納米氧化鋅對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Ana-1的毒性作用及機(jī)制

褚天雪，邢立國，袁娟，戴維，王媛，龍新宇，劉亭，左代英，吳英良

（1.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧沈陽110016；2.沈陽化工研究院安全評(píng)價(jià)中心，遼寧沈陽110021）

納米氧化鋅對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Ana-1的毒性作用及機(jī)制

褚天雪1，邢立國2，袁娟1，戴維1，王媛1，龍新宇1，劉亭1，左代英1，吳英良1

（1.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧沈陽110016；2.沈陽化工研究院安全評(píng)價(jià)中心，遼寧沈陽110021）

目的 研究納米氧化鋅（ZnO-NP）對(duì)小鼠腹腔源巨噬細(xì)胞（Ana-1）的毒性作用及機(jī)制。方法ZnO-NP 2.5～160 mg·L-1與Ana-1細(xì)胞作用24 h后，MTT法檢測Ana-1細(xì)胞的存活率；吖啶橙-溴化乙錠（AO-EB）染色及流式細(xì)胞術(shù)觀察Ana-1細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞對(duì)ZnO-NP的攝?。讳\離子熒光探針測定細(xì)胞內(nèi)的鋅離子；乙二胺四乙酸（EDTA）螯合鋅離子，檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果 ZnO-NP在2.5，5，10和20 mg·L-1濃度范圍內(nèi)能夠濃度依賴性地抑制Ana-1細(xì)胞存活（r=0.905，P＜0.05）；ZnO-NP 20 mg·L-1組細(xì)胞存活率為細(xì)胞對(duì)照組的27.9%，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡樣改變；ZnO-NP 40，80和160 mg·L-1組細(xì)胞攝取的ZnO-NP比細(xì)胞對(duì)照組顯著增加（P＜0.05）；EDTA 2.5 mmol·L-1能夠明顯降低細(xì)胞內(nèi)的自由鋅離子，改善ZnO-NP 10 mg·L-1引起的細(xì)胞存活率下降（P＜0.05）。螯合鋅離子后，ZnO-NP對(duì)Ana-1細(xì)胞的毒性明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論ZnO-NP可濃度依賴性增加Ana-1細(xì)胞的毒性，引起凋亡樣改變，其毒性可能與其進(jìn)入細(xì)胞并釋放鋅離子有關(guān)。

納米；氧化鋅；Ana-1細(xì)胞；細(xì)胞毒性

隨著納米科技的迅速發(fā)展，納米材料被越來越廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。納米氧化鋅（zinc oxide nanoparticles，ZnO-NP）是一種應(yīng)用前景廣泛的多功能無機(jī)納米材料，其具有粒徑微小、比表面積大和化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于化妝品、電子產(chǎn)品、藥物載體、治療和診斷等各個(gè)領(lǐng)域［1-3］，ZnO-NP對(duì)人類健康的潛在影響也日益引起人們關(guān)注。ZnO-NP具有一般普通微米級(jí)ZnO所無法比擬的性能和用途。然而，隨著ZnO-NP的廣泛應(yīng)用，其安全性也越來越受到研究人員的廣泛重視。ZnO-NP一旦進(jìn)入生物體，與細(xì)胞膜作用形成微孔，或直接進(jìn)入某些細(xì)胞器甚至細(xì)胞核內(nèi)，產(chǎn)生一定的生物毒性［4］。

巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的一部分，以不同形式廣泛分布于人體不同部位，在體液免疫和細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要作用。受外界刺激后，巨噬細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一系列反應(yīng)，吞噬外來物質(zhì)，同時(shí)巨噬細(xì)胞本身也與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)有關(guān)，并分泌一系列活性物質(zhì)［5］。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Ana-1細(xì)胞，被廣泛用于免疫毒性相關(guān)的研究中［6-8］。有研究表明，ZnO-NP有較強(qiáng)的體內(nèi)毒性和體外細(xì)胞毒性；ZnO-NP可引起小鼠明顯的肝、肺、腎和腦等器官的氧化應(yīng)激及病理損傷［9-14］；ZnO-NP也能夠引起人肺上皮細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞、大鼠腎上皮細(xì)胞和人單核細(xì)胞等的明顯細(xì)胞毒性改變［15-18］。大量研究都表示，ZnO-NP對(duì)細(xì)胞生長有極強(qiáng)的抑制作用，且明顯高于其他類金屬氧化物的納米顆粒［19-24］；在不同濃度ZnO-NP對(duì)人體主動(dòng)脈細(xì)胞內(nèi)皮的毒性效應(yīng)的研究中，納米顆粒出現(xiàn)內(nèi)在化進(jìn)入細(xì)胞的現(xiàn)象，ZnO-NP 50 mg·L-1有細(xì)胞毒性，可導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡，但關(guān)于細(xì)胞死亡的機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步研究［25］。

ZnO-NP可通過呼吸道、消化道和皮膚等多種途徑進(jìn)入人體，并能通過體循環(huán)分布到各組織中。進(jìn)入機(jī)體的ZnO-NP作為外來異物可能會(huì)引起機(jī)體特異性免疫反應(yīng)。然而，尚無關(guān)于ZnO-NP對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Ana-1的毒性及相關(guān)機(jī)制研究報(bào)道。因此，為探討ZnO-NP對(duì)正常免疫細(xì)胞的潛在影響，研究ZnO-NP對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Ana-1細(xì)胞的毒性及其機(jī)制，旨在為ZnO-NP的安全性評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

Ana-1細(xì)胞購自中國中科院上海生物細(xì)胞所，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次，培養(yǎng)至細(xì)胞融合70%～80%以上，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)：1663936），購自美國Gibco公司；胎牛血清（批號(hào)：09087213-2272），購自中國天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；96孔板（批號(hào)：701001）購自中國NEST公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，批號(hào)：705B054），購自美國Sigma公司；吖啶橙-溴化乙錠（acridine orange-ethidium bromide，AO-EB，批號(hào)：20151023）染料和碘化丙啶（propidium iodide，PI，批號(hào)：C0080），均購自中國索萊寶公司；ZnO-NP（50 nm），購自中國皓田納米科技有限公司；Zinquin ethyl ester探針（批號(hào)：JM829），購自日本同仁化學(xué)研究所。

1.2 ZnO-NP懸液的制備

ZnO-NP在使用前經(jīng)183℃干熱滅菌3 h。滅菌后的ZnO-NP用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基（pH 7.3）配成懸液。加ZnO-NP懸液前，用超聲波儀超聲30 min，以防ZnO-NP產(chǎn)生凝聚現(xiàn)象。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞存活率

將計(jì)數(shù)后的細(xì)胞懸液（4×108L-1）加入96孔板，每孔3.2×104個(gè)細(xì)胞，分為ZnO-NP 2.5，5，10，20，40，80和160 mg·L-1組和不加ZnO-NP的正常細(xì)胞對(duì)照組，各組設(shè)3復(fù)孔，待細(xì)胞與ZnO-NP共孵育24 h后，取出96孔板，每孔加入20 μL MTT（5 g·L-1），4 h后每孔加入100 μL三聯(lián)液（5 mL異丁醇，10 g SDS，0.1 mL HCl 10 mol·L-1），過夜后，用多功能酶標(biāo)儀測量570和630 nm處的吸光度值（A）。采用雙波長法計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（處理組A570nm-處理組A630nm）/（對(duì)照組A570nm-對(duì)照組A630nm）×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測Ana-1細(xì)胞對(duì)ZnO-NP的攝取

納米顆粒被細(xì)胞攝取后，細(xì)胞會(huì)由于吞噬行為內(nèi)部結(jié)構(gòu)變復(fù)雜，細(xì)胞所攝取的納米顆粒與細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度正相關(guān)，流式細(xì)胞儀檢測側(cè)向散射（SSC）與細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)呈近直線關(guān)系。細(xì)胞內(nèi)顆粒越復(fù)雜，其SSC越大，細(xì)胞攝取的顆粒越多。取對(duì)數(shù)生長期Ana-1細(xì)胞，吹打、重懸、計(jì)數(shù)后，以1×109L-1的密度接種于6孔板，分為ZnO-NP 10，20，40，80或160 mg·L-1組和不加ZnO-NP的細(xì)胞對(duì)照組，4 h后收集細(xì)胞。472×g離心5 min，重懸，上樣，計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞，數(shù)據(jù)采用Cell Quest軟件（Becton Dickison）進(jìn)行分析處理。

1.5 AO-EB染色法檢測細(xì)胞膜完整性

取對(duì)數(shù)生長期Ana-1細(xì)胞，吹打、重懸、計(jì)數(shù)后，以1×109L-1的密度接種于24孔板中，根據(jù)MTT結(jié)果 ，使用ZnO-NP 40 mg·L-1與Ana-1細(xì)胞共孵育24 h，收集細(xì)胞。每孔加入200 μL AO-EB應(yīng)用液（5 mg·L-1），避光孵育5 min，118×g離心5 min，棄上清，加入PBS重懸，吸取50 μL滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察。AO能透過完整細(xì)胞膜并嵌入細(xì)胞核DNA，使之發(fā)出亮綠色熒光，而EB僅能透過細(xì)胞膜受損的細(xì)胞，嵌入DNA后發(fā)出橘黃色熒光。

1.6 PI染色法檢測細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長期Ana-1細(xì)胞，吹打、重懸和計(jì)數(shù)后，以1×106L-1的密度接種于6孔板中，分為ZnO-NP 10，20，40和80 mg·L-1組和不加ZnO-NP的細(xì)胞對(duì)照組，作用48 h后收集細(xì)胞。472×g離心10 min，棄上清，加入500 μL的PBS，混勻。再加入10 mL 70%冰乙醇，-20℃保存，實(shí)驗(yàn)前1天置于4℃預(yù)冷。472×g離心10 min，棄上清。PBS重懸，洗滌3次，上樣，計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，數(shù)據(jù)采用Cell Quest軟件（Becton Dickison）進(jìn)行分析處理。PI是一種DNA熒光染料，結(jié)合DNA后發(fā)出熒光，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行測量，可得出細(xì)胞內(nèi)DNA含量分布情況，亞G1期是細(xì)胞凋亡的特征之一，由此分析細(xì)胞凋亡。

1.7 熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)自由鋅離子

按1.5處理細(xì)胞，作用4 h后收集細(xì)胞。472×g離心5 min，加入鋅離子熒光探針懸液，終濃度為2.4 μmol·L-1，避光、共孵育30 min，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基洗3次，然后加入50 μL封片劑，混勻，滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，操作過程避免振動(dòng)。于共聚焦顯微鏡下觀察。zinquin ethyl ester具有膜通透性，自身也有熒光，但它自身的熒光強(qiáng)度幾乎可忽略不計(jì)，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，結(jié)合鋅離子后在紫外激發(fā)下發(fā)藍(lán)色熒光。

1.8 EDTA螯合鋅離子MTT法檢測細(xì)胞存活

使用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tet-raacetic acid，EDTA）2.5，5，10和20 mmol·L-1分別與ZnO-NP 0，10，20，40和80 mg·L-1共孵育Ana-1細(xì)胞24 h，MTT法檢測細(xì)胞存活，采用雙波長法計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果 數(shù)據(jù)均用x±s表示，使用SPSS 13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊時(shí)用LSD法，方差不齊時(shí)用Dunnettt法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZnO-NP對(duì)細(xì)胞存活率的影響

Ana-1細(xì)胞與ZnO-NP 2.5，5，10和20 mg·L-1共同孵育24 h后，細(xì)胞的存活率隨ZnO-NP濃度的增加呈濃度依賴性地降低（r=0.905，P＜0.05）（圖1）。ZnO-NP 20 mg·L-1組細(xì)胞存活率下降至細(xì)胞對(duì)照組的27.9%，ZnO-NP濃度≥40 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞存活率＜14.5%。

Tig.1 Effect of zinc oxide nanoparticles（ZnO-NPs）on viability of Ana-1 cells by MTT assay.Ana-1 cells were incubated with ZnO-NPs 2.5，5，10，20，40，80 and 160 mg·L-1for 24 h.x±s，n=3.＊P＜0.05 compared with cell control（0）group.

2.2 ZnO-NP對(duì)Ana-1細(xì)胞攝取能力的影響

Ana-1細(xì)胞攝取ZnO-NP結(jié)果 如圖2所示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，ZnO-NP 40，80和160 mg·L-1組攝取ZnO-NP的細(xì)胞百分率顯著增多（P＜0.05）。ZnO-NP 10和20 mg·L-1組攝取ZnO-NP細(xì)胞的百分率與細(xì)胞對(duì)照組無顯著差異。

2.3 ZnO-NP對(duì)Ana-1細(xì)胞膜完整性的影響

AO染色結(jié)果 （圖3）顯示，細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞核呈現(xiàn)為均勻的綠色，位于細(xì)胞中央，EB基本未見著色；而ZnO-NP 40 mg·L-1組可見細(xì)胞核發(fā)出明亮的綠色熒光，部分細(xì)胞被EB染色，表現(xiàn)為橘紅色熒光增強(qiáng)，提示細(xì)胞膜完整性被破壞，凋亡及壞死細(xì)胞逐漸增多。

Fig.2 Effect of ZnO-NP on uptake of Ana-1 cells.Ana-1 cells were incubated with ZnO-NPs 10，20，40，80 and 160 mg·L-1for 4 h.x±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control（0）group.

Fig.3 Effect of ZnO-NPs on integrity of cell membrane of Ana-1 cell by AO-EB staining.Ana-1 cells were incubated with ZnO-NPs 40 mg·L-1for 24 h.Arrows show cells stained by ethidium bromide（EB）.

2.4 ZnO-NP對(duì)Ana-1細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 （圖4）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，ZnO-NP 20，40和80 mg·L-1組亞G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多（r=0.776，P＜0.05），提示ZnO-NP能夠誘導(dǎo)Ana-1細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng)。

Fig.4 Effect of ZnO-NPs on Ana-1 cell number at sub-G1by flow cytometry.Ana-1 cells were incubated with ZnO-NPs for 48 h.x±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control（0）group.

2.5 ZnO-NP對(duì)細(xì)胞內(nèi)鋅離子的影響

細(xì)胞內(nèi)自由鋅離子檢測結(jié)果 （圖5）顯示，細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)未檢測到自由鋅離子；加入ZnO-NP 40 mg·L-14 h后細(xì)胞內(nèi)檢測到自由鋅離子；提示ZnO-NP可被Ana-1細(xì)胞攝取，并在細(xì)胞內(nèi)釋放出自由鋅離子。

Fig.5 Effect of ZnO-NPs on intracellular free zinc ion of Ana-1 cells by zinquin ethyl ester.Ana-1 cells were incubated with ZnO-NPs 40 mg·L-1for 4 h.

2.6 EDTA螯合鋅離子后ZnO-NP對(duì)細(xì)胞存活率的影響

EDTA 2.5和5 mmol·L-1能夠明顯改善ZnO-NP 10 mg·L-1所引起的細(xì)胞存活率下降（P＜0.05）。EDTA 10 mmol·L-1能夠明顯改善ZnO-NP 20 mg·L-1所引起的細(xì)胞存活率下降（P＜0.05），而EDTA 20 mmol·L-1能夠明顯改善ZnO-NP 10，20和40 mg·L-1所引起的細(xì)胞存活率下降（P＜0.05）（圖6）。提示ZnO-NP在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的鋅離子是ZnO-NP對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的主要途徑之一。

Fig.6 Effect of ZnO-NPs on viability of Ana-1 cells after chelating zinc ions with EDTA by MTT assay.Ana-1 cells were incubated with ZnO-NPs and EDTA for 24 h.x±s，n=3.＊P＜0.05，compared with ZnO-NPs only group.

3 討論

本研究結(jié)果 表明，ZnO-NP隨著濃度增加，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性也逐漸加大，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率降低，這與文獻(xiàn)中報(bào)道的ZnO-NP對(duì)細(xì)胞具有極強(qiáng)的抑制作用一致［19-24］。AO-EB染色和PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果 顯示，ZnO-NP作用Ana-1細(xì)胞后，均出現(xiàn)明顯的凋亡樣改變。流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞攝取ZnO-NP顆粒的結(jié)果 表明，細(xì)胞內(nèi)ZnO-NP顆粒濃度依賴性增多，這與MTT法測定不同濃度ZnO-NP對(duì)細(xì)胞存活率影響的趨勢一致；隨著細(xì)胞內(nèi)ZnO-NP顆粒的增加，產(chǎn)生的毒性也顯著升高。文獻(xiàn)報(bào)道，納米顆粒在體外和體內(nèi)條件下都易被攝入細(xì)胞膜，從而影響細(xì)胞功能［26］，這與本研究的流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞攝取ZnO-NP顆粒的結(jié)果 一致。同時(shí)，檢測細(xì)胞內(nèi)自由鋅離子時(shí)，只有加入ZnO-NP組可檢測到鋅離子，未加ZnO-NP的對(duì)照組則無法檢測到鋅離子的存在，提示ZnO-NP顆粒會(huì)在介質(zhì)中解離出鋅離子，并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)采用EDTA螯合介質(zhì)中的鋅離子時(shí)，ZnO-NP產(chǎn)生的毒性明顯降低，提示ZnO-NP可能通過介質(zhì)中解離出的自由鋅離子產(chǎn)生細(xì)胞毒性。已有研究表明，解離的鋅離子是納米氧化鋅顆粒產(chǎn)生毒性作用的原因，這個(gè)觀點(diǎn)在本研究的結(jié)果 中得到印證［27］。

AO-EB染色與PI單染流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果 共同表明，ZnO-NP可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在ZnO-NP暴露24 h后，AO-EB染色結(jié)果 出現(xiàn)凋亡樣改變，但僅有少量細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。在PI單染流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果 中，ZnO-NP暴露48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)顯著的凋亡現(xiàn)象。這可能是由于ZnO-NP通過多種方式誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，如接觸初期主要通過其他途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，ZnO-NP長時(shí)間暴露才會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ZnO-NP是通過何種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，尚有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，ZnO-NP在低濃度時(shí)產(chǎn)生的毒性較小，當(dāng)濃度40 mg·L-1時(shí)產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，所以在ZnO-NP的應(yīng)用過程中，應(yīng)注意ZnO-NP使用劑量的安全范圍。ZnO-NP確實(shí)對(duì)免疫細(xì)胞產(chǎn)生毒性，且隨著暴露濃度增大而加大。同時(shí)，ZnO-NP產(chǎn)生毒性的機(jī)制可能與細(xì)胞攝取納米顆粒的量和ZnO-NP解離出自由鋅離子的量有關(guān)。

［1］Xiong HM.ZnO nanoparticles applied to bioimaging and drug delivery［J］.Adv Mater，2013，25（37）：5329-5335.

［2］Wiesenthal A，Hunter L，Wang S，Wickliffe J，Wilkerson M.Nanoparticles：small and mighty［J］.nt J Dermatol，2011，50（3）：247-254.

［3］Gao GY，Chen ML，Li MY，Yang ZB，Li ZP，Mei XG.Current status and prospect of translational medicine in nanotechnology［J］.Acta Pharm Sin（藥學(xué)學(xué)報(bào)），2015，50（8）：919-924.

［4］Kim YR，Park SH，Lee JK，Jeong J，Kim JH，Meang EH，et al.Organization of research team for nano-associated safety assessment in effort to study nanotoxicology of zinc oxide and silica nanoparticles［J］.Int J Nanomed，2014，9（Suppl 2）：3-10.

［5］Kim S，Oh WK，Jeong YS，Hong JY，Cho BR，Hahn JS，et al.Cytotoxicity of，and innate immune response to，size-controlled polypyrrole nanoparticles in mammalian cells［J］.Biomaterials，2011，32（9）：2342-2350.

［6］Liu D，Yang PS.Minocycline hydrochloride nanoliposomes inhibit the production of TNF-α in LPS-stimulated macrophages［J］.Int J Nanomed，2012，7：4769-4775.

［7］Wei J，Guo H，Kuo PC.Endotoxin-stimulated nitric oxide production inhibits expression of cytochrome c oxidase in ANA-1 murine macrophages［J］.J Immunol，2002，168（9）：4721-4727.

［8］Qin Q，Niu J，Wang Z，Xu W，Qiao Z，Gu Y. Astragalus membranaceus inhibits inflammation via phospho-P38 mitogen-activated protein kinase（MAPK）and nuclear factor（NF）-κB pathways in advanced glycation end product-stimulated macrophages［J］.Int J Mol Sci，2012，13（7）：8379-8387.

［9］Yang X，Shao H，Liu W，Gu W，Shu X，Mo Y，et al.Endoplasmic reticulum stress and oxidative stress are involved in ZnO nanoparticle-induced hepatotoxicity［J］.Toxicol Lett，2015，234（1）：40-49.

［10］Adamcakova-Dodd A，Stebounova LV，Kim JS，Vorrink SU，Ault AP，O′Shaughnessy PT，et al. Toxicity assessment of zinc oxide nanoparticles using sub-acute and sub-chronic murine inhalation models［J］.Part Fibre Toxicol，2014，11：15.

［11］Shrivastava R，Raza S，Yadav A，Kushwaha P，F(xiàn)lora SJ.Effects of sub-acute exposure to TiO2，ZnO and Al2O3nanoparticles on oxidative stress and histological changes in mouse liver and brain［J］.Drug Chem Toxicol，2014，37（3）：336-347.

［12］Esmaeillou M，Moharamnejad M，Hsankhani R，Tehrani AA，Maadi H.Toxicity of ZnO nanoparticles in healthy adult mice［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2013，35（1）：67-71.

［13］Sharma V，Singh P，Pandey AK，Dhawan A. Induction of oxidative stress，DNA damage and apoptosis in mouse liver after sub-acute oral exposure to zinc oxide nanoparticles［J］.Mutat Res，2012，745（1-2）：84-91.

［14］Li CH，Shen CC，Cheng YW，Huang SH，Wu CC，Kao CC，et al.Organ biodistribution，clearance，and genotoxicity of orally administered zinc oxide nanoparticles in mice［J］.Nanotoxicology，2012，6（7）：746-756.

［15］Uzar NK，Abudayyak M，Akcay N，Algun G，?zhan G.Zinc oxide nanoparticles induced cytoand genotoxicity in kidney epithelial cells［J］.Toxicol Mech Methods，2015，25（4）：334-339.

［16］Javidi M，Zarei M，Omidi S，Ghorbani A，Gharechahi M，Rad MS.Cytotoxicity of a new nano zinc-oxide eugenol sealer on murine fibroblasts［J］. Iran Endod J，2015，10（4）：231-235.

［17］Sahu D，Kannan GM，Vijayaraghavan R，Anand T，Khanum F.Nanosized zinc oxide induces toxicity in human lung cells［J］.ISRN Toxicol，2013，2013：316075.

［18］Senapati VA，Kumar A，Gupta GS，Pandey AK，Dhawan A.ZnO nanoparticles induced inflammatory response and genotoxicity in human blood cells：a mechanistic approach［J］.Food Chem Toxicol，2015，85：61-70.

［19］Deng X，Luan Q，Chen W，Wang Y，Wu M，Zhang H，et al.Nanosized zinc oxide particles induce neural stem cell apoptosis［J］.Nanotechnology，2009，20（11）：115101.

［20］Jeng HA，Swanson J.Toxicity of metal oxide nanoparticles in mammalian cells［J］.J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Engng，2006，41（12）：2699-2711.

［21］Beckett WS，Chalupa DF，Pauly-Brown A，Speers DM，Stewart JC，F(xiàn)rampton MW，et al.Comparing inhaled ultrafine versus fine zinc oxide particles in healthy adults：a human inhalation study［J］.Am J Respir Crit Care Med，2005，171（10）：1129-1135.

［22］Horie M，Nishio K，F(xiàn)ujita K，Endoh S，Miyauchi A，Saito Y，et al.Protein adsorption of ultrafine metal oxide and its influence on cytotoxicity toward cultured cells［J］.Chem Res Toxicol，2009，16；22（3）：543-553.

［23］Lin WS，Xu Y，Huang CC，Huang YW.Toxicity of nano-and micro-sized ZnO particles in human lung epithelial cells［J］.J Nanopart Res，2009，11（1）：25-39.

［24］Sayse CM，Reed KL，Subramoney S，Warheit D. Can in vitro assays substitute for in vivo studies inassessing the pulmonary hazards of fine and nanoscale materials？［J］.J Nanopart Res，2009，11（2）：421-431.

［25］Sayes CM，Reed KL，Warheit DB.Assessing toxicity of fine and nanoparticles：comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles［J］.Toxicol Sci，2007，97（1）：163-180.

［26］Li XM.Properties and applications of nanometer ZnO［J］.J Tonghua Teach Coll（通化師范學(xué)院學(xué)報(bào)），2004，25（4）：54-56.

［27］Song W，Zhang J，Guo J，Zhang J，Ding F，Li L，et al.Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles［J］.Toxicol Lett，2010，199（3）：389-397.

Cytotoxicity and mechanism of zinc oxide nanoparticles on murine macrophage Ana-1 cells

CHU Tian-xue1,XING Li-guo2,YUAN Juan1,DAI Wei1,WANG Yuan1,LONG Xin-yu1,
LIU Ting1,ZUO Dai-ying1,WU Ying-liang1
(1.College of Life Science and Biopharmaceuticals,Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016,China;2.Safety Evaluation Center of Shenyang Research Institute of Chemical Industry Ltd.,Shenyang 110021,China)

OBJECTIVETo study the toxicity of zinc oxide nanoparticles(ZnO-NPs)on murine macrophage Ana-1 cells and the mechanism.METHODSAna-1 cells were incubated with ZnO-NP (2.5-160 mg·L-1).Cell viability was investigated by MTT assay.The integrity of cell membrane was investigated by acridine orange-ethidium bromide(AO-EB)staining.The intracellular uptake of ZnO-NP and the percentage of sub-G1of Ana-1 cells were detected by flow cytometry.Zinc ions were determined by fluorescent probe.The change of cell viability was studied after chelating zinc ions with ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA).RESULTSZnO-NP 2.5,5,10 and 20 mg·L-1decreased cell viability of Ana-1 cells(r=0.905,P＜0.05)in a concentration-dependent manner.The cell viability was decreased to 27.9%after exposure to ZnO-NP 20 mg·L-1.Intracellular uptake of ZnO-NP was increased after Ana-1 cell incubated with ZnO-NP at concentrations ranging from 40 to 160 mg·L-1(P＜0.05).There were obvious free zinc ions in the cells.EDTA 2.5 mmol·L-1significantly increased the cell viability decreased by ZnO-NP 20 mg·L-1(P＜0.05).Chelating free zinc ions significantly mitigated ZnO-NP induced cell toxicity (P＜0.05).CONCLUSIONCytotoxicity and apoptosis of Ana-1 cells induced by ZnO-NP might be related to intracellular uptake of ZnO-NP and release of zinc ions.

nanoparticles;zinc oxide;Ana-1 cells;cytotoxicity

The project supported by National Science and Technology Major Project of China(2013ZX09302304); and Liaoning Province Undergraduate Training Program for Innovation and Entrepreneurship(125010128)

ZUO Dai-ying,E-mail:zuodaiying@163.com;WU Ying-liang,E-mail:yingliang_1016@163.com

R99

A

1000-3002-（2017）06-0636-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.020

2016-04-22接受日期：2017-05-23）

（本文編輯：賀云霞）

國家科技重大專項(xiàng)（2013ZX09302304）；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（125010128）

褚天雪，女，碩士研究生，主要從事納米材料的毒性研究。

左代英，E-mail:zuodaiying@163.com;吳英良，E-mail:yingliang_1016@163.com