毒理學(xué)研究的高內(nèi)涵篩選及其在藥物肝毒性研究中的應(yīng)用

葛帥，湯納平，付立杰，馬璟

（中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院國家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海201203）

毒理學(xué)研究的高內(nèi)涵篩選及其在藥物肝毒性研究中的應(yīng)用

葛帥，湯納平，付立杰，馬璟

（中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院國家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海201203）

藥物性肝損傷（DILI）是導(dǎo)致藥物研發(fā)終止或從市場(chǎng)撤回的重要原因之一，建立可預(yù)測(cè)、高通量的臨床前檢測(cè)系統(tǒng)以評(píng)估臨床潛在的肝毒性是藥物研發(fā)的迫切需要。基于細(xì)胞成像的高內(nèi)涵篩選（HCS）技術(shù)，允許同時(shí)檢測(cè)多個(gè)細(xì)胞參數(shù)，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)多種信號(hào)通路闡明細(xì)胞損傷的機(jī)制，具有高度的敏感性和特異性。目前已有多種肝細(xì)胞模型用于高內(nèi)涵毒性篩選。本文介紹了HCS技術(shù)，回顧了近年來利用高內(nèi)涵成像技術(shù)獲得的藥物肝毒性資料，探討了其在肝毒性機(jī)制探索中的應(yīng)用，以及高內(nèi)涵成像技術(shù)在DILI研究中的作用。

高內(nèi)涵篩選；肝毒性；毒理學(xué)

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是一種常見的藥物不良反應(yīng)，在藥物性靶器官毒性中排第二位，僅次于心臟毒性［1］。尤其是特異質(zhì)DILI對(duì)一些患者的嚴(yán)重性和不可預(yù)測(cè)性，已成為制藥行業(yè)、監(jiān)管機(jī)構(gòu)以及臨床上面臨的主要挑戰(zhàn)［2］。DILI已被證實(shí)是一個(gè)由多種機(jī)制參與的復(fù)雜病理過程［3］，傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性篩選依賴于對(duì)不同毒性指標(biāo)的單終點(diǎn)測(cè)定，無法準(zhǔn)確反映一個(gè)細(xì)胞群體的損傷或死亡狀況。而高內(nèi)涵篩選（high-content screening，HCS）技術(shù)能夠定量和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)由藥物或其他化合物引起的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生化指標(biāo)和細(xì)胞功能的改變，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單細(xì)胞群的多參數(shù)和多靶點(diǎn)分析。本文整合了近年來利用HCS技術(shù)獲得的藥物肝毒性資料及其在肝毒性機(jī)制探索中的應(yīng)用，以探討HCS技術(shù)在早期肝毒性篩選中的應(yīng)用前景。

1 高內(nèi)涵篩選技術(shù)的原理

1.1 高內(nèi)涵篩選技術(shù)概述

HCS技術(shù)是一種結(jié)合自動(dòng)化熒光顯微鏡的細(xì)胞定量成像分析系統(tǒng)。它可以在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整的前提下，檢測(cè)藥物或化合物對(duì)細(xì)胞的作用，確定藥物或化合物的生物活性或潛在毒性。其基本工作流程是：化合物處理后的細(xì)胞與指示不同細(xì)胞毒性參數(shù)的多種熒光探針混合物孵育，通過自動(dòng)化熒光顯微鏡多通道波長照射細(xì)胞成像，由成像技術(shù)捕獲圖像信息后，經(jīng)專業(yè)的圖像處理軟件在單個(gè)細(xì)胞水平對(duì)大量的細(xì)胞及相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別和運(yùn)算，最后由數(shù)據(jù)管理軟件統(tǒng)計(jì)分析得到相應(yīng)的生物學(xué)特性的數(shù)據(jù)（圖1）。與單細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè)藥物的毒性相比，這種多參數(shù)檢測(cè)策略為提高檢測(cè)輕微毒性的敏感度提供了可能性［4-5］，進(jìn)而可大大減少細(xì)胞、試劑和待測(cè)化合物的用量。同時(shí)，多通道復(fù)合檢測(cè)結(jié)果 可以通過軟件計(jì)算出在同一細(xì)胞中不同參數(shù)值之間的關(guān)系，有助于更好地解釋由細(xì)胞處理引起的潛在改變［6］。

1.2 高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)的組成

高內(nèi)涵檢測(cè)儀是實(shí)現(xiàn)HCS的必備儀器，一般由自動(dòng)化熒光圖像獲取系統(tǒng)、圖像分析系統(tǒng)和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)組成，有的還配備自動(dòng)加樣器和環(huán)境控制系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)多孔板自動(dòng)加樣以及維持細(xì)胞檢測(cè)時(shí)正常的生存環(huán)境。

HCS區(qū)別于普通熒光顯微鏡的最大特點(diǎn)是其圖像獲取系統(tǒng)的全自動(dòng)化和高速化。成像系統(tǒng)通常包括連續(xù)光源帶、多通道激發(fā)和發(fā)射濾光片、顯微鏡模塊和高速高分辨率圖像傳感器。新型顯微鏡成像技術(shù)的發(fā)展大大提高了獲取圖像的速度、質(zhì)量和靈活度，如全自動(dòng)水浸物鏡浸液掃描的應(yīng)用大大提高了圖像分辨率；與傳統(tǒng)共聚焦技術(shù)固定針孔相比，高速轉(zhuǎn)盤和可變針孔自動(dòng)對(duì)焦，短時(shí)間內(nèi)精確掃描多通道的熒光信號(hào)；大芯片電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）相機(jī)的成像視野約是標(biāo)準(zhǔn)芯片相機(jī)的4倍，能夠更細(xì)致地獲取細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)。

對(duì)于真正的HCS高通量實(shí)驗(yàn)，需要評(píng)估成千上萬個(gè)圖像，單純依靠手動(dòng)評(píng)分變得不可行，這對(duì)圖像的自動(dòng)化處理提出了很高的要求。圖像和數(shù)據(jù)分析的主要步驟包括：圖像處理、象分割、特征提取和選擇以及統(tǒng)計(jì)分析。在圖像采集之后，首先需要通過濾波器消除噪聲，對(duì)圖像進(jìn)行背景校正；接下來通過相應(yīng)的算法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分割并定義顯微鏡圖像中感興趣的區(qū)域，提取如細(xì)胞核與細(xì)胞面積比等定量特征；不是所有提取的特征都適用于要解決的生物學(xué)問題，需要研究人員根據(jù)給定的生物學(xué)問題選擇特征子集用于后續(xù)分析；最后通過數(shù)據(jù)挖掘模塊，可視化和量化所檢測(cè)的參數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，將每個(gè)細(xì)胞的大量測(cè)量結(jié)果 轉(zhuǎn)化為生物學(xué)上有意義的結(jié)果 。

另外，HCS產(chǎn)生的信息豐富，越來越復(fù)雜的圖像分析算法會(huì)產(chǎn)生TB級(jí)容量的圖像數(shù)據(jù)，為此開發(fā)的數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生，如科學(xué)圖像數(shù)據(jù)庫（the Scientific Image DataBase）和開放顯微鏡檢查環(huán)境（the Open Microscopy Environment）等高內(nèi)涵數(shù)據(jù)管理平臺(tái)的應(yīng)用［7-8］，在數(shù)據(jù)分析過程中可以方便地注釋、建檔、檢索及存儲(chǔ)高內(nèi)涵圖像和數(shù)據(jù)。

圖1 高內(nèi)涵篩選工作流程

2 高內(nèi)涵篩選技術(shù)在藥物性肝損傷篩選中的應(yīng)用

HCS現(xiàn)已成為公認(rèn)的藥物研發(fā)早期毒性篩選的有力工具。不同的多探針HCS檢測(cè)技術(shù)已用于藥物肝毒性分類及候選化合物優(yōu)先開發(fā)分級(jí)。

Tolosa等［5］采用HepG2細(xì)胞通過HCS技術(shù)確定78種化合物的肝毒性類型。待測(cè)化合物處理后的細(xì)胞裝載細(xì)胞核指示劑Hoechst33342、細(xì)胞核指示劑碘化丙啶（propidium iodide，PI）、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）指示劑四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM）、脂肪指示劑氟硼二吡咯（BODIPY）665/676和鈣離子指示劑氟-4乙烯氧甲酯（fluo-4 acetoxymethyl ester，F(xiàn)luo-4 AM），利用Scan和In Cell Analyzer系統(tǒng)聯(lián)合獲取細(xì)胞圖像，Scan分析模塊對(duì)細(xì)胞圖像分析，最終可分別通過不同肝毒性作用機(jī)制和肝損傷程度2種方式對(duì)78種化合物分類，所得結(jié)果 有很高的敏感性（MMP、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和核型變化的敏感性分別為83%，97%，100%和63%）。

Persson等［9］開發(fā)了一種“四探針法”HCS檢測(cè)用于新藥開發(fā)早期候選化合物的DILI風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。該實(shí)驗(yàn)選取臨床已知肝毒性譜的100種藥物進(jìn)行驗(yàn)證，將這些藥物分為嚴(yán)重、中度和無肝毒性3個(gè)級(jí)別，分別與HepG2細(xì)胞孵育后加入4種混合熒光探針，檢測(cè)細(xì)胞毒作用相關(guān)的6個(gè)參數(shù)：核數(shù)、核面積、質(zhì)膜完整性、溶酶體活性、MMP和線粒體面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藥物濃度＜100倍人體最大血漿藥物濃度時(shí)，若細(xì)胞≥2個(gè)參數(shù)表示毒性效應(yīng)，通常該藥物具有肝毒性；若細(xì)胞＜2個(gè)參數(shù)表示毒性效應(yīng)，一般為非肝毒性藥物。綜合6個(gè)參數(shù)檢測(cè)結(jié)果 并進(jìn)行分層聚類分析，證明該方法能夠在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)準(zhǔn)確鑒別肝細(xì)胞毒性藥物（肝毒性導(dǎo)致撤市藥物、嚴(yán)重或中度肝毒性藥物）和非肝毒性藥物，而且可以實(shí)現(xiàn)有效預(yù)測(cè)先導(dǎo)化合物或候選藥物是否具有誘導(dǎo)肝毒性的傾向，為新藥標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)測(cè)肝細(xì)胞毒性提供了整體視角。

3 高內(nèi)涵篩選技術(shù)在藥物性肝損傷機(jī)制研究中的應(yīng)用

3.1 線粒體損傷

線粒體在細(xì)胞存活中扮演著整合各種細(xì)胞信號(hào)通路與維持細(xì)胞代謝的關(guān)鍵角色，其結(jié)構(gòu)和功能的損傷是造成DILI的常見機(jī)制。線粒體損傷會(huì)造成各種有害結(jié)果 ，如氧化應(yīng)激、ATP耗竭、脂肪變性和細(xì)胞死亡。這些結(jié)果 進(jìn)而造成DILI不同的臨床表現(xiàn)，從臨床無癥狀的血清生化指標(biāo)輕度改變到嚴(yán)重的毒性反應(yīng)包括脂肪性肝炎、肝硬變和肝衰竭［10］?？紤]到線粒體毒性的嚴(yán)重后果，越來越多的研究者推薦將線粒體毒性效應(yīng)納入新藥毒理學(xué)的研究體系。

通常，線粒體結(jié)構(gòu)異常、電子傳遞鏈紊亂以及MMP改變會(huì)同步發(fā)生，在單細(xì)胞水平對(duì)線粒體相關(guān)的多個(gè)參數(shù)同步檢測(cè)有助于更好地了解它們之間的相互作用［11］，而采用HCS技術(shù)研究線粒體實(shí)現(xiàn)了其多參數(shù)實(shí)時(shí)同步定量監(jiān)測(cè)。除了其他通用的HCS分析將MMP作為研究DILI相關(guān)的主要機(jī)制，數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)研究線粒體功能障礙。如Tolosa等［10］設(shè)計(jì)了基于HCS的多參數(shù)早期化合物篩選方法用于評(píng)估潛在的線粒體肝毒性藥物，采用多種熒光探針進(jìn)行不同的組合實(shí)驗(yàn)，利用HCS系統(tǒng)獲取細(xì)胞圖像并進(jìn)行定量分析，篩選引起線粒體損傷的藥物，研究線粒體損傷誘因和凋亡誘因等。通過該方法闡述了一系列涉及他汀類藥物肝毒性的細(xì)胞機(jī)制，證實(shí)他汀類藥物可通過增加線粒體超氧化物、改變MMP及細(xì)胞質(zhì)鈣離子濃度等機(jī)制誘導(dǎo)線粒體毒性，這在以往出版的文獻(xiàn)中少有報(bào)道。該方法對(duì)于特異性的靶向線粒體損傷檢測(cè)有很高的敏感性。Kim等［12］采用HCS系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)HepG2細(xì)胞成像，通過相應(yīng)的熒光探針試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、線粒體滲透性轉(zhuǎn)變、胱天蛋白酶3活性等細(xì)胞參數(shù)，發(fā)現(xiàn)奈法唑酮、托卡朋和曲格列酮通過線粒體損傷介導(dǎo)肝細(xì)胞毒性；而通過胱天蛋白酶8抑制測(cè)驗(yàn)表明，吡羅昔康是通過非線粒體途徑造成肝細(xì)胞損傷。由此可見，采用HCS技術(shù)檢測(cè)線粒體毒性有望成為體外藥物測(cè)試和安全性評(píng)價(jià)的領(lǐng)先策略。

3.2 膽汁淤積

藥物引起的膽汁淤積性肝損傷大致可分為急性和慢性2種，表現(xiàn)為肝內(nèi)膽汁淤積和膽小管擴(kuò)張，經(jīng)常伴有膽栓，嚴(yán)重的可導(dǎo)致膽管消失綜合征，并最終可能導(dǎo)致纖維化和肝硬變［13］。膽鹽從肝細(xì)胞輸出主要依賴于原發(fā)性主動(dòng)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與，如膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）、多藥耐藥相關(guān)蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2）。BSEP基因突變與肝膽汁淤積癥有關(guān)，藥物往往通過抑制BSEP和MRP2導(dǎo)致膽汁淤積性肝損傷［14］。

因嚙齒類動(dòng)物與人的膽囊組成上的差異，導(dǎo)致其對(duì)膽汁淤積性肝損傷不明顯。這使得體外藥物致膽汁淤積評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)變得更有價(jià)值［14-15］。目前常用的體外模型為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過表達(dá)的囊泡系統(tǒng)或結(jié)合細(xì)胞成像技術(shù)的三維結(jié)構(gòu)的肝細(xì)胞。采用夾層膠原“三明治”結(jié)構(gòu)培養(yǎng)的肝細(xì)胞在體外可形成組織樣結(jié)構(gòu)的小管，形態(tài)上與體外肝切片非常相似，更接近體內(nèi)的情況［15］。而借助HCS系統(tǒng)可實(shí)時(shí)定量分析膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)至組織樣小管的過程。

Xu等［16］在肝細(xì)胞成像分析技術(shù)的基礎(chǔ)上開發(fā)了膽汁流量成像分析技術(shù)，采用膽鹽類似物膽酰賴氨酰熒光素（cholyl-lysyl-fluorescein，CLF）作為熒光探針作用于三維結(jié)構(gòu)的人原代肝細(xì)胞，通過HCS系統(tǒng)獲取細(xì)胞圖像后由相應(yīng)的圖像分析軟件處理，可觀察到肝細(xì)胞形成的膽管結(jié)構(gòu)，并能通過膽汁流量成像評(píng)價(jià)膽管轉(zhuǎn)運(yùn)功能。隨后，Germano等［17］選用“三明治”結(jié)構(gòu)培養(yǎng)的肝細(xì)胞，與待測(cè)化合物孵化14 d模仿慢性藥物治療，HCS技術(shù)檢測(cè)MRP2介導(dǎo)的膽管運(yùn)輸、中性脂肪和磷脂積累等功能性終點(diǎn)。結(jié)果 表明，相比于脂肪肝和磷脂沉積預(yù)測(cè)，此研究系統(tǒng)更適于藥源性膽汁淤積癥的研究。最近報(bào)道了一種細(xì)胞膽管成像檢測(cè)法測(cè)定化合物對(duì)膽汁運(yùn)輸?shù)恼w的抑制作用［18］，該方法采用CLF和羧甲基熒光素二乙酸酯（carboxy-methylfluorescein diacetate，CMFDA）分別作為BSEP和MRP2的底物，通過檢測(cè)CLF或CMFDA代謝物在小管的熒光強(qiáng)度確定藥物對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制程度。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞CLF積累的IC50值與人BSEP囊泡實(shí)驗(yàn)的IC50值有很高的一致性。與此同時(shí)，研究者也對(duì)這2種熒光染料的特異性提出了質(zhì)疑。這些研究表明，HCS技術(shù)是膽汁淤積肝損傷研究中有前景的藥物篩選工具。

3.3 脂肪變性

參與脂肪變性的主要機(jī)制是直接或間接抑制長鏈脂肪酸的β氧化。目前使用的許多藥物都能誘導(dǎo)脂肪變性，主要是肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯過度積累。最近的研究表明，細(xì)胞暴露于能夠誘導(dǎo)肝脂肪變性的藥物，編碼脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白的轉(zhuǎn)錄因子和基因的表達(dá)譜也發(fā)生了改變［19］。某些藥物引起的空泡脂肪變性，長時(shí)間暴露于藥物后可使短期可逆和良性狀態(tài)發(fā)展為更嚴(yán)重的病變（脂肪性肝炎、纖維化和肝硬變）。這些嚴(yán)重的不良反應(yīng)成為臨床試驗(yàn)中斷或藥物撤市的原因，以及幾種藥物被限制臨床使用的原因（如非阿尿苷、哌克昔林和丙戊酸）［20］。

目前，只有少數(shù)體外實(shí)驗(yàn)被開發(fā)用于評(píng)價(jià)新藥潛在的致肝脂肪變性的風(fēng)險(xiǎn)，其中采用HCS技術(shù)檢測(cè)脂肪變性的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)取得了較好的結(jié)果 。Fujimura等［21］使用熒光脂肪酸模擬劑BODIPY558/ 568 C12分析幾種藥物對(duì)大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂肪含量的影響。結(jié)果 顯示，HCS細(xì)胞成像檢測(cè)比熒光計(jì)檢測(cè)熒光顆粒更為敏感、選擇性更高。Donato等［22］利用HCS技術(shù)評(píng)估藥物引起的脂肪肝毒性，藥物處理過的HepG2細(xì)胞用熒光探針Hoechst33342，PI，TMRM，BODIPY493/503和2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2′，7′-dihydrodichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）等染色，評(píng)估細(xì)胞核型、細(xì)胞存活、MMP、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累和活性氧生成等指標(biāo)，能夠100%精確識(shí)別誘導(dǎo)脂肪變性的陽性和陰性化合物；與采用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估藥物引起的脂肪變性相比，該方法的通量更高，檢測(cè)時(shí)間更快。Pradip等［23］采用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）分化的肝細(xì)胞來源的肝細(xì)胞檢測(cè)脂肪變性。結(jié)果 表明，與HepG2細(xì)胞相比，iPSC來源的肝細(xì)胞產(chǎn)生的HCS數(shù)據(jù)在不同孔、不同板和不同批次之間的敏感性和準(zhǔn)確率更高。這一系列的細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)表明，HCS是一種簡(jiǎn)單、快速、敏感的用于脂肪變性誘導(dǎo)藥物篩選的工具。

3.4 磷脂沉積

藥物誘導(dǎo)的磷脂沉積是肝細(xì)胞及其他組織細(xì)胞脂質(zhì)過度積累的另一種病變形式，它以磷脂在細(xì)胞溶酶體內(nèi)積累，導(dǎo)致溶酶體腫大和形成多層狀囊泡結(jié)構(gòu)為特點(diǎn)。許多副反應(yīng)與可引起磷脂沉積的藥物有關(guān)，特別是同時(shí)含有親水性陽離子側(cè)鏈和疏水區(qū)域結(jié)構(gòu)的藥物。藥物誘導(dǎo)的磷脂沉積往往是可逆的，它是細(xì)胞的一種確切的毒性表現(xiàn)還是適應(yīng)性反應(yīng)目前仍存在爭(zhēng)議，但監(jiān)管機(jī)構(gòu)仍將其視為一種不利因素，并建議在早期的藥物研發(fā)中篩選或評(píng)估藥物引起磷脂沉積的風(fēng)險(xiǎn)［24-25］。

HCS系統(tǒng)目前已被應(yīng)用于磷脂沉積中高通量檢測(cè)。常用的選擇性探針包括LipidTOX染料或熒光標(biāo)記的磷脂類似物，如NDB-PE或ss-BODIPY C（12）-HPC［25］，它們可選擇性地定位于累積磷脂的溶酶體而不會(huì)定位于胞質(zhì)中的脂肪滴［26］。Tilmant等［27］采用基因組學(xué)和熒光檢測(cè)HepG2細(xì)胞2種體外方法篩選11種化合物誘導(dǎo)的磷脂沉積。結(jié)果 表明，在靈敏度和特異性上熒光檢測(cè)方法優(yōu)于基因組學(xué)方法。文獻(xiàn)報(bào)道，HCS結(jié)合NBD-PE熒光標(biāo)記物檢測(cè)中國倉鼠卵巢細(xì)胞K1（CHO-K1）和人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞磷脂沉積，對(duì)56種化合物潛在的誘導(dǎo)磷脂沉積作用進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 表明，該方法于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外硅片模型數(shù)據(jù)相比有較高的靈敏度（CHO-K1：92.0%，HepG2：88.0%）和特異性（CHO-K1：87.1%，HepG2：80.6%）［28］。最近，一種定量高通量篩選平臺(tái)被開發(fā)用于評(píng)估和分析大量藥物引起的磷脂沉積［29］，1536孔板培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，lipid TOX Red和Hoechst33342染色，寬場(chǎng)成像HCS系統(tǒng)獲取細(xì)胞圖像并結(jié)合相應(yīng)軟件進(jìn)行定量分析。結(jié)果 顯示，對(duì)1280種化合物的初篩實(shí)驗(yàn)中有187種有效值＞30%，即可能具有磷脂沉積作用，選取其中的109種進(jìn)行驗(yàn)證，與初篩結(jié)果 的一致性達(dá)到100%。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明，HCS技術(shù)可用于篩選和評(píng)價(jià)潛在的誘導(dǎo)磷脂沉積的化合物。

3.5 活性代謝物生成

眾所周知，有些藥物在體內(nèi)經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂卸拘缘幕钚源x物，或因患者遺傳因素使藥物代謝異常而最終導(dǎo)致肝損傷［30］。此前已有多種藥物由于活性代謝物引起的肝毒性而被撤市，如非爾氨酯、溴芬酸和曲格列酮等。建立能夠反映臨床體內(nèi)代謝物介導(dǎo)的肝毒性的體外篩選系統(tǒng)是早期肝毒性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵步驟。

以往大多數(shù)檢測(cè)都是基于使用人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞［26］，然而HepG2細(xì)胞是由肝癌細(xì)胞衍生而來，其遺傳表型與人原代肝細(xì)胞已有很大差異，部分參與藥物代謝的CYP表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人原代肝細(xì)胞，難以檢出代謝活化的藥物，尤其是涉及毒性機(jī)制的研究中不足以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)DILI［5］。近年來，一些研究者提出基于HCS方法探討藥物毒性的肝細(xì)胞模型，來實(shí)現(xiàn)外源化合物在肝細(xì)胞代謝的可視化，既能提高對(duì)具有代謝活性的藥物的檢出率，同時(shí)可評(píng)價(jià)活性代謝物的毒作用機(jī)制。作為體外肝毒性評(píng)價(jià)的金標(biāo)準(zhǔn)，人原代肝細(xì)胞具有人類特有的代謝酶和輔因子，保留了人體關(guān)鍵的肝功能，已被廣泛用于HCS檢測(cè)［30］。此外，人iPSC（humaniPSC，hiPSC）分化的肝細(xì)胞能夠表達(dá)代謝相關(guān)的關(guān)鍵P450酶，并且來源豐富，尤其是來自健康志愿者和DILI患者的hiPSC分化的肝細(xì)胞，可以更好地預(yù)測(cè)人體DILI，并了解遺傳傾向所起的作用，目前也已被應(yīng)用于HCS預(yù)測(cè)肝毒性領(lǐng)域［31］。采用含有藥物代謝酶相關(guān)基因的重組腺病毒為載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞［32］，使其表達(dá)主要的P450代謝酶CYP1A2，CYP2D6，CYP2C9，CYP2C19以及CYP3A4。采用這種模型用HCS技術(shù)篩選能產(chǎn)生活性代謝物的藥物，相比于HepG2細(xì)胞，已知具有代謝活化效應(yīng)的待測(cè)化合物IC50值更低，而在非代謝活性藥物中2種細(xì)胞模型得到的IC50值及其他參數(shù)值結(jié)果 相似。相比于HepG2細(xì)胞，HepaRG細(xì)胞可正常表達(dá)CYP酶。研究表明，通過反應(yīng)性代謝物消耗GSH的DILI化合物，在HepaRG細(xì)胞比在HepG2細(xì)胞，GSH降低或ROS升高更明顯；對(duì)2種細(xì)胞有不同程度的CYP酶表達(dá)比較，有助于闡明代謝對(duì)肝細(xì)胞毒性的作用［33］。

4 展望

經(jīng)過十多年的發(fā)展，HCS功能日益強(qiáng)大，已成為制藥行業(yè)的重要組成部分，但該技術(shù)尚有大量的技術(shù)難題有待研究和解決。目前，HCS儀器大多不具有比例成像分析的功能，隨著多參數(shù)檢測(cè)復(fù)雜性的增加，更高分辨率的顯微鏡和新的成像方式需要進(jìn)一步發(fā)展。最近一項(xiàng)關(guān)于HCS的調(diào)查顯示，每年發(fā)布的HCS實(shí)驗(yàn)數(shù)量雖持續(xù)穩(wěn)步增長，但信息內(nèi)容滯后，并未充分發(fā)揮HCS技術(shù)多維數(shù)據(jù)分析的優(yōu)勢(shì)，其主要原因在于圖像分析方法的限制［34］。對(duì)于特定的HCS檢測(cè)通常組合不同的方法來實(shí)現(xiàn)最佳分析，但往往由于對(duì)實(shí)驗(yàn)人員生物信息學(xué)知識(shí)儲(chǔ)備的要求較高而無法實(shí)現(xiàn)。未來的發(fā)展方向是構(gòu)建強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，提高分析軟件的數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)和高維數(shù)據(jù)分析方法，并可以根據(jù)個(gè)人需求輕松定制，實(shí)現(xiàn)將每個(gè)細(xì)胞的海量信息轉(zhuǎn)化為生物學(xué)上可解釋的結(jié)果 。此外，尋找具有更高特異性和兼容性的指示劑和試劑也是HCS技術(shù)發(fā)展的重點(diǎn)。

為解決體外DILI預(yù)測(cè)結(jié)果 的準(zhǔn)確性，更加整體和復(fù)雜的細(xì)胞模型被越來越多地開發(fā)和使用，如hiPSC分化的肝細(xì)胞、三維培養(yǎng)的肝細(xì)胞、與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的肝細(xì)胞以及在流體系統(tǒng)中培養(yǎng)的肝細(xì)胞等，這些新的細(xì)胞模型結(jié)合HCS技術(shù)預(yù)測(cè)肝毒性已有報(bào)道，也需要在HCS中得到進(jìn)一步的研究，以解決更加復(fù)雜的機(jī)制問題。此外，鑒于DILI機(jī)制的復(fù)雜性以及體外預(yù)測(cè)與臨床結(jié)果 的差異，任何技術(shù)都無法對(duì)所有的機(jī)制實(shí)現(xiàn)全面預(yù)測(cè)。尤其是涉及非細(xì)胞毒性相關(guān)的肝損傷，如膽管消失綜合征、血竇阻塞綜合征和免疫介導(dǎo)的DILI事件，目前還無法輕易借助于細(xì)胞基礎(chǔ)的HCS技術(shù)預(yù)測(cè)。

隨著檢測(cè)技術(shù)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法的發(fā)展，可以預(yù)測(cè)可視化、多參數(shù)篩選方法將繼續(xù)推進(jìn)對(duì)細(xì)胞生命過程的系統(tǒng)化了解。期待未來HCS得到產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用，從而成為藥物開發(fā)的強(qiáng)大工具和平臺(tái)。

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High-content screening in studies of toxicology and its application in drug-induced hepatotoxicity

GE Shuai,TANG Na-ping,FU Li-jie,MA Jing
(National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation and Research,China State Institute of Pharmaceutical Industry,Shanghai 201203,China)

Drug-induced liver injury(DILI)is one of the major causes of termination of drug development.The establishment of a high-throughput test system to predict potential clinical hepatotoxicity is a valuable approach in the pharmaceutical industry.The high-content imaging-based in vitro assays allow simultaneous detection of cellular multiple parameters in the system.The real-time monitoring of multiple signaling pathways can shed light on many mechanisms of cell injury,with high sensitivity and specificity. Many types of liver cell models have been applied to high-content screening(HCS)so far.This paper introduceds the HCS technology and reviews the data of hepatotoxicity obtained from HCS technology in recent years.At the same time,we discuss the application of this technology in exploring the mechanism of hepatotoxicity and the potential of HCS technology in studying DILI and mechanisms.

high-content screening;hepatotoxicity;toxicology

The project supported by Special Grant from Advanced Programs of National Science and Technology Major Project of China(2015ZX09501004-002-006);and Advanced Programs of National Science and Technology Major Project of China(2015ZX09501-007-003)

MA Jing,Tel:(021)50801763,E-mail:jma@ncdser.com

R99

A

1000-3002-（2017）06-0689-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.028

2017-01-13接受日期：2017-03-27）

（本文編輯：賀云霞）

國家科技部重大專項(xiàng)定向擇優(yōu)項(xiàng)目（2015ZX-09501004-002-006）；國家科技部重大專項(xiàng)定向擇優(yōu)項(xiàng)目（2015ZX09501-007-003）

葛帥，女，碩士研究生，主要從事肝臟毒理學(xué)研究，Tel：13122365965，E-mail：geshuai2013@163.com；馬璟，女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事毒理學(xué)研究。

馬璟，Tel：（021）50801763，E-mail：jma@ncdser.com