鉛暴露對體外血腦脊液屏障功能及ZO-1和閉合蛋白表達的影響

劉新秦，鄭剛，蘇鵬，曹宇鵬，劉楊，劉明朝

（中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學系軍隊勞動與環(huán)境衛(wèi)生學教研室，陜西西安710032）

鉛暴露對體外血腦脊液屏障功能及ZO-1和閉合蛋白表達的影響

劉新秦，鄭剛，蘇鵬，曹宇鵬，劉楊，劉明朝

（中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學系軍隊勞動與環(huán)境衛(wèi)生學教研室，陜西西安710032）

目的 通過建立體外血腦脊液屏障（BCB）模型，研究鉛誘導BCB損傷的可能機制。方法使用Z310細胞建立BCB體外細胞模型，分別加入Pb（AC）22.5，5.0和10.0 mmol·L-1，暴露24，48和72 h。采用跨內皮電阻（TEER）檢測法及葡聚糖法檢測BCB模型通透性；Western蛋白印跡法和免疫熒光法檢測BCB中緊密連接蛋白ZO-1和閉合蛋白表達及分布。結果 與細胞對照組相比，Pb（AC）22.5，5.0和10.0 mmol·L-1暴露48 h對Z310細胞存活率和密度均無明顯影響。暴露后第12天，與細胞對照組比較，Pb（AC）25.0和10.0 mmol·L-1組TEER值明顯降低（P＜0.05），葡聚糖通過率顯著增高（P＜0.05）。Western蛋白印跡法和免疫熒光法檢測結果 顯示，與細胞對照組相比，Pb（AC）2各濃度暴露48 h后，ZO-1和閉合蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。結論鉛暴露能夠破壞BCB模型的通透性，其機制可能與抑制緊密連接蛋白的表達有關。

血腦脊液屏障；鉛中毒；ZO-1；閉合蛋白

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.017

鉛是一種在自然界中廣泛存在的重金屬，其在人體的蓄積可以引起鉛中毒，引起包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內的全身性毒性［1］。近期危害評估尚未確定鉛暴露的“安全級別”［2］。目前的調查結果 顯示，在發(fā)展中國家，鉛暴露相關疾病的發(fā)病率顯著增高，由鉛暴露引起的疾病在全球疾病譜中占近1%［3］。

眾所周知，鉛具有較強的神經(jīng)毒性。目前對于鉛神經(jīng)毒性機制的研究主要集中在興奮性毒性、谷氨酸和N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）受體、氧化應激、基因表達和神經(jīng)遞質釋放等［4］。腦屏障由血腦屏障、血腦脊液屏障（blood-cerebral spinal fluid barrier，BCB）及腦脊液-腦屏障3部分組成。BCB位于腦室中脈絡叢血液與腦脊液之間，由脈絡叢上皮細胞組成，具有一定的通透性。BCB在維持大腦穩(wěn)態(tài)中起著很重要的作用，具備高效的屏障作用。

緊密連接是維持腦屏障的基本結構和功能完整性的物質基礎［5］，是細胞間的特異性結構，其特點主要包括于相鄰的細胞之間形成一個半透膜結構，能調節(jié)細胞頂端和基底膜之間的細胞旁運輸［6-7］。緊密連接包括跨膜蛋白、閉合蛋白、密封蛋白、交界性黏附分子和tricellulin以及胞內蛋白ZO-1等［8-9］。

Z310細胞是經(jīng)過永生化處理的大鼠脈絡叢上皮細胞系，在形態(tài)、生理功能和生化功能上能模擬體內脈絡叢細胞的特征，常用做研究脈絡叢細胞的體外細胞模型［4］。本研究用Z310細胞建立BCB模型，研究鉛暴露對BCB通透性的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

胎牛血清（青島灝洋生物公司），注射用青霉素鈉（黑龍江哈藥集團），注射用硫酸鏈霉素（深圳南方制藥有限公司），DMEM高糖型培養(yǎng)基干粉（美國Gibco公司），MTT（美國Sigma公司），BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司），RIPA裂解液（強）和PMSF（江蘇碧云天公司），兔抗ZO-1單抗、小鼠抗閉合蛋白單抗和Hoechst（美國Invitrogen公司），小鼠抗β肌動蛋白單抗（美國Sigma公司），F(xiàn)ITC標記山羊抗兔IgG抗體（北京中衫金橋公司），其余試劑為國產(chǎn)分析純。BX51FL熒光顯微鏡和CKX41倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），微型蛋白質電泳和轉移系統(tǒng)（美國Bio-rad公司），Alpha凝膠成像儀（美國Alpha公司），Allegra 64R低溫高速離心機（美國Beckman公司），UV-2550紫外可見分光光度計（日本島津公司），Infinite 200多功能酶標儀（奧地利Tecan公司），NU-2500E型CO2細胞培養(yǎng)箱（英國Forma Scientif公司）。

1.2 細胞傳代和培養(yǎng)

Z310細胞用含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1、鏈霉素100 g·L-1和表皮生長因子1 nmol·L-1的DMEM高糖培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)約3 d更換培養(yǎng)液1次，待細胞長滿約80%時，用0.25%胰酶-EDTA消化后進行細胞傳代。

1.3 MTT檢測細胞存活率

取對數(shù)期生長細胞，消化，計數(shù)，按1×108L-1細胞密度接種96孔板，每孔200 μL，每組設6復孔，邊緣孔用無菌磷酸鹽緩沖液填充。在5%CO2，37℃孵箱內常規(guī)培養(yǎng)，貼壁24 h后，更換培養(yǎng)液，分別加入含Pb（AC）22.5，5.0和10.0 μmol·L-1的培養(yǎng)液，繼續(xù)作用48 h，設細胞對照組。向每孔中加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h后小心吸走孔內培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min。酶聯(lián)免疫檢測儀上選定波長570 nm（參比波長630 nm），測定吸光度值（A）。相對存活率（%）=鉛暴露組（A570nm-A630nm）/對照組（A570nm-A630nm）×100%。

1.4 光鏡下觀察Z310細胞密度

取對數(shù)期生長Z310細胞，消化，計數(shù)，按1×108L-1的細胞密度接種90 mm培養(yǎng)皿中，分別設置Pb（AC）22.5，5.0和10.0 μmol·L-1組，同時設細胞對照組。在5%CO2，37℃孵箱內常規(guī)培養(yǎng)，貼壁24 h后加入含Pb（AC）2培養(yǎng)液，繼續(xù)作用48 h。倒置顯微鏡下拍照記錄細胞密度。

1.5 跨內皮電阻（transendothelial electrical resistance，TEER）法檢測BCB的通透性

采用對數(shù)生長期Z310細胞，消化，重懸，計數(shù)至2×108L-1，取0.9 mL加入到Transwell上孔內，下孔加入1.3 mL相同培養(yǎng)液，5%CO2，37℃常規(guī)培養(yǎng)。貼壁12 h后，更換培養(yǎng)液。將含有Pb（AC）22.5，5.0和10.0 μmol·L-1的培養(yǎng)基加入到上孔，下孔換同樣培養(yǎng)液，同時設細胞對照組。48 h換培養(yǎng)液1次，換液后檢測TEER值，記錄鉛暴露后第1～12天電阻值（Ω）。

1.6 FlTC-葡聚糖實驗檢測BCB的通透性

檢測TEER值后，用PBS 0.01 mol·L-1沖洗內外槽3次，于內槽加入0.8 mL無血清DMEM培養(yǎng)液，外槽加入1.3 mL無血清培養(yǎng)液。向內槽中加入FITC-葡聚糖工作液100 mL，于37℃培養(yǎng)15和30 min，從外槽中吸20 μL培養(yǎng)液，加入到180 μL PBS中稀釋，每組設3復孔。用酶標儀在492 nm下激發(fā)，520 nm波長下記錄發(fā)射光，測得熒光強度即代表通透性。

1.7 Western蛋白印跡法檢測ZO-1和閉合蛋白表達

取對數(shù)生長期Z310細胞，按2×105細胞種入60 mm的皿里，每孔5 mL培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)，貼壁12 h后，加入Pb（AC）22.5，5.0和10.0 μmol·L-1，分別作用24，48和72 h后收細胞樣品。提取細胞樣品總蛋白，進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）及Western蛋白印跡實驗。將ZO-1（1∶500）、閉合蛋白（1∶500）和β肌動蛋白（1∶5000）一抗用封閉液稀釋后，加于PVDF膜上孵育，于4℃過夜；使用相應二抗加于PVDF膜上，37℃孵育1.5 h；滴加發(fā)光液，凝膠成像分析儀記錄蛋白條帶發(fā)光圖像，并對蛋白條帶進行積分吸光度（integrated absorbance，IA）分析。目標蛋白相對表達水平用IA目標蛋白/IAβ肌動蛋白比值表示。

1.8 免疫熒光法檢測ZO-1和閉合蛋白的表達及定位

取對數(shù)生長期Z310細胞，消化，計數(shù)，按每孔1×105細胞接種6孔板中，每孔加2 mL培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，貼壁12 h后，加入Pb（AC）210.0 μmol·L-1繼續(xù)作用48 h收集細胞樣品。將細胞爬片進行固定及透化處理，配制閉合蛋白（小鼠）1∶200和ZO-1（兔）1∶200一抗置于濕盒內，4℃過夜。室溫避光60 min。30%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照，進行數(shù)據(jù)分析，熒光強度代表蛋白表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 鉛暴露對Z310細胞存活率的影響

MTT法結果 （圖1）可見，Pb（AC）22.5，5.0和10.0 μmol·L-1暴露48 h對細胞存活率無顯著影響。

Fig.1 Effect of Pb（AC）2on cell viability of Z310 cells.Cells were treated with Pb（AC）2for 48 h.x±s，n=6.

2.2鉛暴露對Z310細胞密度的影響

光鏡觀察鉛暴露后48 h各組細胞密度的改變（圖2）。結果 表明，本實驗所選擇的鉛暴露濃度對細胞密度的影響較小，不會因密度不同而導致緊密連接蛋白表達水平的變化。

Fig.2 Effect of Pb（AC）2on cell density of Z310 cells under light microscope.Cells were treated with Pb（AC）2for 48 h.

2.3 鉛暴露對體外BCB屏障通透性的影響

2.3.1 TEER法

圖3結果 可見，鉛暴露第2天，TEER值＞20 Ω，表明模型建立成功。鉛暴露第12天，Pb(AC)25.0和10.0 μmol·L-1組TEER值顯著低于細胞對照組（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of Pb（AC）2on barrier permeability of bloodcerebral spinal fluid barrier（BCB）in vitroby transendothelial electrical resistance（TEER）assay.Cells were treated with Pb（AC）2for 48 h.x±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

2.3.2 FlTC-葡聚糖法

圖4結果 可見，在內槽中加入FITC-葡聚糖后，在外槽中葡聚糖含量也逐漸增高。加入葡聚糖30 min后，與細胞對照組相比，Pb(AC)25.0和10.0 μmol·L-1組葡聚糖通過率顯著增高（P＜0.05）。表明低濃度鉛暴露可以造成BCB體外模型屏障通透性增加，引起葡聚糖大分子的通過率增高。

2.4 鉛暴露對BCB中ZO-1和閉合蛋白表達的影響

2.4.1 Western蛋白印跡法

Fig.4 Effect of Pb（AC）2exposure on BCB permeabilityin vitroby FTlC-dextran assay.x±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control（0.0）group.

Fig.5 Effect of Pb（AC）2exposure on ZO-1 and occludin protein expression in Z310 cells by Western blotting.B and C were the semi-quantitative results of A.x±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control（0.0）group.

鉛暴露24 h后，Z310細胞中ZO-1和閉合蛋白蛋白表達均無明顯變化；鉛暴露48 h后，ZO-1和閉合蛋白水平均明顯下降（P＜0.05）（圖5B）；鉛暴露72 h后，僅ZO-1蛋白水平下降（P＜0.05），閉合蛋白變化不顯著（圖5C）。

2.4.2 免疫熒光法

免疫熒光法檢測結果 （圖6）可見，細胞對照組ZO-1在細胞間呈完整的網(wǎng)狀結構分布；鉛暴露48 h后，鉛暴露組細胞間ZO-1分布表現(xiàn)為斷續(xù)分布；鉛暴露組閉合蛋白的分布除呈斷續(xù)狀外，其熒光強度也有一定程度的下降（P＜0.05）。表明鉛暴露48 h可導致BCB體外模型緊密連接結構破壞，伴有ZO-1和閉合蛋白表達水平下降。

Fig.6 Effect of Pb（AC）2exposure on ZO-1 and occludin protein expression in Z310 cells by immunofluorescence.Immunofluorescence images for ZO-1（red）and Hoechst（blue）or for occludin（green）and Hoechst（blue）.The white arrows represent the distribution of protins.B was the semi-quatitative result of A.x±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

3 討論

本研究結果 表明，低濃度的鉛暴露可以造成BCB體外模型屏障的完整性破壞，表現(xiàn)為TEER值降低，葡聚糖大分子的通過率增高，緊密連接蛋白ZO-1和閉合蛋白結構破壞且蛋白表達水平下降。BCB位于腦室脈絡叢的血液與腦脊液之間，由脈絡叢上皮細胞組成，結構基礎主要是脈絡叢上皮細胞之間有閉鎖小帶（屬緊密連接）相連。脈絡叢通過產(chǎn)生和分泌腦脊液來維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。本研究結果 表明，鉛通過破壞體外BCB模型中緊密連接的蛋白結構，從而導致屏障的完整性受到破壞，屏障的通透性增大，導致屏障功能受到影響。緊密連接變化的調控機制有待進一步的研究。

鉛作為一種在自然界中廣泛存在的重金屬，在人體的蓄積可以引起鉛中毒，引起包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內的全身性毒性，即使是低濃度的鉛暴露也會導致神經(jīng)系統(tǒng)的損傷［10］。盡管我國已經(jīng)禁止使用含鉛汽油，但是鉛污染尤其是鉛造成的神經(jīng)損傷，仍值得關注［11］。鉛對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，主要由于鉛對屏障系統(tǒng)中的毛細血管具有較高的親和力，可以通過損傷大腦毛細血管內皮細胞的膜結構，破壞在內皮細胞間形成的緊密連接，從而通過腦屏障系統(tǒng)進入大腦實質。而屏障系統(tǒng)的結構和功能的損傷可使血液和大腦組織之間的物質交換失去約束，導致大腦微環(huán)境平衡的紊亂，在鉛神經(jīng)毒性中可能起到關鍵作用。BCB中脈絡叢通過產(chǎn)生和分泌腦脊液來維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。鉛可以在脈絡叢中特異性地聚集，且在動物實驗發(fā)現(xiàn)，脈絡叢中的鉛含量具有劑量和時間依賴性。有文獻報道，在急性鉛暴露后，脈絡叢中鉛含量比大腦實質中高出57倍；而低劑量慢性鉛暴露30 d后，脈絡叢中鉛的含量是對照的7倍左右，并達到峰值，即使延長染鉛時間至60～90 d，也不能增加鉛的蓄積量［12］。研究表明，鉛染毒可導致BCB通透性增加、分泌和轉運功能下降，這可能是鉛致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機制之一［13］。

Zheng等［14］報道，慢性鉛暴露可通過降低腦脊液中轉甲狀腺素蛋白濃度，影響發(fā)育期大鼠大腦獲取甲狀腺素，繼而損傷腦發(fā)育；相似結果 在體外實驗中也得到證實。Zhao等［15］報道，在體外BCB模型中，鉛暴露可使鉛離子蓄積于脈絡叢內皮細胞中，改變了蛋白激酶C活性，加快蛋白激酶C從胞漿到細胞膜的移位，從而破壞BCB屏障功能。而本實驗室以往研究表明，鉛可以通過激活Src信號通路，從而調控緊密連接蛋白表達水平［16］。今后將進一步探討轉甲狀腺素蛋白濃度、細胞信號轉導等途徑在鉛暴露所致BCB通透性改變的具體調控機制，進一步闡明鉛神經(jīng)毒性機制。

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Effect of lead exposure on function of blood-cerebrospinal fluid barrier and ZO-1 and occludin protein expression in vitro

LIU Xin-qin,ZHENG Gang,SU Peng,CAO Yu-peng,LIU Yang,LIU Ming-chao
(Department of Occupational&Environmental Health,School of Public Health,the Fourth Military Medical University of PLA,Xi′an 710032,China)

OBJECTlVETo establish an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier(BCB)model to investigate the underlying mechanism of lead-induced BCB injuries.METHODSThe in vitro BCB model was established by Z310 cells.Different concentrations of Pb(AC)2(2.5,5.0 and 10.0 mmol·L-1)were used for 24,48 and 72 h.Transendothelial electrical resistance(TEER)and flux of FITC-dextran were performed to determine the permeability of the in vitro BCB model.Western blotting and immunofluorescence methods were used to observe the expression of tight junction protein ZO-1 and occludin.RESULTSCompared with control group,Pb(AC)22.5,5.0 and 10.0 mmol·L-1exposure for 48 h to Z310 cells had no significant effect on survival rate and density.TEER in different groups was gradually increasing.At the 12thday after Pb(AC)2exposure,the values of TEER and flux of FITC-dextran in Pb(AC)25 and 10 mmol·L-1groups were significantly decreased(P＜0.05).Western blotting and immunofluorescence images showed that the expression of ZO-1 and occludin were significantly decreased(P＜0.05)after Pb(AC)2exposure for 48 h.CONCLUSlONLead exposure can cause the breakdown of BCB barriers, and this effect may be mediated by reducing the expression of ZO-1 and occludin proteins.

blood-cerebral spinal fluid barrier;lead poisoning;ZO-1;occludin

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81472942);and the Fourth Military Medical University Youth Talent Cultivation Plan(4139Z3B6BC)

LIU Ming-chao,E-mail:lmclmc@fmmu.edu.cn

R995

A

1000-3002-（2017）06-0615-06

2017-02-17接受日期：2017-05-22）

（本文編輯：喬虹）

國家自然科學基金（81472942）；第四軍醫(yī)大學青年英才培育計劃（4139Z3B6BC）

劉新秦，碩士，講師，主要從事重金屬毒理學研究。

劉明朝，E-mail：lmclmc@fmmu.edu.cn