīng)用帶來(lái)挑戰(zhàn)［2］。因此早期、快速辨識(shí)這類(lèi)中藥的促骨骼發(fā)育活性及其安全性具有意義。傳統(tǒng)哺乳動(dòng)物促骨骼發(fā)育模型和毒性模型耗時(shí)長(zhǎng)且成本高，不適于早期高效篩選；體外細(xì)胞毒模型不能體現(xiàn)在體實(shí)驗(yàn)的綜合效果；而斑馬幼魚(yú)魚(yú)體透明，可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察藥物毒性［3-4］。斑馬魚(yú)骨骼發(fā)育模型可突破量微成分難以進(jìn)行促進(jìn)骨骼發(fā)育活性在體評(píng)價(jià)的技術(shù)瓶頸，實(shí)現(xiàn)在體化、微板化、簡(jiǎn)單和高效篩選［5-8］，達(dá)到兼顧有效性和安全性的促進(jìn)骨骼發(fā)育中藥高效篩選目的［9］。

中藥補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實(shí)，具有溫腎助陽(yáng)、納氣平喘、溫脾止瀉等功效［10］。香豆素類(lèi)是補(bǔ)骨脂促骨骼發(fā)育主要活性成分和研究對(duì)象［11-13］。但近年來(lái)補(bǔ)骨脂的安全隱患逐漸顯現(xiàn)，補(bǔ)骨脂及含補(bǔ)骨脂的知名壯骨中藥如壯骨關(guān)節(jié)丸和仙靈骨葆的肝損傷不良反應(yīng)日益受到重視［14-15］。補(bǔ)骨脂的毒性研究主要采用大鼠、小鼠在體模型或體外肝、腎細(xì)胞等模型，研究對(duì)象主要為補(bǔ)骨脂及不同炮制品［16-17］，以及補(bǔ)骨脂素（psoralen，PS）和補(bǔ)骨脂酚（bakuchiol，BK）等成分［18-19］。本研究擬選擇具有一定毒性或藥效研究基礎(chǔ)的補(bǔ)骨脂為代表，用斑馬魚(yú)評(píng)價(jià)補(bǔ)骨脂醇提取物（ethanol extract，EE）和水煎液（water decoc-tion，WD）促骨骼發(fā)育活性，觀察EE和WD對(duì)骨骼發(fā)育的影響及毒性作用差異。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

6～10月齡斑馬魚(yú)為德國(guó)Tuebingen品系，南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供。補(bǔ)骨脂（南京松齡中藥飲片有限公司，四川產(chǎn)地）；PS和依替膦酸二鈉（etidronate disodium，ED）（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：0739-9706和101174-201001）；BK（南京景竹生物科技有限公司，批號(hào)：JZ15041203）；潑尼松龍（prednisolone，PN）（蘇州亞科化學(xué)試劑股份有限公司，批號(hào)：YK2012020101）；茜素紅S（鄭州四季化工產(chǎn)品有限公司，批號(hào)：Sj20110806）；RNA提取試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（美國(guó)Promega公司）；2×PCR混合液（美國(guó)Vazyme公司）；熒光定量試劑盒（瑞士Roche公司）；根據(jù)斑馬魚(yú)核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for NF-κB ligand，RANKL）和骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）基因序列，并參考文獻(xiàn)［20］設(shè)計(jì)引物，南京金斯瑞生物科技有限公司合成。設(shè)計(jì)內(nèi)參基因β肌動(dòng)蛋白作為平衡不同cDNA模板之間濃度差異的基準(zhǔn)物。RANKL上游引物：TAGTGTTGGCGATTCTGTTGC，下游引物：ATTGGAAGGTGAGCTGATGG；OPG上游引物：GGCGTCTGAAGAAACCTCTG，下游引物：GCAGGATTGGGATGCAGTAT。Nikon Aphaphot-2 YS2顯微鏡（日本株式會(huì)社尼康公司）；Olympus stylus TG-4相機(jī)（日本Olympus公司）；ZEISS熒光倒置顯微鏡（蔡司光學(xué)儀器國(guó)際貿(mào)易有限公司，型號(hào)AxioVision Rel）；CFX Connect熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)和T100梯度PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；MODULAR型全自動(dòng)生化儀（德國(guó)羅氏公司）；Milli-Q system高純水（美國(guó)Millipore公司）；Agilent 1200型系列高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）。

1.2 EE和WD制備及劑量選擇

取補(bǔ)骨脂藥材適量，加70%乙醇提取或水煎煮2次，分別合并提取液，濃縮至無(wú)醇味。參考文獻(xiàn)［20-24］色譜條件對(duì)EE和WD進(jìn)行色譜分析，分別用純水配制成10 g生藥·L-1貯備液，臨用前用培養(yǎng)基稀釋供斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)。

給藥期間，為使幼魚(yú)盡可能存活至9 dpf，選＜50%死亡率濃度作為最高給藥濃度，設(shè)置3～4個(gè)劑量，觀察EE和WD對(duì)骨骼發(fā)育的影響。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ，選取使斑馬幼魚(yú)0%～100%死亡的藥物濃度范圍，作為毒性作用觀察濃度，一般設(shè)置≥5個(gè)濃度。

1.3 茜素紅染色測(cè)定斑馬魚(yú)頭骨骨礦化面積和骨密度

斑馬魚(yú)胚胎（0 dpf）28.5°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至3 dpf后，放入盛有培養(yǎng)基的24孔板中，每孔6個(gè)胚胎，每組3孔，分為0.4%DMSO溶媒組、PN 25 μmol·L-1模型組、PN+ED 30 mg·L-1陽(yáng)性藥物組、PN+EE或WD 0.1，1，10和100 mg生藥·L-1組。

隔天換液培養(yǎng)至9 dpf置于MS-222中麻醉致死，去除MS-222溶液，置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定24 h，去除固定液，用中性磷酸鹽緩沖液洗滌3次，加入新鮮配制的漂白劑（1.5%H2O2和1%KOH）漂白2 h，再用中性磷酸鹽緩沖液洗滌3次，加入用0.5%KOH配制的茜素紅染色液，24 h后去除染色液，逐步以比例為3∶1，1∶1和1∶3的0.5%KOH和甘油的混合溶液各透明6 h，最后存儲(chǔ)在純甘油中。

光學(xué)顯微鏡觀察茜素紅染色的斑馬魚(yú)頭骨腹面，顯微鏡放大倍數(shù)10×10進(jìn)行圖像采集，所有的圖像均采用相同的光強(qiáng)度和曝光設(shè)置。用專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件Image pro plus 6.0計(jì)算斑馬魚(yú)頭骨茜素紅染色區(qū)域的面積之和及積分吸光密度，分別表示骨礦化面積和骨密度。

1.4 熒光定量PCR（Q-PCR）分析9 dpf斑馬魚(yú)OPG和RANKL mRNA表達(dá)

從9 dpf的DMSO，PN，ED以及WD和EE均為1 mg生藥·L-1組的斑馬幼魚(yú)（n=120）中提取總RNA。測(cè)定其純度和濃度。用M-MLV對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用2×PCR Master Mix檢測(cè)cDNA的質(zhì)量，對(duì)cDNA樣品進(jìn)行熒光定量PCR分析。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 s，1個(gè)循環(huán)；95℃變性5 s；60℃退火和延伸15 s，45個(gè)循環(huán)。以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法計(jì)算待測(cè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 光學(xué)顯微鏡觀察斑馬魚(yú)臟器形態(tài)和死亡率測(cè)定

將收集到的受精卵移入培養(yǎng)基中，28.5℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h待用。將1 dpf的斑馬魚(yú)胚胎放入盛有胚胎培養(yǎng)基的24孔板中，每孔18個(gè)胚胎，每組3孔，分為0.4%DMSO溶媒對(duì)照組、EE 10，20，30，35，40，50和60 mg生藥·L-1組、WD 10，50，100，125，150，175，200和500 mg生藥·L-1組、PS 12.5，25，50，100，200和400 μmol·L-1組以及BK 1，5，10，25和50 μmol·L-1組（DMSO適量助溶，含量＜0.4%），并于給藥后3 dpf在顯微鏡下觀察各組主要臟器形態(tài)，觀察并記錄2～9 dpf斑馬魚(yú)胚胎或幼魚(yú)的死亡數(shù)，在顯微鏡下觀察和拍照。

1.6 全自動(dòng)生化儀速率法測(cè)定6 dpf斑馬魚(yú)組織勻漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）活性

于斑馬幼魚(yú)1 dpf給藥，取各組6 dpf斑馬幼魚(yú)（DMSO組，EE 35，40和50 mg生藥·L-1組，WD 50，100和150 mg生藥·L-1組，PS 12.5，25.0和50.0 μmol·L-1組以及BK 5和10 μmol·L-1組），加生理鹽水（2×104魚(yú)·L-1）制備斑馬魚(yú)組織勻漿，冰浴勻漿取上清，羅氏800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定GPT和GOT活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果 數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS16.0軟件回歸方法計(jì)算半數(shù)致死濃度（LC50），采用EXCEL軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EE和WD主要成分

由圖1可知，WD主含色譜峰1～4，分別為補(bǔ)骨脂苷（psoralenoside）、異補(bǔ)骨脂苷（isopsoralenoside）、PS和異補(bǔ)骨脂素（isopsoralen），4個(gè)成分峰面積之和約占WD總成分峰面積之和的90.5%，卻僅占EE總成分峰面積之和的19.5%；色譜峰5為BK，是EE的主要成分，色譜峰面積約占EE總成分峰面積和之的43%，而WD不含BK。

Fig.1 HPLC profile of ethanol extract（EE）（A）and water decoction（WD）（B）ofPsoralea corylifoliaL..Peaks 1-5 represent psoralenoside，isopsoralenoside，psoralen（PS），isopsoralen and bakuchiol（BK），respectively.

2.2 EE和WD對(duì)斑馬魚(yú)頭骨礦化面積和骨密度的影響

Fig.2 Effect of EE and WD on skeletal development of zebrafish larvae at 9 days post fertilization（9 dpf）by ventral view of alizarin red whole-mount preparations.Zebrafish larvae（3 dpf）were placed into 24-well plate（6 larvae per well，3 wells per group）including 0.4%DMSO vehicle control group，prednisolone（PN）25 μmol·L-1model group，PN 25 μmol·L-1+ etidronate disodium（ED）30 mg·L-1（positive group），and PN 25 μmol·L-1+EE or WD 0.1，1，10 and 100 mg crude drug·L-1groups. At 9 dpf，larvae were fixed and processed for whole-mount skeletal staining.

9 dpf斑馬魚(yú)幼魚(yú)頭骨染色的顯微成像（圖2）和圖像分析軟件分析結(jié)果 （表1）顯示，與DMSO組相比，PN模型組的斑馬魚(yú)頭骨礦化面積和骨密度明顯降低（P＜0.01），表明PN 25 μmol·L-1導(dǎo)致斑馬魚(yú)骨量減少。與模型組比較，ED 30 mg·L-1組中頭骨礦化面積和骨密度顯著升高（P＜0.01）。EE 0.1 mg生藥·L-1組斑馬魚(yú)頭骨礦化面積和骨密度與較模型組比較顯著增加（P＜0.01），但當(dāng)濃度增加時(shí)，礦化面積和骨密度卻呈降低趨勢(shì)。EE 100.0 mg生藥·L-1組斑馬魚(yú)全部死亡，提示毒性較大。與模型組相比，WD 1 mg生藥·L-1組，斑馬魚(yú)頭骨礦化面積和骨密度顯著增加（P＜0.01），其顯效濃度為EE的10倍；WD 100 mg生藥·L-1組斑馬魚(yú)正常存活，說(shuō)明WD毒性低于EE。

2.3 EE和WD對(duì)9 dpf斑馬魚(yú)OPG和RANKL mRNA表達(dá)的影響

熒光定量PCR結(jié)果 顯示（表2），與DMSO對(duì)照組相比，模型組RANKL mRNA表達(dá)升高（P＜0.01），OPG/RANKL比值降低（P＜0.05）。與模型組相比，WD和EE（1 mg生藥·L-1）均顯著升高OPG mRNA表達(dá)水平（P＜0.05，P＜0.01）；WD，EE和ED均可顯著降低RANKL mRNA表達(dá)水平（P＜0.01），OPG/ RANKL比值顯著增加（P＜0.01）。

2.4 EE，WD，PS和BK對(duì)斑馬魚(yú)發(fā)育的影響

2～3 dpf的斑馬魚(yú)胚胎心血管能夠發(fā)育完全，孵化成斑馬魚(yú)幼魚(yú)，顯微形態(tài)如圖3所示。WD和EE均致斑馬魚(yú)臟器中毒，WD致魚(yú)中毒的最低濃度（175 mg生藥·L-1）是EE（40 mg生藥·L-1）的4.38倍。在3 dpf時(shí)，WD 150 mg生藥·L-1組斑馬魚(yú)胚胎未出現(xiàn)異常癥狀，與培養(yǎng)基對(duì)照組無(wú)差異；≥175 mg生藥·L-1可以觀察到斑馬魚(yú)心臟區(qū)域心包囊腫大，心膜區(qū)有出血現(xiàn)象，血細(xì)胞在心臟區(qū)堆積，卵黃囊明顯腫大；斑馬魚(yú)對(duì)刺激不敏感，靜臥于孔板底部等。在3 dpf時(shí)，EE 40和50 mg生藥·L-1組未表現(xiàn)出中毒現(xiàn)象，但60 mg生藥·L-1致魚(yú)卵黃囊腫大，色斑減少，尚有部分魚(yú)胚胎未孵出；在4 dpf時(shí)，EE 40和50 mg生藥·L-1致魚(yú)心包和卵黃囊腫大，且50 mg生藥·L-1組魚(yú)卵黃囊變黑，60 mg生藥·L-1組除未孵出幼魚(yú)外全部死亡；在5 dpf時(shí)，EE 40和50 mg生藥·L-1致幼魚(yú)全身水腫，形體模糊，60 mg生藥·L-1組幼魚(yú)全部死亡。PS致魚(yú)臟器中毒的最低濃度（50 μmol·L-1）是BK（10 μmol·L-1）的5倍。3 dpf時(shí)，PS 50 μmol·L-1組斑馬魚(yú)胚胎表現(xiàn)出卵黃囊腫大，心包水腫；而B(niǎo)K 10 μmol·L-1組魚(yú)卵黃囊腫大，BK 25 μmol·L-1組魚(yú)卵黃囊腫大加重，伴脊柱彎曲。

Tab.1 Effects of EE and WD on bone mineralized area and bone density of 9dpf zebrafish skeleton

Tab.2 Effect of EE and WD on mRNA expression of osteoprotegrin（OPG）and receptor activator of NF-κ B ligand（RANKL）in zebrafish（9 dpf）by Q-PCR

Fig.3 Effect of EE，WD，psoralen（PS）and bakuchiol（BK）on morphology of zebrafish 3 dpf（A），4 dpf（B）and 5 dpf（C）.Arrows show yalk sac and heart of zebrafish.Zebrafish exposed to EE 60 mg·L-1had not hatched at 4 dpf.

2.5 EE，WD，PS和BK對(duì)斑馬魚(yú)的致死性

4,6和9 dpf時(shí)，WD對(duì)斑馬魚(yú)的LC50值分別為353.32，192.15和189.56 mg生藥·L-1；EE的LC50值分別為53.44，49.18和49.18 mg生藥·L-1，WD的LC50為EE的4～7倍，提示EE對(duì)斑馬魚(yú)的毒性遠(yuǎn)大于WD。補(bǔ)骨脂中水溶性較強(qiáng)的代表成分PS的LC50值分別為251.87，59.85和54.85 μmol·L-1，約為強(qiáng)脂溶性成分BK（LC50均為12.78 μmol·L-1）的4.3～20倍，提示BK對(duì)斑馬魚(yú)的毒性遠(yuǎn)大于PS（圖4）。

2.6 EE，WD，PS和BK對(duì)6 dpf斑馬魚(yú)GOT和GPT活性的影響

表3結(jié)果 顯示，6 dpf時(shí)，與DMSO組相比，EE，WD，PS和BK各濃度組斑馬幼魚(yú)中的GOT活性顯著降低（P＜0.01）。與DMSO組比，各給藥組GPT值活性降低，但由于GPT值偏低，未測(cè)到精確數(shù)值，未進(jìn)行差異分析。

Fig.4 Effect of EE（A），WD（B），PS（C）and BK（D）on mortality of zebrafish 4，6 and 9 dpf.See Fig.3 for the treatment.x±s，n=18.

Tab.3 Effect of EE，WD，PS and BK on activities of GOT and GPT in 6 dpf zebrafish

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，WD和EE均能顯著阻止PN誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)骨量減少，但WD起效劑量為EE的10倍。

斑馬魚(yú)與哺乳動(dòng)物骨骼生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制極為相似，含有調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收的密切相關(guān)基因OPG和RANKL［20］。RANKL是誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子。OPG作為一種誘騙受體，可以競(jìng)爭(zhēng)性地與RANKL結(jié)合，從而封閉RANKL與破骨細(xì)胞表面的核激活因子受體（receptor activator of NF-κB，RANK）結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的分化成熟［26］。本研究熒光定量PCR測(cè)定9dpf斑馬魚(yú)OPG和RANKL mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，WD和EE均可顯著下調(diào)RANKL、上調(diào)OPG mRNA表達(dá)水平，并顯著增加OPG/RANKL比值，提示補(bǔ)骨脂影響骨骼發(fā)育在于抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成。

此外，本研究采用近年來(lái)被國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注并認(rèn)可的斑馬魚(yú)毒性模型［27］，在顯微鏡下檢視3 dpf斑馬魚(yú)臟器形態(tài)，此時(shí)斑馬魚(yú)心臟等臟器基本發(fā)育完全，剛孵出不活躍，魚(yú)體透明，易于檢視。4 dpf后斑馬魚(yú)活躍，5 dpf肝發(fā)育完全，卵黃囊不斷被吸收，不易側(cè)臥捕獲臟器形態(tài)。斑馬魚(yú)頭部骨骼主要在3～9 dpf形成。斑馬魚(yú)卵黃囊成分的70%為中性脂質(zhì)，主要在肝中代謝，因此卵黃囊大小可作為反映肝功能的指標(biāo)之一［28］。斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)組織勻漿液中的GPT和GOT活性，從整體動(dòng)物的角度來(lái)講，肝損傷后肝細(xì)胞合成GPT和GOT的能力降低［29］。本研究發(fā)現(xiàn)，WD和EE以及PS和BK均可使斑馬魚(yú)卵黃囊腫大、變形或變黑，使斑馬魚(yú)肝組織GPT和GOT活性降低，提示與肝毒性相關(guān)，但致毒濃度存在差異。WD的安全性比EE較好，其致魚(yú)中毒劑量約為EE的4～7倍。高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，EE和WD成分差異較大，WD中主要含有補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、PS和異補(bǔ)骨脂素，占WD總成分峰面積的90%，僅約占EE總成分峰面積的20%；而B(niǎo)K是EE主要特征性成分，占EE總成分峰面積的43%，但WD不含BK。綜合毒性成分分析，可見(jiàn)補(bǔ)骨脂中促進(jìn)骨骼發(fā)育活性更高，毒性更強(qiáng)的關(guān)鍵成分可能是以BK為代表的脂溶性成分。BK的肝毒性最近有文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)［30］，而一直廣為關(guān)注的水溶性成分PS和異補(bǔ)骨脂素毒性則相對(duì)較弱［31，13］。本研究進(jìn)一步用斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了BK的毒性強(qiáng)于PS。該研究提示，僅用補(bǔ)骨脂及炮制品的傳統(tǒng)WD進(jìn)行毒性研究會(huì)錯(cuò)失致毒關(guān)鍵成分的發(fā)現(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

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（本文編輯：沈海南，喬虹）

《中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志》中圖的要求

論文中的各種圖包括病理照片圖、曲線圖、柱圖、電泳圖及化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖等，請(qǐng)將圖直接插入word文檔中不要插入圖片，若不明白插入圖后雙擊可直接進(jìn)入此圖的做圖軟件中看到此圖即可。應(yīng)按以下要求處理。

1.病理照片圖應(yīng)采用加標(biāo)尺的方式表示，并在圖中配上箭頭指示病變區(qū)域（圖1,圖4）。除照片圖外，其他圖均用灰度圖表示。曲線圖圖例依次為○●△▲□■等,圖例字號(hào)為6磅字體為Arial。圖中統(tǒng)計(jì)學(xué)分析符號(hào)標(biāo)注依次為＊#△等。

2.雙欄圖大小為：寬與高的比為3∶2，寬≤7.5cm，橫、縱坐標(biāo)的字號(hào)為8或9磅字體為Arial；條帶圖上標(biāo)注為：M，1，2，3，4，5等。

3.通欄圖大小為：寬≤15cm。字號(hào)為9或8榜。橫、縱坐標(biāo)的字號(hào)為8或9磅字體為Arial。

4.其他有關(guān)圖表自明的要求見(jiàn)本刊網(wǎng)站http://www.cjpt.ac.cn下載中心的投稿須知中的第19條和論文模版中的舉例。

Effect of extract ethanol and water decoction of Psoralea corylifolia L. on bone development and their toxicities in zebrafish

CHEN Ying1,2,WANG Mo3,SONG Jie1,2,ZHAN Yang2,JING Li-jun1,2,CHEN Shu-qin2, JIA Xiao-bin1,2,WEI Ying-jie1,2
(1.The Third Clinical School of Medicine of Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210028, China;2.Key Laboratory of New Drug Delivery System of Chinese Materia Medica,Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine,Nanjing 210028,China;3.Hospital of the Chinese People′s Liberation Army 93038,Tonghua 135300,China)

OBJECTlVETo investigate the bone development activity and differences in safety of ethanol extract(EE)and water decoction(WD)of Psoralea corylifolia L.efficiently.METHODSZebrafish larvae were co-exposed to prednisolone 25 μmol·L-1and different concentrations of EE and WD(0.1, 1.0,10 and 100 mg crude drug·L-1),and etidronate disodium(ED)30 mg·L-1.All these groups were incubated at 28.5℃until 9 dpf.The medium solution was changed every other day.Zebrafish skeleton at 9 dpf was stained with alizarin red and inspected under an optical microscope,in addition,the death toll and organ toxicity of zebrafish were also observed.The mRNA expression of osteoprotegrin(OPG) and receptor activator of NF-κB ligand(RANKL)in 9 dpf zebrafish were determined with fluorescence quantitative PCR.Zebrafish embryos(1 dpf)were exposed to various concentrations of EE(10,20,30, 35,40,50 and 60 mg crude drug·L-1),WD(10,50,100,125,150,175,200 and 500 mg crude drug·L-1), psoralen(12.5,25.0,50.0,100.0,200.0 and 400.0 μmol·L-1)and bakuchiol(1,5,10,25 and 50 μmol·L-1).Embryonic morphology of zebrafish(3 dpf)was inspected with an optical microscope and the death toll of embryos or larvale was counted from 2 dpf to 9 dpf and LC50was calculated.Components of EE and WD ware analyzed by HPLC method.RESULTSBoth EE(0.1 mg crude drug·L-1)and WD (1.0 mg crude drug·L-1)groups could increase the staining area and optical density values of zebrafishskeleton compared with prednisolone group(P＜0.01),indicating the increase in bone mineralization;the OPG mRNA expression in both EE and WD(1.0 mg crude drug·L-1)groups increased,while the RANKL mRNA expression decreased(P＜0.01)and the ratio of OPG/RANKL improved obviously(P＜0.01). Embryos exposed to EE,WD,psoralen and bakuchiol showed swelling of the heart and yalk sac,and decrease in GOT.The LC50of WD and psoralen was 5～8 and 5～21 times that EE and bakuchiol, respectively.The composition and relative content of EE and WD also varied considerably.CONCLUSlONBone development activity and toxicity of EE are both stronger than those of WD.The lipid soluble characteristic components of Psoralea corylifolia L.,may be critical components of toxicity.

zebrafish;Psoralea corylifolia L.;bone development

The project supported by National Science and Technology Major Project of China(2017ZX09301-056); Traditional Chinese Medicine Scientific Research(201507004-10);National Natural Science Foundation of China(81573833); Natural Science Foundation of Jiangsu Province(BK20141507);Natural Science Foundation of Jiangsu Province(BK2011866); Foundation for High-level Talent in Six Areas of Jiangsu Province(2013-YY006);and"333 Project"of Jiangsu Province (BRA2014348)

WEI Ying-jie,E-mail:wyj970@163.com

R285.1

A

1000-3002-（2017）06-0661-09

2016-07-06接受日期：2017-04-19）

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2017ZX09301-056）；中醫(yī)藥行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)（201507004-10）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81573833）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20141507）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2011866）；江蘇省六大人才高峰基金（2013-YY006）；江蘇省第四期“333工程”科研項(xiàng)目（BRA2014348）

陳穎，女，碩士研究生，主要從事中藥物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制研究，E-mail：m18751845710@163.com，Tel：（025）85637809

韋英杰，E-mail：wyj970@163.com