雄激素對雌激素引發(fā)去勢雄性SD大鼠前列腺炎癥及炎癥因子的抑制作用

賈玉玲，崇立明，李雷，馬愛翠，陳穎，周莉，孫祖越

（1.上海市計劃生育科學研究所藥理毒理學研究室，中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理學檢測中心，上海200032；2.國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室，上海200032）

雄激素對雌激素引發(fā)去勢雄性SD大鼠前列腺炎癥及炎癥因子的抑制作用

賈玉玲1，2，崇立明1，2，李雷1，2，馬愛翠1，2，陳穎1，2，周莉1，2，孫祖越1，2

（1.上海市計劃生育科學研究所藥理毒理學研究室，中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理學檢測中心，上海200032；2.國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室，上海200032）

目的 給予不同比例苯甲酸雌二醇（E2）和丙酸睪酮（T）誘導SD大鼠前列腺炎，探討炎癥因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、環(huán)氧合酶2（COX-2）和巨噬細胞炎癥蛋白1α（MIP-1α）表達的變化。方法SD大鼠無菌條件下去勢后，頸背部分別sc給予E20.25 mg·kg-1+T 0.25，0.5和1.0 mg·kg-1，連續(xù)給藥30 d。取血離心取血清，采用ELISA檢測E2，T和雙氫睪酮（DHT）激素水平。HE染色觀察前列腺組織病理變化，免疫組化檢測前列腺中TNF-α，COX-2和MIP-1α的表達。結(jié)果 ELISA檢測結(jié)果 顯示，與假手術(shù)組比較，E20.25 mg·kg-1組血清E2水平明顯升高〔（80±7）ng·L-1，P＜0.01〕；E20.25 mg·kg-1組和E2+T 0.25 mg·kg-1組血清T水平顯著下降〔111±6和（111±5）nmol·L-1，P＜0.05〕。與去勢對照組相比，E20.25 mg·kg-1組血清E2明顯升高〔（80±7）ng·L-1，P＜0.01〕，其他各指標未見統(tǒng)計學差異。光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組和去勢對照組前列腺組織結(jié)構(gòu)完整、腺腔和間充質(zhì)無炎癥細胞浸潤；E20.25 mg·kg-1組前列腺腺腔內(nèi)有少量炎癥細胞浸潤，間充質(zhì)未見炎癥細胞浸潤；E2+T 3個劑量組間充質(zhì)內(nèi)有少量炎癥細胞浸潤。假手術(shù)組前列腺上皮細胞及前列腺基質(zhì)細胞胞漿內(nèi)TNF-α，COX-2和MIP-1α均為陰性表達或極少量表達，去勢對照組和E20.25 mg·kg-1組TNF-α，COX-2和MIP-1α均為強陽性表達，E2+T 3個劑量組TNF-α，COX-2和MIP-1α呈弱陽性表達。結(jié)論雄激素具有抑制雌激素引起的去勢SD大鼠前列腺炎及炎癥因子TNF-α，COX-2和MIP-1α表達的作用。

前列腺炎；雌激素；雄激素

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.011

前列腺炎是臨床泌尿系統(tǒng)常見疾病，慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛綜合征（chronic prostatitis/ chronic pelvic pain syndrome，CP/CPPS）出現(xiàn)的癥狀可能與機體多種功能變化的相互作用相關(guān)，包括心理因素改變、免疫功能降低和神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)，其確切的發(fā)病機制尚不明確。研究制備良好的動物模型是闡明前列腺炎發(fā)病機制和開發(fā)新藥的有效方法。目前，所用的動物模型主要有免疫誘導［1］、激素誘導［2］、化學制劑誘導［3］、生物制劑誘導、尿液逆流誘導和自發(fā)性炎癥模型等。而激素誘導主要以雌激素或植物激素誘導為主。關(guān)于雌激素與前列腺炎關(guān)系的研究報道較多，但雄激素究竟如何在CP/CPPS發(fā)病中發(fā)揮作用仍不是很清楚。在大鼠模型建立過程中發(fā)現(xiàn)，去勢或雄激素水平下降能夠引起前列腺炎［4］；給予略高于生理劑量的睪酮（testosterone，T）能降低雌二醇（estradiol，E2）誘導的炎癥發(fā)生率并且能減輕炎癥程度［5-6］。有報道，環(huán)境污染和工業(yè)化學物質(zhì)可能會通過改變性腺中性激素水平影響前列腺的生長發(fā)育［7-9］。同時與年齡相關(guān)的雄激素與雌激素比值的下降被認為是CP發(fā)展的重要因素。隨著年齡增長，當雄激素水平下降、雌激素水平維持不變或升高時，激素平衡被打破，從而誘導前列腺炎癥［10-12］。本研究基于上述理論，采用雌激素誘發(fā)去勢雄性SD大鼠前列腺炎，探索雄激素對前列腺炎癥及炎癥因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

48只清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量310～380 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供（SCXK［滬］2008-0016）。SD大鼠在上海市計劃生育科學研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理學檢測中心）清潔級動物房內(nèi)飼養(yǎng)（SYXK［滬］2008-0027）。室溫20～26℃，相對濕度40%～70%，光照12 h，黑暗12 h；塑料籠大小為400 mm× 350 mm×200 mm，每籠4只，自由飲水和攝食。

1.2 主要試劑

苯甲酸E2（蘇州諾德派森醫(yī)藥科技有限公司）；丙酸T注射液（上海通用藥業(yè)股份有公司）；一抗：兔抗大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、兔抗大鼠環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）和兔抗大鼠巨噬細胞炎癥蛋白1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）（武漢博士德生物工程有限公司）；兔超敏二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；雌二醇、睪酮和雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）檢測試劑盒（上海滬峰化工有限公司）。

48只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按體質(zhì)量隨機分為6組，每組8只。分為假手術(shù)組、去勢對照組和4個不同雌雄激素比例組，即E20.25 mg·kg-1分別與T 0，0.25，0.5和1.0 mg·kg-1劑量配伍；除假手術(shù)組未去勢外，其他各組均去勢。3%戊巴比妥鈉麻醉，無菌條件下取腹正中切口，直達腹腔，輕輕拉動睪丸脂肪，暴露睪丸和附睪，自輸精管處結(jié)扎，完整地切除雙側(cè)睪丸和附睪，依次縫合肌肉和皮膚，放回鼠籠，自由飲食；恢復觀察5 d，在頸背部進行皮下注射。去勢對照組注射橄欖油，每天sc給予1次，給藥30 d。每周測定大鼠體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥劑量。

3%戊巴比妥鈉麻醉后采集自凝血制備血清，對前列腺進行觀察、取材并稱重，10%甲醛固定，組織經(jīng)脫水處理后，石蠟包埋，4～6 μm連續(xù)切片，HE染色，中性樹膠封片。

1.4 ELlSA法檢測血清E2，T和DHT的含量

設(shè)置空白孔、標準孔、待測樣品孔。標準品準確加樣50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測血清10 μL。置37℃溫育30 min。棄液體，洗板機洗滌5次。每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外。置37℃溫育30 min。棄液體，洗板機洗滌5次。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。用酶標儀進行測定，450 nm波長下，依序測量各孔的吸光度（A450nm值）。繪制標準曲線，根據(jù)各樣本A450nm在標準曲線上查得相應(yīng)的濃度。

1.5 免疫組化法檢測前列腺組織中TNF-α，COX-2和MlP-1α的表達

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。滴加3%H2O2，室溫下5～10 min滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液0.01 mol·L-1（pH 6.0）進行熱修復。冷卻到室溫后PBS（pH 7.2～7.6）洗滌2次。滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體。分別滴加一抗兔抗大鼠TNF-α，COX-2和MIP-1α（1∶150），4℃過夜。滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG多抗，室溫下30 min。PBS（pH 7.2～7.6）洗2 min，3次。滴加試劑SABC，室溫20 min。PBS（pH 7.2～7.6）洗5 min，4次。室溫滴加DAB顯色，當出現(xiàn)淺棕色時用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木素復染，分化，脫水、透明后用中性樹膠封片。

采用Image-Pro Plus 6.0軟件的圖像分析系統(tǒng)檢測分析各組切片，所有切片均在40×10視野下隨機選取5個視野，分別測量積分吸光度（integrated absorbance，IA），計算平均IA，表示TNF-α，COX-2和MIP-1α蛋白相對表達水平。根據(jù)免疫組織化學的顯色不同將TNF-α，COX-2和MIP-1α的染色表達分為陰性、弱陽性和強陽性。

課程的考核方式突出能力本位。側(cè)重于學習態(tài)度、作業(yè)完成情況、綜合應(yīng)用所學課程知識的能力，注重學生綜合職業(yè)素質(zhì)的培養(yǎng)。表1“汽車裝飾與美容”課程教學評價體系展示的是學生整體考核的權(quán)重分布情況。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 雄激素對雌激素引發(fā)去勢雄性前列腺炎大鼠體質(zhì)量及一般狀況的影響

適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，SD大鼠一般狀況良好，外觀體征、行為活動均未見明顯異常。攝食、飲水和大小便均正常；手術(shù)后，各組大鼠一般狀況良好，外觀體征、行為活動均未見明顯異常；手術(shù)局部未見明顯紅腫和潰破；攝食、飲水和大小便均正常。

假手術(shù)組和去勢對照組大鼠體質(zhì)量隨時間延長逐漸升高，而給予激素各組大鼠的體質(zhì)量隨時間延長逐漸降低，在第22～第29天體質(zhì)量變化不大，趨于穩(wěn)定（圖1）。

2.2 雄激素對雌激素引發(fā)去勢雄性前列腺炎大鼠血清中E2，T和DHT含量的影響

表1結(jié)果 顯示，與假手術(shù)組比較，去勢對照組血清E2，T和DHT水平均無顯著差異；E20.25 mg·kg-1組E2水平明顯升高（P＜0.01），E20.25 mg·kg-1和E2+T 0.25 mg·kg-1組T水平顯著下降（P＜0.05）。與去勢對照組相比，E20.25 mg·kg-1組E2水平明顯升高（P＜0.01），其余指標各組間無顯著變化。

2.3 雄激素對雌激素引發(fā)去勢雄性大鼠前列腺炎癥變化的影響

Fig.1 Effect of testosterone（T）on body mass of castrated male rats with prostatitis initiated by estrogen（E2）.Rats were injected subcutaneously with E20.25 mg·kg-1or E20.25 mg·kg-1+T 0.25，0.50 and 1.0 mg·kg-1，respectively for 30 d.x±s，n=8.

Tab.1 Effect of T on serum E2，T and dihydrotestosterone（DHT）concentration of castrated male rats with prostatitis initiated by E2

光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)（圖2），各劑量組前列腺組織未見明顯差異。假手術(shù)組和去勢對照組前列腺組織結(jié)構(gòu)完整、腺腔和間充質(zhì)無炎癥細胞浸潤，無充血和水腫；E2組（5/8只）前列腺分別有不同程度的萎縮，腺腔內(nèi)有少量炎癥細胞浸潤，間充質(zhì)未見炎癥細胞浸潤；E2+T 0.25 mg·kg-1（4/8只）、E2+T 0.5 mg·kg-1（2/8只）和E2+T 1.0 mg·kg-1（2/8只）組間充質(zhì)內(nèi)有少量炎癥細胞浸潤，腺腔未見炎癥細胞浸潤，且出現(xiàn)少數(shù)上皮輕度扁平化，腺腔大小隨著雄激素的增加而增大。

Fig.2 Effect of T on prostate tissue of castrated male rats with prostatitis initiated by E2（HE staining）.See Fig.1 for the treatment.Arrows show severe atrophy and inflammatory cells.

2.4 雄激素對雌激素引發(fā)去勢雄性前列腺炎大鼠前列腺組織中TNF-α ，COX-2和MlP-1α 表達的影響

表2結(jié)果 顯示，與假手術(shù)組相比，去勢對照組和E20.25 mg·kg-1組TNF-α，COX-2和MIP-1α表達量明顯增高（P＜0.01和P＜0.05），E2+T 1.0 mg·kg-1組TNF-α和COX-2表達量有所下降（P＜0.05），其他各劑量組TNF-α，COX-2和MIP-1α表達沒有顯著性差異。與去勢對照組相比，E20.25 mg·kg-1組TNF-α表達量明顯增高（P＜0.01），E2+T各劑量組TNF-α，COX-2和MIP-1α表達明顯降低（P＜0.01）。

Tab.2 Effect of T combination E2on expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α ），cyclooxygenase-2（COX-2）and macrophage inflammatory protein-1α （MlP-1α ）in prostate tissue of castrated male rats with prostatitis initiated by E2

圖3顯示，假手術(shù)組TNF-α，COX-2和MIP-1α均為陰性或極少量表達，去勢對照組和E20.25組TNF-α、COX-2和MIP-1α均為強陽性表達，所有E2+T組前列腺上皮細胞及前列腺基質(zhì)細胞胞漿內(nèi)TNF-α，COX-2和MIP-1α呈弱陽性表達。

Fig.3 Effect of T on expression of TNF-α，COX-2 and MlP-1αin prostate tissue of castrated male rats with prostatitis initiated by E2（immunostaining×400）.See Fig.1 for the treatment.Arrows show positive expression.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，單獨E2可以誘導SD大鼠前列腺腺腔炎細胞浸潤，與T配伍組均可見間充質(zhì)或血管周炎癥，未見腺腔內(nèi)有炎細胞。高劑量的T會促進前列腺的生長并抑制前列腺炎癥。Yatkin等［13］在探索雌雄激素比例對大鼠前列腺炎癥和上皮細胞的影響時也發(fā)現(xiàn)，在正常或高于正常水平的T和DHT會刺激精囊腺生長，并且雄激素具有抑制前列腺炎癥的作用。在E2升高的情況下，上皮細胞對E2的反應(yīng)可能取決于雄激素對附屬性腺刺激的強度。

給予激素后，各組大鼠的體質(zhì)量出現(xiàn)明顯的下降趨勢，去勢后給予雌雄激素比例過高，可能抑制了雄激素促生長作用，進而導致動物體質(zhì)量降低。而與前列腺炎的關(guān)系尚待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，E20.25 mg·kg-1組E2水平明顯升高，說明雌激素的作用引起大鼠體內(nèi)激素失衡。E20.25 mg·kg-1組和E2+T 0.25 mg·kg-1組T水平顯著下降。由于給予去勢手術(shù)后，T來源被阻斷，而外源給予的T尚未達到體內(nèi)正常水平。E20.25 mg·kg-1組E2明顯高于去勢對照組，是外源雌激素作用的結(jié)果 。

本研究發(fā)現(xiàn)，去勢對照組和E20.25 mg·kg-1組中檢測到前列腺上皮、間充質(zhì)細胞胞漿內(nèi)有大量棕褐色TNF-α，COX-2和MIP-1α表達的顆粒，呈強陽性表達。Sugimoto等［14］也發(fā)現(xiàn)，sc給予17β-E2的雄性Wistar大鼠前列腺TNF-α升高，前列腺和尿液中的炎癥趨化因子MIP-1α升高。在E2+T組中，隨著T劑量的增加，TNF-α，COX-2和MIP-1α表達量大大減少，僅可見少量弱棕黃色細顆粒，呈弱陽性表達。在給予雄激素后，大鼠血液中的雄激素水平有恢復但仍未達到去勢組的水平，而前列腺組織中的炎癥因子水平較去勢對照組卻顯著下降。這一現(xiàn)象可解釋為在給予雄激素后，在E2+T 0.5和1.0 mg·kg-1兩組中大鼠血液中的雄激素水平與假手術(shù)組和去勢對照組相比沒有統(tǒng)計學差異，可認為屬于正常水平波動。前列腺組織中的炎癥因子水平較去勢對照組卻顯著下降，是因為給予雄激素后炎癥得到緩解。性激素與前列腺炎的關(guān)系可解釋為T抗炎作用的弱化，E2促炎影響加強［15］。體內(nèi)雌激素水平增高、雄激素水平降低的改變可能與大鼠CP/CPPS的發(fā)病過程相關(guān)聯(lián)。這種因性激素水平發(fā)生變化誘發(fā)的CP/CPPS在通過額外給予雄激素后發(fā)現(xiàn)了炎癥明顯的好轉(zhuǎn)，其作用機制在本研究中雖無法進行確切闡述，但可見其可能具有抑制TNF-α，COX-2和MIP-1α表達的作用，這為臨床治療CP/ CPPS提供了一種新的策略。

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lnhibitory effect of testosterone on prostatitis and inflammatory factors of castrated male SD rats initiated by estrogen

JIA Yu-ling1,2,CHONG Li-ming1,2,LI Lei1,2,MA Ai-cui1,2,CHEN Ying1,2,ZHOU Li1,2,SUN Zu-yue1,2
(1.Shanghai Institute of Planned Parenthood Research&National Evaluation Centre for Toxicology of Fertility Regulating Drugs,Shanghai 200032,China;2.National Population and Family Planning Key Laboratory of Contraceptives,Shanghai 200032,China)

OBJECTlVETo study the changes in inflammatory factors caused by prostatitis.METHODSSD rats were castrated under sterile conditions.E20.25 mg·kg-1+T 0.25,0.5 and 1.0 mg·kg-1were givensc for 30 d,respectively.Serum samples were taken and levels of E2,T and dihydrotestosterone(DHT) were detected by ELISA.Pathological changes of prostate tissue were observed by HE staining.The expressions of tumor necrosis factor-alpha(TNF-α),cyclooxygenase-2(COX-2)and macrophage inflammatory protein 1alpha(MIP-1α)in prostate were detected by immunohistochemistry.RESULTSELISA detection showed that E2levels were significantly increased〔(80±7)ng·L-1,P＜0.01〕in E20.25 mg·kg-1group and that T levels were significantly decreased〔111±6 vs(111±5)nmol·L-1,P＜0.05〕in E20.25 mg·kg-1and E2+T 0.25 mg·kg-1groups compared with the sham-operated group.E2was significantly increased〔(80±7)ng·L-1,P＜0.01〕in E20.25 mg·kg-1groups compared with the castrated control.The sham and castrated control showed normal glandular epithelium without leukocyte infiltration. In E20.25 mg·kg-1group,extensive infiltration of inflammatory cells was found in the glandular lumens, suggesting the occurrence of chronic prostatitis.In each E2+T groups,fewer inflammatory cells were noted in the stroma around glands.The expressions of TNF-α,COX-2 and MIP-1α in sham group were negative or low,while those of castrated control and E20.25 mg·kg-1groups were high,especially in E20.25 mg·kg-1group.The expressions of TNF-α,COX-2 and MIP-1α in each E2+T group were significantly decreased.CONCLUSlONTestosterone can inhibit prostatitis and the expression of inflammatory factors,such as TNF-α,COX-2 and MIP-1α,in castrated SD rats initiated by estrogen.

prostatitis;estrogen;testosterone

The project supported by Shanghai Research and Development Platform(15DZ2290400);and Shanghai"Innovative Action Plan"Experimental Animal Study(14140901302)

ZHOU Li,E-mail:zhoulijss@163.com;SUN Zu-yue,E-mail:sunzy64@163.com

R977.1+2

A

1000-3002-（2017）06-0568-06

2016-11-22接受日期：2017-03-29）

（本文編輯：喬虹）

上海市研發(fā)平臺專項（15DZ2290400）；上海市“科技創(chuàng)新行動計劃”實驗動物研究項目（14140901302）

賈玉玲，女，碩士，研究實習員，主要從事前列腺炎藥理毒理學研究和新藥臨床前安全性評價。

周莉，E-mail：zhoulijss@163.com；孫祖越，E-mail：sunzy64@163.com